沙門氏菌的檢驗

1、 全國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)委員會 微生物標(biāo)準(zhǔn)協(xié)作組 2008年11月14日-18日 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗（GB/T4789.4） 修訂背景國內(nèi)外方法修訂內(nèi)容 前增菌 選擇性增菌 分離平板生化鑒定 血清學(xué)鑒定報告 回顧一下食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)的制定，經(jīng)歷了從無到有，從事該領(lǐng)域的工作者，花費了巨大的心血，先后制修訂了84版、94版、和2003版的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，每版的標(biāo)準(zhǔn)，都為該年代的食品衛(wèi)生工作提供了巨大的技術(shù)支持，同時也深深地烙上了該時代的經(jīng)濟特征。 由于食品生產(chǎn)及流通的全球化、新的食品加工技術(shù)的應(yīng)用、東西方飲食習(xí)慣的交融、自然環(huán)境的改變等因素的影響，目前沙門氏菌污染的食物種類、季節(jié)及場所發(fā)生了重大變化

2、。同時，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，對于沙門菌的快速檢測方法層出不窮，有些方法已通過國際權(quán)威機構(gòu)認(rèn)證（如AOAC）成為了國際標(biāo)準(zhǔn)方法。 1. 修訂任務(wù)由衛(wèi)生部全國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)委員會下達，由微生物標(biāo)準(zhǔn)協(xié)作組具體實施。2. 兄弟單位、企業(yè)、公司為參與單位。 3. 共采集到數(shù)據(jù)800多個，專家反饋意見50余條（采納90%以上）條，形成標(biāo)準(zhǔn)的草案稿、送審稿。4 . 時間跨度2004年2006年 結(jié)合目前的國際標(biāo)準(zhǔn)和原標(biāo)準(zhǔn)的實際使用情況，針對原標(biāo)準(zhǔn)的修訂，我們遵循以下的修訂原則：1以原國標(biāo)為基礎(chǔ)，保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性；2參照國際分析協(xié)會（AOAC）、國際標(biāo)準(zhǔn)組織（ISO）及美國食品藥品管理局（FDA）的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

3、；3結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的比對實驗和驗證實驗，積極吸取新方法、新技術(shù)，修訂標(biāo)準(zhǔn)。1. GB/T4789.42. AOAC Official Method ：967.26，967.27，967.283. ISO ：65794 . USFDA ： Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5: Salmonella。 1 前增菌；2選擇性增菌；3 分離；4 生化鑒定；5. 血清學(xué)鑒定；6.報告。國家標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)USFDAFSISAOAC ISO凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加

4、工的食品前增菌法前增菌法25g25gBPW225mLBPW225mL36 1 一般4h，干蛋品18h24h10mL10mLMMMM（或（或TTBTTB）100mL100mL10mL10mLSC100mLSC100mL直接增菌法直接增菌法25g25g滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水25mL25mL檢樣勻液檢樣勻液25mL 25mL MMMM（或（或TTBTTB）100mL100mL檢樣勻液檢樣勻液25mL25mL SC100mLSC100mLBSBSDHLDHL（或（或HEHE、WSWS、SSSS）TSITSI（排除排除A/A HA/A H2 2S S結(jié)果結(jié)果 ），），靛基質(zhì)，尿素，靛基質(zhì)，尿素，KCN

5、KCN，賴氨酸，賴氨酸沙門氏菌血清學(xué)試驗沙門氏菌血清學(xué)試驗甘露醇 山梨醇H H2 2S S 靛靛 尿尿KCNKCN 賴賴H H2 2S S 靛靛 尿尿KCNKCN 賴賴/ /非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果沙門氏菌血清學(xué)試驗沙門氏菌血清學(xué)試驗 ONPG 沙門氏菌沙門氏菌非沙門氏菌非沙門氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18h24h36 1 40h48h36 1 18h24h 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.4-2003GB/T 4789.4-2003樣品（樣品（20類）類）25g225mL 乳糖肉湯（乳糖肉湯（L

6、B）or 胰酪胨大豆肉湯（胰酪胨大豆肉湯（ TSB）or 煌綠溶液煌綠溶液 （BG）or通用前增菌肉湯（通用前增菌肉湯（UPB）or營養(yǎng)肉湯（營養(yǎng)肉湯（NB）or 再造脫脂奶粉再造脫脂奶粉 or 四硫酸鹽煌綠（四硫酸鹽煌綠（TT）pH6.80.2 242 h 35RVTT 430.2 or 352.0 242h 242h 420.2BS & XLD & HE 242h 35TSI & LIA非沙門菌非沙門菌沙門菌沙門菌非沙門菌非沙門菌LIA+LIA TSI K/ALIA TSI A/A尿素酶，尿素酶，H抗原（多價抗原（多價H抗血清或抗血清或Spicer-Edwards

7、flagellar (H) test ），賴氨酸脫羧酶，），賴氨酸脫羧酶，酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（KCN，丙二酸鹽，吲哚），丙二酸鹽，吲哚），O抗原抗原酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，MRVP,西蒙氏檸檬酸鹽西蒙氏檸檬酸鹽（API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI）+O抗原&H抗原細菌學(xué)分析手冊（細菌學(xué)分析手冊（FDA/BAM）USDA/FSIS MLG 4.02樣品樣品BPW or BPW（含結(jié)晶紫）含結(jié)晶紫）351 20-24hBG

8、S & DMLIA or XLT442 0.5 2224h0.5 0.05mL10mL TT0.1 0.1 0.02 0.02mLmL10mL 10mL mRVmRV42 0.5 2224h35 1 1824h & 48hTSI & LIA血清學(xué)試驗血清學(xué)試驗商業(yè)生化試劑盒或自動鑒定系統(tǒng)商業(yè)生化試劑盒或自動鑒定系統(tǒng) or傳統(tǒng)生化鑒定傳統(tǒng)生化鑒定報告結(jié)果報告結(jié)果AOAC Official Method 967.25Salmonella in FoodsPreparation of Culture Media and ReagentsAOAC Official Method

9、 967.26Salmonella in Processed FoodsDetectionAOAC Official Method 967.27Salmonella in FoodsIdentificationAOAC Official Method 967.28Salmonella in FoodsSerological TestsAOAC 967.25AOAC 967.25967.28967.28處理樣品處理樣品沙門菌沙門菌1 1mL+10mLSCmL+10mLSC1 1mL+10mLTTmL+10mLTT35 242hXLD & HE & BSXLD & HE &

10、amp; BS35 242h（BS 24h&48h）35 242hTSI & LIATSI & LIA35 242h純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物不純培養(yǎng)物不純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物MAC or XLD or HE尿素酶尿素酶尿素酶尿素酶非沙門菌非沙門菌H H抗原，抗原，LIALIA，酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（KCNKCN，丙二酸鹽，吲哚），丙二酸鹽，吲哚），O O抗原抗原非非沙沙門門菌菌補充生化試驗酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，MRMRVP,VP,西蒙氏檸檬酸鹽西蒙氏檸檬酸鹽非非沙沙門門菌菌25g樣品樣品225mL BPW35

11、or 37 1620 h0.1mL+10mL RV10mL+100mL SC42 24h35 or 37 24h,48h酚紅煌綠瓊脂酚紅煌綠瓊脂 （亮綠瓊脂）（亮綠瓊脂） & 第二種選擇性平板第二種選擇性平板35 or 37 2024h無典型菌落再培養(yǎng)無典型菌落再培養(yǎng)1824h典型菌落（典型菌落（pink red）營養(yǎng)瓊脂純化可疑菌落營養(yǎng)瓊脂純化可疑菌落35 or 37 1824hTSI，尿素酶，賴氨酸脫羧酶，尿素酶，賴氨酸脫羧酶，ONPG，VP，吲哚吲哚血清學(xué)試驗血清學(xué)試驗（O抗原，抗原，Vi抗原，抗原，H抗原）抗原）報告結(jié)果報告結(jié)果送參考實驗室分型送參考實驗室分型ISO 6579:

12、1993(E) 微生物沙門菌檢測的通用方法微生物沙門菌檢測的通用方法1 前增菌2 選擇性增菌3 分離4 鑒定5 報告檢樣36 1 ，8 h18hTSI，賴氨酸，NA， 靛基質(zhì)， 尿素 (pH 7.2)， KCN挑取可疑菌落BSXLD（或HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基）1 mL+TTB 10 mL1 mL+SC10 mL25g（mL）樣品+225 mLBPWH2S+靛基質(zhì)- 尿素-KCN- 賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+ 尿素- KCN-賴氨酸+H2S-靛基質(zhì)-尿素-KCN- 賴氨酸+/-反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符商 品 化 生 化鑒定系統(tǒng)42 1 ，18 h24 h36 1 ，18 h24 h36 1 ，40

13、h48 h36 1 ，18 h24 h甘露醇+、山梨醇+ONPG-報告非沙門氏菌沙門氏菌，血清學(xué)試驗沙門氏菌檢驗程序1 取消樣品分類，前增菌液統(tǒng)一為取消樣品分類，前增菌液統(tǒng)一為“緩沖蛋白胨水緩沖蛋白胨水” 原國標(biāo)：BPW FDA、AOAC：多種前增菌液 ISO：BPW 2 對所有樣品均進行對所有樣品均進行8-18h前增菌前增菌 原國標(biāo)只對凍肉、乳品、蛋品等加工食品進行前增菌，F(xiàn)DA、AOAC、ISO、Canada MFHPB、CCFRA等組織或國家對所有樣品都進行前增菌。3 修改了樣品處理方式修改了樣品處理方式 增加拍擊式均質(zhì)器，均質(zhì)袋可直接培養(yǎng)。4 增加調(diào)整增加調(diào)整pH值值 1 使用使用“T

14、TB、SC”，取消，取消“MM” 原國標(biāo)：“MM或TTB、SC AOAC：TT、SC FDA：RV、TT ISO：RV、SC 選擇性增菌的目的是最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使選擇性增菌的目的是最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種選擇性分離增菌液，一種是抑制除沙門氏菌以外其腸道用兩種選擇性分離增菌液，一種是抑制除沙門氏菌以外其腸道菌的生長，一種是在不影響其他腸道菌生長的情況下促進沙門菌的生長，一種是在不影響其他腸道菌生長的情況下促進沙門氏菌的生長。氏菌的生長。使用使用BS、XLD、HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 原國標(biāo)：BS、DHL（或HE、WS、SS） FDA：BS、XL

15、D、HE AOAC：BS、XLD、HE ISO：phenol red brilliant green瓊脂、BS或HE 為了最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基。 I-SS65.3 I-SS-M81.0 C-SS52.0 I-HE83.2 C-HE80.0 I-XLD83.0 C-XLD86.2 I-BS106.6 C-BS77.7 CHRO68.4 C-DHL98.4 C-WS71.6 TSA（對照）（對照）100.0 I： 進口進口C：國產(chǎn)：國產(chǎn)C-BSI-BSC-HEI-HEI-XLDC-XLD（變形菌落-錯誤）1） 采納API 20E或Vitek GNI為傳統(tǒng)生

16、化鑒定方法的選擇性替代方法”。 2） 生化鑒定項目進行調(diào)整生化鑒定項目進行調(diào)整 原國標(biāo)中生化鑒定是將可疑菌落同時接種于三糖鐵（TSI）瓊脂、蛋白胨水 (供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂 (pH7.2)、氰化鉀 (KCN) 培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基； 現(xiàn)修改為：在接種TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時增加一項營養(yǎng)瓊脂（NA），經(jīng)TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的選擇后，可篩掉大部分非沙門氏菌株，大大減少了工作量，同時也滿足了API 20E或Vitek GNI鑒定的需要。2） 生化鑒定項目進行調(diào)整（續(xù)）生化鑒定項目進行調(diào)整（續(xù)） 為保持與原標(biāo)準(zhǔn)的一致性，本標(biāo)準(zhǔn)也保留了可以同時直接接種蛋白胨

17、水 (供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂 (pH7.2)、KCN 培養(yǎng)基的內(nèi)容。本部分還增加了對疑似菌落進行留樣確認(rèn)的部分，以備必要時復(fù)查，這對生化鑒定不確定的菌落進行進一步驗證是非常必要的。 第第1位數(shù)位數(shù)第第2位數(shù)位數(shù)第第3位數(shù)位數(shù)第第4位數(shù)位數(shù)第第5位數(shù)位數(shù)第第6位數(shù)位數(shù)第第7位數(shù)位數(shù)結(jié)結(jié)果果判判定定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4反應(yīng)反應(yīng)結(jié)果結(jié)果- + + + +- - - - + + + - +- + -沙沙門門菌菌應(yīng)得應(yīng)得樹枝樹枝

18、0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0組合組合編碼編碼 6 7 0 4 7 5 2沙門氏菌沙門氏菌20E鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果布氏檸檬酸桿菌布氏檸檬酸桿菌20E鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果河生腸桿菌河生腸桿菌20E鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果 應(yīng)用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)。先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結(jié)果。 1 血清學(xué)鑒定中的菌體分群為選擇性試驗項目血清學(xué)鑒定中的菌體分群為選擇性試驗項目 原國標(biāo)進行O抗原、H抗原鑒定及菌體分群； FDA、AOAC進行O抗原、H抗原鑒定，菌體分群為選擇性； ISO進行O抗原、H抗原鑒定。 綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果,報告25g樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。選擇性增菌液的配置分離培養(yǎng)基的質(zhì)控疑似菌落的挑選API 20E 結(jié)果判讀血清質(zhì)量VIDAS（生物梅里埃公司） BAX （杜邦公司） VIDAS 應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的全自動免疫