一些固定液及方法介紹

1、 一些固定液及方法介紹 前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此，簡要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3） 試劑：多聚甲醛 40g 0.1mol/L 磷酸緩沖液至 1000ml 配制方法：稱取 40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入 500800ml0.1mol/L磷酸緩沖液（PhosphateBuffer 以下簡稱 PB）,加熱至 60c左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許 1NNaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足 0.1mol/L 的 PB于 1000ml,

2、充分混勻。 該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定 224h。另外, 該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉 試劑：A液：多聚甲醛 40g 蒸播水 400ml B 液：Na2HPO4?2H2O16.88g 蒸播水 300ml C 液：NaOH3.86g 蒸播水 200m 配制方法：A液最好在 500ml的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和 C液配制好后，將 B液倒入 C 液中,混合后再加入 A液，以 1NNaOH 或 1NHCl

3、將 pH調(diào)至 7.27.4,最后，補(bǔ)充蒸播水至 1000ml充分混合，4c冰箱保存?zhèn)溆谩?該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使 其終濃度為 0.5%1%。該固定劑較溫和，適于組織的長期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4c冰箱 保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。 3. Bouins液及改良 Bouins 液 試劑：飽和苦味酸 40%甲醛 250ml 冰醋酸 50ml 配制方法：先將飽苦味酸過濾，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于 4c 冰箱中 備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良 Bouins 液即不加冰醋酸。 該固定液為組織學(xué)、病理

4、學(xué)常用固定劑這一，對組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整。但因偏 酸（pH為 33.5）,對抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標(biāo)本的長期保存。此外， 操作時(shí)，應(yīng)避免吸入或與皮膚接觸。 4. Zambonis（Stefaninis）液 試劑：多聚甲醛 20g 飽和苦味酸 150ml Karasson-SchwltsPB 至 1000ml 配制方法：稱取多聚甲醛 20g,加入飽和苦味酸 150ml,加熱至 60c左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過 濾、 冷卻后， 力口 Karasson-SchwltsPB 至 1000ml充分混合 （KarassonSchwlts 磷酸緩沖液的配制配制方法見

5、后） 。 該固定液適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對超微結(jié)構(gòu)的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究， 為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑之一。我們在應(yīng)用中，常采用 2.5%的多聚甲醛和 30%的飽和苦味酸，以增加其 對組織的穿透力和固定效果，保存更多的組織抗原。固定時(shí)間為 618h。 5. PLP 液 PLP 液即過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative) 試劑：過碘酸鈉 賴氨酸鹽酸鹽(或鹽酸賴氨酸)： 多聚甲醛 蒸播水 配制方法： (1)貯存液 A(0.1mol/L 賴氨酸-0.5mol/LNa3PO4,pH7.4):稱取賴氨酸鹽

6、酸鹽 1.827g溶于 50ml蒸儲水中，得0.2mol/L 的賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入 Na2HPO4 至 0.1mol/L,將 pH調(diào)至 7.4,補(bǔ)足 0.1mol/L 的 PB 至 100ml,使賴氨酸濃度也為 0.1mol/L,4c 冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。此溶液的滲透濃度為300mOsmmol/L/kg。 (2)貯存液 B(8%多聚甲醛溶液)：稱 8g 多聚甲醛加入 100ml蒸播水中，配成 8%多聚甲醛液(方法見前)。過濾后 4c 冰箱保存。 (3)臨用前，以 3 份 A液與 1 份 B液混合，再加入結(jié)晶過碘酸鈉(NaIO4),使 NaIO4 終濃度為 2%。由于 AB 兩液混

7、合，pH從約 7.5 降至 6.2,故固定時(shí)不需再調(diào) pH值。固定時(shí)間為 618h。 該固定劑較適于富含糖類的組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是借助于過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價(jià)氨基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成,一抗原決定簇位于蛋白部分，一故該固定劑有選擇性地使糖類固二|定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關(guān)系。Mclean 和 Nakane等認(rèn)為，最佳的混合是： 含 0.01mol/L 的過碘酸鹽、0.075mol/L 的賴氨酸、2%的多聚甲醛及 0.037mol/L 的磷酸緩沖液。 6. Kar

8、novskys 液(pH7.3) 試劑：多聚甲醛 30g 25%戊二醛 80ml 0.1mol/LPB 至 1000ml 配制方法：先將多聚甲醛溶于 0.1mol/LPB 中，再加入戊二醛，最后加 0.1mol/L 的 PB 至 1000ml,混勻。 該固定劑適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，用該固定液在 4c短時(shí)固定，比在較低濃度的戊二醛中長時(shí)間固定 能更好地保存組織的抗原性和細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定時(shí)最好先灌注固定，接著浸泡固定 1030min,用緩沖 液漂洗后即可樹酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。 7. 0.4%對苯醍(Parabenzoquinone) 試劑：對苯醍 4.0g 0.01mol/LPBS10

9、00ml 配制方法：稱取 4.0g 對苯溶于 1000ml0.01mol/L 的 PBS即可。 對苯醍對抗原具有較好的保護(hù)作用，但對超微結(jié)構(gòu)的保存有一定影響，故常與醛類固定劑混合使用。 一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時(shí)間過長，固定液變?yōu)樽厣梁稚?，會使組織 標(biāo)本背景增加，影響觀察。此外，對苯醍有劇毒，使用時(shí)避免吸入或與皮膚接觸。 8. PFG液(Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative,PFG) 試劑：對苯醍 20g 多聚甲醛 15g 25%戊二醛 40ml 0.1mol/L 二甲酸鈉緩沖液至 1000ml 配制

10、方法：先以 500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對苯醍及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至 1000ml充分混合。 對苯醍與戊二醛及甲醛聯(lián)合應(yīng)用，即可阻止醛基對抗原的損害，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，故適于多種類抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其是免疫電鏡的研究。 9. 碳二亞酰胺-戊二醛(ECD-G)液 試劑：0.05mol/LPB500ml 0.01mol/LPBS500ml Tris約 14g 濃 HCl少許 ECD10g 25%戊二醛 3.5ml 配制方法：先以約 500ml的 PB與相同體積的 PBS混合，加入 Tris(使其終濃度為 1.4%)溶解，以濃 HCl調(diào) pH至 7.0,

11、再將事先稱取好的 ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計(jì)時(shí)，用 pH 計(jì)檢測，約 23min 時(shí)，pH 降至 6.6,再以 1N 的 NaOH 在 4min 內(nèi)調(diào) pH至 7.0,此時(shí)， 將該混合固定液加入盛有細(xì)胞(經(jīng) PBS 漂洗過)的器皿中，在 23c固定 7min 后，以 PBS 洗去固定液，即可進(jìn)一步處理。 ECD 即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi-imidehydrochloride,簡稱乙基-CDI,常用于多肽類激素的固定，對酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD 單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛、Tr

12、is 及 PB聯(lián)合應(yīng)用，效果明顯改善，細(xì)胞質(zhì)仍可滲透， 利用細(xì)胞中抗原的定位，超微結(jié)構(gòu)保存較好。目前認(rèn)為是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞電鏡水平免疫細(xì)胞化學(xué)研究的很好的固定劑。 10. 四氧化鉞(鉞酸 OsmicAcid,OsO4) 配制：將洗凈裝有 OsO4 的安甑中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安甑遇冷自破。也可用鉆石刀在安甑上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安甑，待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解，應(yīng)在用前幾天配制。 (1) 2%OsO4 水溶解：取 Os041g溶于重蒸水中。此液常作為儲備液，于冰箱中密封保存。 (2) 1%OsO4-PB: 試齊 1J:A、2.26%NaH2PO4

13、?2H2O4.15ml B、2.52%NaOH8.5ml C、5.4%葡萄糖 5ml D、OsO40.5g 配制方法：先分別配好 A、B、C三種液體，取 A液 41.5ml與 B液 8.5ml混合，將 pH調(diào)至 7.37.4,取 AB 混合液 45ml再與 5mlC 液混合即為 0.12mol/LPBG。 (3) 1%OsO4/0.1mol/L 二甲腫酸鈉緩沖液(pH7.27.4): 試劑：2%OsO4 水溶液 10ml 0.2mol/L 二甲腫酸鈉緩沖液(pH7.27.4)10ml 配制方法：取 2%OsO4 儲備液 10ml與等量 0.2mol/L、pH7.27.4 的二甲腫酸鈉緩沖液充分

14、混合即可。OsO4 是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管 OsO4 主要為脂類固定劑，但也可與肽類及蛋白 質(zhì)起作用， 形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。 過氧化物酶的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) OsO4 處理后， 電子密度增高， 適于電鏡研究。但由于 OsO4 的反應(yīng)產(chǎn)物對光及電子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細(xì)胞化學(xué)染色前常需去除，去鉞在光鏡水平常用 1%的高鎰酸鉀，在電鏡水平則常用 H2O2 來處理。 以上介紹了目前免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的一些固定液。關(guān)于固定液種類還很多，如 70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精(含 0.1%1%醋酸的 70%90%的酒精等)， 這些溶液都能促使蛋白質(zhì)凝固。 它們最初只是光學(xué)顯微鏡通用的固定液，但在免疫細(xì)胞化學(xué)上用其它方法不成