粗蛋白影響因素

1、1粗蛋白的測定：試劑的配制粗蛋白測定中所用的化學藥品如濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸 鉀（硫酸鈉）、硫酸錢、蔗糖等均為化學純試劑，標定鹽酸標準溶液用的無水碳 酸鈉為基準試劑。在配制試劑前一定要用 pH試紙或酸度計檢測一下蒸儲水是 否為中性，所用的燒杯、試劑瓶等配液設(shè)備清洗干凈。1.1 鹽酸標準溶液的配制配制的鹽酸標準溶液盡量為低濃度，一般C（HCl）=0.020.05mol ? L -1。低濃度雖然用量大，但可減少操作誤差和讀數(shù)誤差。配制鹽酸標準溶液一定要嚴格 按照標準操作進行，基準無水碳酸鈉已定于 270300c灼燒至恒重，稱準至 0.0001g,做46個平行樣，去掉最高值和最低

2、值后取平均值，同時還要做 空白試驗。鹽酸標準溶液的配制量盡量不要太多、使用時間太長，防止水分蒸發(fā)和鹽酸揮發(fā)而影響其濃度的準確性。1.2 其他試劑的配制400g ? L -1氫氧化鈉溶液、20g ? L -1硼酸溶液、混合指示劑（1g ?L -1甲基 紅乙醇溶液與5g ? L -1澳甲酚綠乙醇溶液等體積混合）等主要是在稱量時要 做到快、準、穩(wěn)，再就是防止使用時間太長，特別是混合指示劑不要超過3個月。2粗蛋白的測定：試樣的選取和制備2.1 采樣飼料原料及產(chǎn)品的容積和質(zhì)量往往很大， 因此所采集的樣品必須具有代表性，否 則，即使一系列的分析工作非常精密、準確，其意義都不大，有時甚至會得出錯 誤的結(jié)論，

3、所以應采用正確的采樣方法。采樣應從具不同代表性的區(qū)域取幾個樣 點，然后充分混合為整個飼料的代表樣品， 然后再從中分出一小部分作為分析樣 品。在采樣過程中應做到隨即、客觀，避免受人為和主觀因素的影響。還有一點 應該注意，就是所采集的樣品必須具有一定數(shù)量。 其采集數(shù)量的多少應視飼料原 料和產(chǎn)品水分含量、顆粒大小、均勻程度以及平行樣的數(shù)量而酌情定奪。2.2 分樣所采集的樣品往往較多，而檢測時所用試樣往往較少，因此要對所采集的樣品進 行縮分。在多數(shù)飼料公司以及檢測機構(gòu)中一般采用方便簡單的四分法。 有條件的 單位可采用分樣器進行分樣。2.3 粉樣 飼料的樣品一般為顆粒狀，所以要對所分得的試樣進行粉碎。粉

4、碎所用的設(shè)備一 般為咖啡磨或植物樣本粉碎機，試樣粉碎后一般過 40目篩，且一定要把粉碎后 的試樣及粉碎機中殘留的部分清掃后充分混合均勻，避免粉碎的試樣分級而影響 分析結(jié)果的準確性。對于一些不易粉碎的粗飼料如秸稈渣等在粉碎機中會剩留極 少難以通過篩孔，這部分一定不要丟掉，應盡力弄碎后一并均勻混入樣品中， 避 免引起分析誤差。2.4 稱樣試樣的用量標準中規(guī)定為0.51g ,為保證分析結(jié)果的準確性，在分析過程中 應根據(jù)試樣蛋白質(zhì)含量的高低來決定所稱試樣的重量，如濃縮料、魚粉、玉米蛋白粉、豆粕等高蛋白的試樣可控制在 0.51g之間，玉米、秸稈、苜蓿等低蛋 白、粗飼料試樣可適當增加到23g左右，以增加測

5、定結(jié)果的準確性。還應注 意一點，在稱量時盡量用電子分析天平，準確到 0.0001g且無損地放入凱氏燒 瓶或者消化管中。3粗蛋白的測定：消化3.1 催化劑及其用量在環(huán)境污染小、價格便宜、催化效果好的前提下，目前催化劑多為硫酸銅和無水 硫酸鉀（或無水硫酸鈉）。其添加量不同公司差異較大，其中硫酸銅：無水硫酸 鉀（或無水硫酸鈉）主要有1 ： 9、1 ： 10、1 ： 15和1 ： 17等，國標為0.4g硫 酸銅和6g無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉），比例為1 ： 12。若添加量加大，消化液 易結(jié)塊不易轉(zhuǎn)移；添加量減少，消化時間加長或者消化不完全。 建議大家按國標 執(zhí)行為好。亦可根據(jù)自己的經(jīng)驗以及試樣的多少、

6、消化的難易程度、蛋白含量的多少自行調(diào)整。3.2 硫酸的用量 濃硫酸的用量應視試樣的重量、含水量及其所含蛋白高低而適當調(diào)整。 對于體積 大重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或者含水量較高的試樣、 淀粉含量多的精料，應 適當加大濃硫酸的用量，多為15mL左右。這是由于此類樣品，濃硫酸在對其脫 水和碳化是消耗量加大，當加入的濃硫酸量不足或者剛剛夠試樣脫水和碳化時就 會出現(xiàn)燒干現(xiàn)象。反之則需加入10mL左右。若通風柜的排風量較大時應適當多 加濃硫酸2mL左右，以防止?jié)饬蛩岬恼舭l(fā)而使其濃度降低，試樣消化不完全從 而導致所測得的數(shù)值偏低。3.3 消化溫度剛開始時以低溫（200300C ）加熱，待試樣焦化泡沫消失后

7、，逐步緩慢提高 溫度（360410c ）。起初低溫加熱是為防止試樣起泡沫，而溢出燒瓶外或碳化 后的顆粒粘附于燒瓶壁，導致消化不完全，所測結(jié)果偏低。對于富含脂肪或者在 消化過程中易發(fā)泡的樣品，可在消化前滴加少量消泡劑，如辛醇、液體石蠟等。3.4 消化時間消化時間也是許多文獻一直在探討的問題，也有許多快速消化法的研究。具消化時間的標準為消化呈透明藍綠色后，再加熱消化15min。根據(jù)蘇軍等研究表明，消化液澄清后再繼續(xù)消化30min為宜。此試驗只是針對于蛋白含量低于蠶蛹的 樣品，而對于蛋白含量高于蠶蛹的樣品，如進口魚粉、血粉、羽毛粉等并未進行 試驗性研究。因此我個人認為，可根據(jù)試樣的重量、蛋白含量的多

8、少以及消化的 難易程度而適當調(diào)整消化液澄清后的消化時間。對于所稱試樣質(zhì)量較多、蛋白含量高于蠶蛹或者難消化的試樣，消化液澄清后繼續(xù)消化的時間可控制在45m in2h不等，具體時間化驗工作者可根據(jù)自己的工作經(jīng)驗而自行定奪。3.5 消化液的轉(zhuǎn)移及定容消化結(jié)束后，把凱氏燒瓶從電爐上取下，放在小鐵筐內(nèi)冷卻。此時一定要注意安 全，帶稍厚手套防止燙傷。冷卻至室溫后加入蒸儲水1020m L,在等冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100m L容量瓶內(nèi)。再轉(zhuǎn)移是為減少損失誤差，應在容量瓶口上加 上漏斗，且要用少量蒸儲水多次洗滌燒瓶和漏斗 （即采用少量多次原則），否則 會因偶然誤差而導致測定結(jié)果偏低。轉(zhuǎn)移完成后不要立即定容，應冷卻

9、至室溫后 再定容。若未冷卻而定容，待冷卻后，體積縮小，從而使吸取的試樣分解液的量 偏大，測定結(jié)果將偏高。若消化完畢冷卻后，消化液不能當天定容需隔夜保存時， 應先將凱氏燒瓶內(nèi)加入少量的蒸儲水， 防止消化液結(jié)晶，再把凱氏燒瓶口用塑料 布包好，防止吸收空氣中的氨而影響結(jié)果的準確性。消化液若結(jié)晶不易轉(zhuǎn)移時， 可將凱氏燒瓶放在電爐上加熱一下，待結(jié)晶融化后再轉(zhuǎn)移。4粗蛋白的測定：蒸儲4.1 蒸汽發(fā)生器內(nèi)水的體積及酸堿性蒸汽發(fā)生器內(nèi)的水的體積應控制在其容積的 2/3左右，并控制液面高度。水的 體積過大易在沸騰后從蒸汽發(fā)生器中玻璃管中溢出燙傷工作人員；過少易產(chǎn)生的氣體壓力不足或蒸干蒸汽發(fā)生器發(fā)生事故。水加入的

10、同時一同加入幾滴硫酸和幾 滴混合指示劑，且保持水一直呈紫紅色，以防止水中含有氨態(tài)的氮溢出而影響測 定值。4.2 蒸儲裝置的氣密性在蒸儲操作開始前一定要檢查一下蒸儲裝置的氣密性。各導管的接口及用久的橡 皮管應重點檢查。添加消化液和堿液的玻杯口要擰緊、 液封，防止產(chǎn)生的氨氣逸 出。在檢查氣密性的同時還應打開冷凝水開關(guān)且要保持一定的流速， 否則冷卻不 完全。這是很容易忽視的問題，特別是初學者。4.3 試樣分解液的移取要準確 在移取試樣分解液前先把容量瓶搖勻，把10mL移液管用所要取的試樣分解液潤洗23次后，再進行移取。移取時移液管應垂直于地面，視線與移液管刻度 線平行。吸取完試樣液后把移液管放到反應

11、室內(nèi)自然流入反應室， 切忌把移液管 放到小玻杯內(nèi)及用吸耳球吹移液管。 最后再用少量蒸儲水沖洗一下小玻杯， 并把棒狀玻塞塞緊。4.4 氫氧化鈉溶液的加入量在蒸儲過程中，反應室內(nèi)溶液應保持堿性，堿的加入量一般為 10m L左右，若 在消化時所加入的硫酸偏多，40%氫氧化鈉溶液的量也要隨之增加，這樣才能保 證除用于和硫酸及硫酸銅反應外，還有足以使氨根轉(zhuǎn)化為氨的堿量。加入的堿先 放入小玻杯內(nèi)，慢慢轉(zhuǎn)動棒狀玻塞，使堿緩慢流到反應室內(nèi)，然后再將小玻杯內(nèi) 加入蒸儲水液封，切忌把棒狀玻塞提起加堿一特別是初學者， 這樣會造成反應后 生成的氨從?？谝莩?，導致所測蛋白含量偏低。4.5 蒸儲速度與氣流 蒸儲時產(chǎn)生的氣

12、流一定要均勻，切忌熱力不穩(wěn)、中途中斷或蒸汽不足，否則反應 室內(nèi)溫度會降低，易產(chǎn)生倒吸；氣流過快硼酸吸收不完全。蒸儲的速度除與氣流 有關(guān)外還與冷卻水的流速及電路的溫度有關(guān)。蒸儲速度快，反應液易被蒸汽帶出 而使測定結(jié)果偏高；蒸儲速度慢，氨沒有被完全蒸儲出來而結(jié)果偏低。 那么以什 么樣的蒸儲速度為宜呢？據(jù)賈艷玲和冷柏忠(2000)實踐證明：蒸儲速度一般應 控制在每分鐘蒸儲出液體在57mL之間。4.6 蒸儲時間蒸儲時間多為5m i n ,加入試樣分解液及氫氧化鈉后蒸儲 4m i n ,使冷凝管末 端離開硼酸液面后再蒸儲1m i n。但是標準中并未規(guī)定從何時開始計時，據(jù)謝 文飛(2003)的試驗證明，在

13、蒸儲完4mi n鐘后再多蒸儲12mi n對結(jié)果沒 有什么影響，所以可以從硼酸剛剛出現(xiàn)綠色時開始計時蒸儲4min(硼酸出現(xiàn)綠色說明反映已經(jīng)開始)。最終在4min后是否蒸儲完全可用pH試紙進行檢測。在 蒸儲時還應注意硼酸的吸收溫度。 硼酸是極弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注 意硼酸吸收液溫度不應超過40C,否則氨的吸收減弱導致結(jié)果偏低。4.7 反應室的冷卻與洗滌 首先在蒸儲完畢，將冷凝管末端用蒸儲水沖洗后，再將錐形瓶移開進行滴定。清 洗反應室時嚴禁將蒸儲瓶兩側(cè)的閥門同時關(guān)閉， 以免發(fā)生爆炸。反應室清洗一定 要徹底，一是防止殘留液影響下次測定結(jié)果的正確性； 二是給反應室降溫。如果 反應室溫度很高，再

14、加之加入的氫氧化鈉與硫酸反應放出的大量熱， 易產(chǎn)生爆沸， 將反應液沖入冷凝管，造成實驗失敗。另外反應室溫度高，反應劇烈，有部分氨 硼酸吸收不完全而逸出，測得的結(jié)果將偏低。一般反應室溫度降至不燙手即可。4.8 錐形瓶的預處理 錐形瓶往往用洗衣粉洗滌，再用自來水、蒸儲水沖洗。洗衣粉不易徹底沖洗干凈， 導致錐形瓶內(nèi)壁環(huán)境偏于堿性；另外各地自來水的 p H不同，所制的蒸儲水p H有時也會偏離中性，這樣都會導致測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。建議把錐形瓶進行預處理 后再使用，其方法為：沖洗干凈的錐形瓶加入20mL蒸儲水、2滴混合指示劑，再用0.02mol ?L -1的鹽酸溶液或者0.02m o l ? L -1的氫氧

15、化鈉溶液滴定至 剛好由藍色變?yōu)榛壹t色，然后倒掉該液體后，再加硼酸吸收液2535m L和混合指示劑23滴。若加入指示劑后硼酸為藍色，則說明硼酸中混入堿性物 質(zhì)或蒸儲水偏堿性，需重新配制硼酸溶液。錐形瓶的預處理雖然比較繁瑣，但是 可減少由于錐形瓶本身環(huán)境的pH偏離中性對測定結(jié)果的影響。4.9 滴定 滴定是整個實驗過程的最后一步，至關(guān)重要，否則整個實驗將前功盡棄。滴定前 把鹽酸標液瓶搖勻后，把酸式滴定管潤洗 23次后加入鹽酸標液排除氣泡， 記下刻度值，開始滴定。滴定時一定要控制好滴定速度， 待接收液由淺綠色逐漸 變成無色時要放慢滴定速度，逐滴加入鹽酸標液，接收液變成淺紅色時為滴定終 點，切勿滴過量。

16、5粗蛋白的測定：空白測定5.1 試劑空白測定另取凱氏燒瓶或者消化管一個，加入硫酸銅、無水硫酸鉀 （或無水硫酸鈉）、濃 硫酸，其中每個藥品的加入量與試樣消化時的加入量相同， 加熱消化至溶液呈透 明的藍綠色。其后的操作步驟完全相同。這樣可以校正試劑不純所發(fā)生的誤差。5.2 試樣空白測定 稱取0.5g分析純蔗糖代替試樣，以后各種試劑的用量及操作步驟完全相同。其 標準為，空白測定消耗0.1m o l ? L -1鹽酸標液體積不超過0.2mL;消耗0.02mol ?L-1鹽酸標液體積不超過0.3mL。以上兩個空白測定并不需要每次都要做，隔 一段時間操作一次即可，但是在更換藥品試劑、標準溶液時一定要做空白實驗測 定。若空白值超標，一般是由于所用試劑級別不夠或不純、蒸儲水不純、玻璃器 皿清洗不干凈等原因造成。6粗蛋白的測定：蒸儲裝置及操作準確性檢測在進行樣品檢測的同時，精確稱取 0.2000g分析純的硫酸錢代替試樣，直接定 容100m L后進行蒸儲、滴定，測得硫酸錢含氮量為21.19% 0.2%,以校正蒸儲裝置的氣密性和加堿、蒸儲和滴定各步驟是否正確。7粗蛋白的測定：計算時換算系數(shù)的處理我們在計算蛋白含量時多乘以平均系數(shù) 6.25 ,對于粗蛋白質(zhì)中含氮量尚未確定 的可以乘以平均系數(shù)，對于已經(jīng)確定的則不妥，以豆粕