根據(jù)浮力密度并應(yīng)用密度依賴(lài)的細(xì)胞分離技術(shù)對(duì)海生細(xì)菌

1、根據(jù)浮力密度并應(yīng)用密度依賴(lài)的細(xì)胞分離技術(shù)對(duì)海生細(xì)菌分類(lèi)和初步鑒定簡(jiǎn)介 本次研究的目的是測(cè)試一些天然海生細(xì)菌種群是否存在獨(dú)特的的浮力密度，從而可以用密度依賴(lài)的細(xì)胞分離（DDCS）方法來(lái)分離。 我們首先濃縮一個(gè)天然細(xì)菌集合體來(lái)收集足夠數(shù)量的細(xì)胞。我們用DDCS方法把它們分成三部分，每部分的群落結(jié)構(gòu)由熒光原位雜交分開(kāi)。 古生菌細(xì)胞趨向于出現(xiàn)在高濃度部分，反之那些噬細(xì)胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬在低的濃度部分。前言 浮力密度是一個(gè)單細(xì)胞水生生物體的基本物理特征，例如浮游植物和細(xì)菌。 對(duì)浮游植物來(lái)說(shuō)，在考慮沉積速度的時(shí)候這個(gè)參數(shù)也必須被考慮進(jìn)去。 但是對(duì)于海生細(xì)菌并不需要考慮浮力密度，因?yàn)楹Ｉ?xì)菌的浮力密

2、度的意義并不明顯。 浮力密度的不同能被用來(lái)分離微粒，DDCS方法已經(jīng)被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)。前言 不同生理特征的細(xì)菌利用這個(gè)方法得到了成功分離，因?yàn)樯淼淖兓梢愿淖兗?xì)胞的組分以致于浮力密度。 因?yàn)樘烊缓Ｋ臓I(yíng)養(yǎng)水平通常較低，并且恒定（大約1mg/L），所以沒(méi)有或者很少有細(xì)胞處在符合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中的指數(shù)期的生理狀態(tài)，而且在天然細(xì)菌群體中，生理狀態(tài)的變化不像包含延遲期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期的分批培養(yǎng)的細(xì)菌那么的大。前言DDCS的方法是很有說(shuō)的方法是很有說(shuō)服力和應(yīng)用前景的！服力和應(yīng)用前景的！材料和方法 表層海水預(yù)過(guò)濾（3微米）超濾（2微米） 密度梯度離心分離不同密度的菌體 FISH 觀(guān)察和計(jì)數(shù)材料和方

3、法樣品的采集 我們用已經(jīng)消毒過(guò)的塑料桶在一個(gè)名為Aburatsubo 小港口 (北緯3509.5, 東經(jīng)13936.5; Sagami Bay, Japan) 的地方于2004年6月28日，2004年10月25日，2005年1月24日，2005年4月18日分別取得4升表層海水。材料和方法預(yù)過(guò)濾 這些樣品通過(guò)微孔聚碳酸酯過(guò)濾器(直徑47毫米; 孔直徑3.0微米; 型號(hào) PC MB 111112; Whatman, Middlesex, United Kingdom)預(yù)過(guò)濾。材料和方法超濾 然后，這些經(jīng)過(guò)預(yù)過(guò)濾的樣品經(jīng)過(guò)另一種微孔聚碳酸酯過(guò)濾器(直徑90毫米; 孔直徑2.0微米; 型號(hào) PC MB

4、 111706; Whatman)進(jìn)行超濾，超濾裝置的型號(hào)為：(UHP-90K;Advantec, Tokyo, Japan)。 超濾的環(huán)境中充滿(mǎn)了氮?dú)猓瑝毫?MPa。樣品被濃縮至原濃度的133200倍。 經(jīng)過(guò)不到4個(gè)小時(shí)的上述過(guò)程之后，這些樣品被保存在零下4攝氏度的環(huán)境中。材料和方法密度梯度離心 我們使用了一種名為Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 的梯度工作溶液，這種溶液含有6163的Percoll，10的4M NaCl 溶液，10的10磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），以及1719的蒸餾水。材料和方法密度梯度離心 接著我們?nèi)〕龊辽?/p>

5、這種工作溶液，將毫升的我們的樣品置于該工作溶液的表面，然后將這種混合液使用SW40 Ti 轉(zhuǎn)頭 (Beckman, CA) in a Beckman Optima XL-90 離心機(jī)在50,512 g and 4攝氏度下超速離心分鐘 經(jīng)過(guò)超速離心后, 通過(guò)使用Piston 梯度分餾器 (Biocomp, Fredericton, Canada)這些樣品被分成上，中，下三層。材料和方法細(xì)菌數(shù)量的計(jì)數(shù) 每層分別用高壓蒸汽滅菌過(guò)的，而且用微米孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾過(guò)的人造海水稀釋?zhuān)缓蟊唤K濃度為的多聚甲醛固定。 在用（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色后，細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)熒光顯微鏡(BH-2; Olympu

6、s, Tokyo, Japan) 計(jì)數(shù)出來(lái)。材料和方法細(xì)菌種類(lèi)的鑒定 每個(gè)被分層的樣品被Isopore聚碳酸酯過(guò)濾器(直徑25毫米; 孔徑 0.2 微米; type GTTP 02500; Millipore, Eschborn, Germany) 過(guò)濾，過(guò)濾條件為真空。 這些過(guò)濾器和樣品在過(guò)濾操作之前都置于零下攝氏度的環(huán)境中。材料和方法FISH 每個(gè)過(guò)濾器被切成了個(gè)片斷，然后放置在載玻片上，并用封口膜(American National Can,Chicago, IL)覆蓋，而且用含有微升雜交緩沖液（表）和微升的含有納克每微升的上述寡核苷酸片斷的探針的共微升的混合溶液覆蓋。材料和方法FISH

7、 在攝氏度的溫箱中恒溫培養(yǎng)了分鐘后，上述過(guò)濾器被轉(zhuǎn)入到一個(gè)含有攝氏度洗脫液的小瓶中，并在攝氏度下培養(yǎng)分鐘。接著將這些過(guò)濾器取出，放置于Toyo濾紙(Advantec)上晾干，然后放置在封口膜上，并用微升的溶液（經(jīng)過(guò)0.2微米孔徑過(guò)濾的以蒸餾水溶解的終濃度為1微克每毫升）浸泡，注意這個(gè)過(guò)程是在室溫和黑暗條件下進(jìn)行的。材料和方法FISH 然后這些過(guò)濾器被輕輕的用毫升的微米過(guò)濾過(guò)的蒸餾水清洗，接著在Toyo濾紙上晾干，在載玻片上用Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., Canterbury, UnitedKingdom) 制成標(biāo)本裝片。 在雜交之后，過(guò)濾器片斷上的細(xì)菌可以通過(guò)熒

8、光顯微鏡(BH-2; Olympus)和過(guò)濾器接收機(jī)計(jì)數(shù)出來(lái)。 對(duì)于每個(gè)樣品和探針，至少菌落和多于個(gè)細(xì)胞被數(shù)出來(lái)。所有的數(shù)量可以通過(guò)減去NON338 探針這一陰性對(duì)照來(lái)校正。實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞濃縮效率：由濃縮前后海水中細(xì)胞個(gè)數(shù)的百分?jǐn)?shù)比率表示。DAPI陽(yáng)性細(xì)胞：可以被DAPI染色，從而能通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)的細(xì)胞?！翱偧?xì)菌”：在實(shí)驗(yàn)中所有能被DAPI染色的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有把注意力放在細(xì)菌形態(tài)大小的不同上。每組樣品中，由不同染料或探針?biāo)鶞y(cè)得的細(xì)胞濃縮效率所用染料或探針細(xì)胞濃縮效率（）七月十月一月四月DAPI88929396ALF91696769792BET42a96769896GAM42a84839

9、999CF319a82669794ARCH91584848894EGB33899999699實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果由上表可以看到：DAPI陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞濃縮效率分布由88至96。若從不同的染料或特定探針效果來(lái)看濃縮效率則從66（2004年10月25日， CF319a ）分布到100（2005年1月24，GAM42a）。（平均值91，標(biāo)準(zhǔn)偏差9.2，變異系數(shù)10，樣本總體N24）在濃縮過(guò)程中沒(méi)有改變相關(guān)種群相對(duì)的數(shù)量關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 每一樣品根據(jù)浮力密度被分成上、中、下三部分： 上1.074 g/ cm3 。 對(duì)于四個(gè)樣品，分餾前的三部分的“總細(xì)菌”占總體細(xì)菌的49到71（平均61，標(biāo)準(zhǔn)偏差9.1，變異

10、系數(shù)15）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用染劑或探針?biāo)@示的各部分的比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果由上圖左部分的DAPI可以做出下表：各個(gè)部分在“總細(xì)菌”所占的比例（）標(biāo)準(zhǔn)偏差（）變異系數(shù)（）分布平均值上層2648409.524中層1654321650下層2041299.231實(shí)驗(yàn)結(jié)果上圖右部分的探針測(cè)試：實(shí)驗(yàn)收集了四個(gè)不同季節(jié)的樣品，在所有的使用探針的樣品中的變異系數(shù)為0.2413 。我們發(fā)現(xiàn)在相關(guān)的細(xì)菌種群中存在一種趨勢(shì)：屬于噬細(xì)胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬的更集中于上層部分低濃度部分，而古生菌細(xì)胞趨向于出現(xiàn)在下層部分即高濃度部分。Discussion 從天然海水中富集的的細(xì)胞用DDCS的方法被分成三部分，每部分的群落結(jié)構(gòu)可通

11、過(guò)熒光原位雜交（FISH）來(lái)證實(shí)。古生菌的細(xì)胞傾向于出現(xiàn)在高密度部分，CFB細(xì)胞出現(xiàn)在低密度的部分。這個(gè)結(jié)果顯示一些分類(lèi)學(xué)群體有著獨(dú)特的浮力密度。細(xì)胞富集 : 對(duì)于DDCS方法，一毫升樣品加在工作溶液的表面。對(duì)于有著不同類(lèi)探針的FISH，為了得到足夠數(shù)量的細(xì)胞，很必要在實(shí)驗(yàn)步驟前富集細(xì)胞。在預(yù)先的調(diào)查之后，我們決定得到一個(gè)密度大約為每毫升108個(gè)細(xì)胞的懸浮液，這需要100-200倍濃縮的天然海水樣品。目前方法的富集效率大約為90%，這種效率適合于切向流系統(tǒng)培養(yǎng)的埃希氏大腸桿菌。我們發(fā)現(xiàn)不同的探針特異的組之間的富集效率差別很小，說(shuō)明在富集過(guò)程中沒(méi)有差別。在這項(xiàng)研究里，用DDCS分離樣本后再應(yīng)用熒

12、光原位雜交法，是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)依賴(lài)的技術(shù)中，這種方法能提供最可信的數(shù)據(jù)資料。如果有另一種需要較少細(xì)胞的方法被應(yīng)用，細(xì)胞富集的程序被可以省去。 DDCS應(yīng)用于自然海生細(xì)菌群落： 在以前的研究中，DDCS被專(zhuān)門(mén)應(yīng)用到在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中。依靠INT將DDCS應(yīng)用于自然細(xì)菌群體是專(zhuān)門(mén)為了增加有益活生菌的密度；因此不是依靠自然群落的浮力密度的差別。當(dāng)應(yīng)用于自然的聚集體時(shí)，用DDCS分離細(xì)胞應(yīng)該僅僅依靠它們的浮力密度，而不是其他的因素如細(xì)胞大小和凝集。如果在目前的超速離心法的條件下，沉降平衡沒(méi)有被建立，這些因素會(huì)明顯影響結(jié)果。假設(shè)細(xì)胞直徑是0.3m ,浮力密度是1.087g/cm3,在目前的超速離心

13、狀態(tài)下細(xì)胞會(huì)移動(dòng)163mm。因?yàn)槊芏葹?.087g/ cm3的浮力標(biāo)記珠位于距測(cè)試管表面65mm處，沉降平衡應(yīng)該在超速離心式間段內(nèi)建立。細(xì)胞的形狀也不會(huì)造成什么影響，因?yàn)檩S比為20的長(zhǎng)橢球在我們的超速離心狀態(tài)下會(huì)移動(dòng)82mm。因此，細(xì)胞大小，形態(tài)和聚集狀態(tài)等因素很難影響到當(dāng)前的結(jié)果。顯微觀(guān)察也支持這個(gè)觀(guān)點(diǎn)。 海生古生菌和真細(xì)菌的浮力密度： 應(yīng)用DDCS，我們發(fā)現(xiàn)屬于噬細(xì)胞菌屬-產(chǎn)黃菌屬-擬桿菌屬（CFB）的自由生長(zhǎng)細(xì)胞的浮力密度（分散在頂部）比自由生長(zhǎng)的古生菌細(xì)胞的浮力密度低（底部）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與這些群落在自然海水中的分布相符。由于浮游植物，CFB細(xì)菌傾向于生活在表面，而古生菌占據(jù)了一半以上深海

14、細(xì)菌，尤其是在1000m以下。雖然古生菌細(xì)胞的細(xì)胞膜普遍由阿克醇和卡克醇組成，而真細(xì)菌的細(xì)胞膜由油脂構(gòu)成，究竟哪種細(xì)胞特征解釋了浮力密度的不同還不清楚。因此生物化學(xué)研究也許能解釋影響浮力密度的因素。在這項(xiàng)研究中我們無(wú)法找到其它親緣群體的浮力密度變化趨勢(shì)，可能是由于它們是具有生理差別的細(xì)胞的混合體，也許是由于每一個(gè)群落都包含了具有廣泛密度特征的亞群組成。細(xì)菌沉降速率計(jì)算： 因?yàn)檫@個(gè)工作提供了第一手的海生細(xì)菌群落浮力密度的數(shù)據(jù)資料，我們同時(shí)用Stoke定律估計(jì)了它們的沉降速率。對(duì)于海生細(xì)菌和海水我們做了如下假設(shè)：細(xì)胞是直徑為0.3 m的球體；低，中，高密度細(xì)菌的浮力密度分別是1.047，1.067，1.087，海水的密度是1.027 g/cm3,這時(shí)的海水溫度是5。在這個(gè)假設(shè)的基礎(chǔ)上，低，中，高密度的細(xì)菌的沉降速率分別是10，20和30m/h-1,這些數(shù)值在20時(shí)增長(zhǎng)1.5倍。這個(gè)沉降速率很小，海生細(xì)菌實(shí)際上不能在擁有與我們計(jì)算中的假設(shè)所不同的物理化學(xué)因素和密度的水團(tuán)或水流中移動(dòng)。然而，大約1030m h-1的沉降速率說(shuō)明細(xì)胞能被重力作用影響，這正解釋了它們的垂直運(yùn)動(dòng)。近期研究結(jié)果顯示微尺度為（2，16，17，18）的細(xì)胞存在異向分布。依賴(lài)于浮力密度的細(xì)菌沉降速率可能導(dǎo)