MicroRNA-21激活NLRP3炎癥小體導致非酒精性脂肪肝的作用及

1、前言我國改革開放近40年來，社會主義經(jīng)濟有了蓬勃的開展，國民的物質(zhì)生活質(zhì)量水平也在飛躍提升。與此同時，各種疾病的患病率也在日益升高。其中脂肪肝，包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝的患病率也在逐年上升。隨之而來的是從脂肪性肝病到肝纖維化進而開展為肝硬化對國家經(jīng)濟和人民健康所帶來的威脅。因此，為了保護珍貴的醫(yī)療資源以及社會開展，我們必須積極探尋脂肪性肝病發(fā)生、開展的分子機制，同時，也是我們研究的重要課題。非酒精與脂肪引起的肝臟疾病是以肝細胞內(nèi)脂質(zhì)大量沉積為主要病理特征特點的疾病，不包括酒精性因素和其他一些明確因素，主要包括單純性脂肪肝SFL、非酒精性脂肪性肝炎NASH及其相關(guān)性肝硬化1。成人中非酒精

2、性脂肪性肝患病率已經(jīng)到達10%30%，而NASH占其中的10%20%，NASH有25%的可能性在10年內(nèi)開展為肝硬化2, 3。此外，NAFLD不僅僅可以導致肝纖維化、肝硬化、肝癌的發(fā)生，還可介導其他慢性肝病、高血壓、糖尿病以及動脈粥樣硬化等的發(fā)生4。在我國國內(nèi)，非酒精性脂肪性肝病患病率也逐年提升，大約為20%5，尤其是在我國的富裕城市地區(qū)已逐漸流行。新近的研究顯示：NAFLD是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)發(fā)生開展的一個獨立的危險因子6。NALFD能夠誘導血管壁增厚、內(nèi)皮功能紊亂，加速冠脈硬化、狹窄、鈣化，加重心臟心肌細胞重構(gòu)和心室舒張功能障礙等亞臨床CVD

3、的發(fā)生開展，最后能夠增加非酒精性脂肪性肝患者心血管疾病的死亡率 7, 8, 9。肝細胞癌(HCC)是全球五大常見惡性腫瘤之一，如果不及時干預，NAFLD可經(jīng)肝硬化開展為肝細胞癌。非酒精性脂肪性肝導致肝細胞癌的主要方式大概可以包括如下：1肝細胞內(nèi)脂滴沉積可加快癌細胞的轉(zhuǎn)移10。2相關(guān)蛋白固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)，三重基序蛋白(tripartite motif，TRIM)24，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)能夠促使肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。SREBP是介導非酒精性脂肪肝發(fā)生的重要物質(zhì)，敲低SREBPl可

4、使得細胞停止生長和促進細胞凋亡，而升高SREBPl表達那么可使得細胞加快增殖11。TRIM24是抑制脂質(zhì)沉積和肝臟損傷的表觀遺傳共調(diào)節(jié)因子12。OPN是一種可以促進肝臟脂質(zhì)沉積和誘發(fā)炎癥反響的多功能蛋白13。大家都知道，“二次打擊學說是NAFLD/NASH產(chǎn)生以及后續(xù)開展的重要機制，主要表現(xiàn)為以“胰島素抵抗為主的“首次打擊和以“氧化引起的應(yīng)激反響為主的 “二次打擊。胰島素抵抗(IR誘導的 “第一次打擊可以促使脂質(zhì)在肝細胞中過量沉積，導致單純性脂肪肝的發(fā)生。“第二次打擊主要是因為發(fā)生氧化應(yīng)激，促使活性氧ROS的大量生成，導致炎癥小體的釋放以及脂肪的沉淀、產(chǎn)生非細菌引起的病癥，進而導致細胞受損甚至

5、死亡，表現(xiàn)為NASH。所以可以認定，炎癥小體介導了非酒精性脂肪肝的發(fā)生開展過程。炎癥小體是由多種蛋白質(zhì)組成的一類復合體。其中，NLRP3炎癥小體是至今科學研究中，結(jié)構(gòu)和功能研究得最為明確的炎癥小體之一。NLRP3炎癥小體主要由NOD 樣受體NLRP3、起連接作用的ASC和沒有活性的Caspase1前體組成。當收到病原相關(guān)分子模式PAMPS或者是內(nèi)源性損傷相關(guān)的分子模式DAMPS的刺激后，炎癥小體可以生成能剪切IL-1和IL-18的前體的具有活性的Caspase1，生成具有活性的IL-1和IL-18，使得炎癥反響得到擴大效應(yīng)或放大效應(yīng)。MicroRNAmiRNA是一簇內(nèi)生的、大小約20-24個核

6、酸序列的非編碼小RNA，是由pre-RNA前體在經(jīng)過Dicer酶作用后生產(chǎn)成熟的miRNA。miRNA可以與其靶基因的3-UTR段相結(jié)合，使靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后抑制，甚至直接沉默。有大量的miRNAs在腫瘤及其他疾病、病理研究方面被發(fā)現(xiàn)，但是在非酒精性脂肪肝方面的研究仍有缺乏。miR-21是miRNA系列中的一個重要成員，是到目前為止被研究的比較清楚的miRNA之一。通過對miR-21表達譜的研究，在消化道、呼吸道泌尿系、淋巴血液等多系統(tǒng)腫瘤中與正常組織具有顯著的表達差異14, 15。大量有研究說明：miR-21能夠通過作用于靶基因Spry1激活NLRP3炎癥小體16，同時miR-21也能促進脂肪

7、和糖類代謝紊亂所導致的非酒精性脂肪肝的發(fā)生17。然而，NLRP3炎癥小體是否介導了miR-21誘導的非酒精性脂肪肝的發(fā)生？機制又如何？基于之前的一些報道，我們假設(shè)miR-21通過活化NLRP3炎癥小體誘導NAFLD的發(fā)生，探討其中的機制，為非酒精性脂肪肝的的防治給以了新的研究方向。學習文檔 僅供參考碩士學位論文 材料與方法材料與方法1 主要試劑、材料與設(shè)備1.1主要試劑高含糖量RPMI 1640培養(yǎng)瓶 乳牛血清青霉素溶液 胰腺霉 SDS 凝膠緩沖液BCA 蛋白質(zhì)含量檢測盒 蛋白質(zhì)電泳分子量標準 聚丙烯胺 氯胺酸 蛋白印跡抗稀釋溶液 蛋白印跡二次抗稀釋溶液 免疫熒光二抗藍 免疫熒光二抗-紅 深紅

8、O染色實驗盒 紫結(jié)晶體 VX-765 Sigma-Aldrich，USA微小RNA-21試劑檢驗盒RNA提純試劑Trizol一般PCR實驗盒日本塔卡拉公司Mir-21過表達病毒上海吉凱基因Mir-21下調(diào)病毒 上海吉凱基因Spry1 antibody Abcam，USAp-ERK antibody Abcam，USANF-B antibody Cell Signaling Technology，USA 脂質(zhì)體Lipo 2000Invitrogen，China裂解液Trizol Invitrogen，ChinaSpry1 3UTR質(zhì)粒上海吉凱基因1.2主要耗材細胞培養(yǎng)基聚偏二乙烯膜 細胞培養(yǎng)板細

9、胞培養(yǎng)瓶 細胞冷存低溫盒1.3主要儀器電子顯微鏡 激光聚合顯微鏡 一般光學顯微鏡 耐低溫離心機 分色光度計 超低溫冷藏設(shè)備 高速冷存離心機 干轉(zhuǎn)電泳儀 熒光掃描機 平行電泳儀 1.4原代細胞 為C57小鼠原代肝細胞；取自健康雄性C57小鼠，4周齡、體重20g-25g；由中南大學湘雅醫(yī)學院動物實驗中心購得。1.5實驗動物 同上1.6 Western blot 主要實驗試劑配置1、氯胺酸電泳緩沖液 SPS 氯胺酸 高純度蒸餾水 2、1倍 轉(zhuǎn)移安置培養(yǎng)液 氯胺酸 高純度蒸餾水500ml，內(nèi)含300ml乙醇 3. OBS 高純度蒸餾水1L，調(diào)整其PH到7.4 4. 0.004%的OBS溶液 上述制備的

10、200mlOBS溶液參加100ml高純度蒸餾水。 5. 貯藏液 6%的乳牛血清作為貯存液。 6. 27%聚丙烯胺 丙烯氨 參加定量蒸餾水至 交叉雙丙烯酰胺 6攝氏度貯藏 7. 12%過硫酸氨 0.3g過硫酸銨溶解于10ml三蒸餾水中。 8. TEMED : 9、12%交叉膠的制備12ml 三蒸餾水 25%聚丙烯胺 12%過硫酸氨 10、7.9%交叉膠的制備12ml 三蒸餾水 25%聚丙烯胺 12%或硫酸氨 11、6%壓縮膠制備6ml 三蒸餾水 25%聚丙烯胺 12%過硫酸氨 2 實驗方法2.1 臨床肝組織和血液的收集首先，通過屢次詳細的談話溝通取得患者信任并得到患者的同意并自愿簽署知

11、情同意書。對照組的肝組織是從由于肝血管瘤需要切除的血管瘤體邊緣的正常肝組織中取材，并收取患者的血液標本，本實驗中收集12例。另外，模型組收集12例非酒精性脂肪肝患者的肝組織標本和血液標本，肝組織標本由進行了肝穿刺活檢的患者提供。2.2 動物模型制作2.1：健康雄性C57小鼠48只，體重為20g-25g之間。小鼠分為對照組Control、高脂飲食組HFD、高脂飲食+lenti-NC組HFD+lenti-NC、高脂飲食+ lenti-mir-21-down組HFD+lenti-mir-21-down，每組12只。HDF組喂食高脂肪飼料。HFD+lenti-NC組動物給予高脂肪含量飼料飲食，同時沿鼠

12、尾靜脈注入lenti-NC病毒。HFD+lenti-mir-21-down組動物給予高脂肪含量飼料飲食以及沿鼠尾靜脈注入lenti-mir-21-down病毒。3 組織石蠟塊的制備3.1 動物組織獲取在經(jīng)過一個月的培養(yǎng)期之后，麻醉實驗用小白鼠，麻醉使用的是5%的巴戊比酡麻醉劑。在充分麻醉之后，割下小白鼠的肝臟組織，放到6%甲醇溶液當中保存起來。其余的肝臟組織放在零下90攝氏度的環(huán)境中冷藏起來。3.2 組織脫水、切片以及包埋. 組織脫水：梯次脫水：65% 酒精25min65% 酒精25min75%酒精(25min) 75%酒精(25min)80%酒精(25min)80%酒精(25min) 90%

13、酒精(15min) 100%酒精(15min)。 . 可視：二甲苯 二甲苯，每個處理步驟半個小時。. 滲透：石蠟I (30min)石蠟II(30min), 62。. 包埋：. 切片：-20冷凍半小時后，切成5µm左右薄片。4 HE染色 4.1脫蠟、水化烤片兩個小時，浸泡入二甲苯10分鐘，再放于濃度梯度的乙醇中：90% 酒精I6min95% 酒精12min90%酒精(6min) 100%酒精(6min)75%酒精(6min)65%酒精(6min) 雙氧水 (6min).4.2 HE染色.赤木精洗5 min，然后用含氯清水沖洗。.別離處理5-10s，氨水反藍5-10min。. 染紅色1m

14、in之后，用自來水沖洗。. 用高純度乙醇脫水，然后用樹膠封存。5 油紅O染色(1) 先小心輕緩倒去培養(yǎng)夜。(2) 用pbs輕緩漂洗(不洗沒問題)。(3)加95%酒精或10%中性甲醛固定30min。(4) 稀釋油紅儲存液，油紅：去離子水3:2。(510分鐘左右。(6)脫色：異丙醇或酒精漂洗。(7) 復染：淡蘇木染色1分鐘(8)甘油明膠封片(封片后可長期保存)。6 細胞總RNA的提取（1） 在提純RNA的時候，每20-50mg肝臟組織用1ml Trizdl試劑進行裂解反響；在提純肝臟組織的RNA的時候，每6-10 *107個細胞加1ml Trizdl后；2把已備好的裂解液移到EP管中；按l：5體積

15、參加氯仿3取上層水相放入另一EP管中,按1：2參加異丙醇，放置10分鐘,12000g離心10分鐘；5棄上清，每2mlTrizol加3ml 85%酒精進行脫水操作，9600g49離心處理6分鐘；6讓提純沉淀下來的RNA在自然環(huán)境下風干；7等到RNA比較枯燥之后，再參加30l DEPC水進行二次溶解操作，之后在零下90攝氏度下封存。尤其需要注意：千萬不能讓沉淀的RNA過度枯燥，否那么溶解起來就非常困難。并且測量出B350/460值。7 一般基因逆向成長錄7.1 將總的RNA作為根本模板，進行cDNA首鏈的嘗試合成，合成操作體系如下： RNA 水 9.5ul 5XRT Buffer(含25m鎂以及二

16、價鎂離子) 4ul dNTP(每項含有10mM 2ul RNA Inhibitor (10U/ul) 0.5ul Oligo(dT)20(10umol/L) 1ul 總RNA模板 2ul ReverTra Ace 1ul 合計 20ul7.2 反轉(zhuǎn)錄條件為10min40攝氏度，40min52攝氏度，6min100攝氏度，6min6攝氏度。在整個反響結(jié)束之后在-92攝氏度的條件下冷存6min。8 普通基因RT-QPCR8.1 詳細的反響條件如下。 上游特異性PCR催化劑 下游特異性的PCR催化劑 合計8.2具體的反響條件是：3min96攝氏度為一個循環(huán)周期，0.6min95攝氏度、0.6min4

17、5-55攝氏度、0.8-6min75攝氏度，進行30-45個循環(huán)周期。9 MicroRNA-21 RT-QPCR9.1 microRNA-21的逆轉(zhuǎn)錄 具體的反響條件為：1.5h75攝氏度，0.6min95攝氏度。9.2 microRNA-21的擴增 18ul 4ul 7ul 6ul 0.8ul 5ul 4.7ul 40ul10 Mir-21上調(diào)和下調(diào)病毒的轉(zhuǎn)染1、在轉(zhuǎn)染前18-24小時，讓細胞消化然后，以1*105/孔鋪到24孔板中。使融合度為2*105/孔左右。 2、轉(zhuǎn)染時，用含有2ml新鮮培養(yǎng)基替掉舊的培養(yǎng)基，再參加病毒懸液。 3、4小時后換液。 4、24小時后換培養(yǎng)基。 5、繼續(xù)培養(yǎng)。

18、11 si-RNA的轉(zhuǎn)染具體方法：提前24小時，先換無青霉素培養(yǎng)瓶，然后將RNA放入到無乳牛血清培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)。把按照1:60參加到上述無血清培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)。把RNA、等按照體積比例進行混合，在常溫下孵育0.5h。12 雙熒光素酶報告實驗12.1 裂解細胞1) 即時制備的培養(yǎng)液：在使用之前，取適宜量的，用三蒸餾水稀釋到濃度為1xULB，搖勻。1xULB可以在5條件下存放幾個星期的時間。2) 清洗細胞操作：首先參加過量的TBS，將洗滌液完全除去。3) 裂解細胞操作：依照上述表格提供的體積數(shù)據(jù)，倒入1xULB。在小型振蕩器上將培養(yǎng)皿震蕩6-12min；12.2 配制發(fā)光反響液 在進行定量測試之

19、前，在室溫條件下等到與相互溶解，在避光的條件下?lián)u勻。按照1:50的比例用FBI稀釋FSI，按20/1比例用RBII稀釋RSII，在避光的條件下分別配置足量的FRI與FBII。12.3 測定儀器的設(shè)置純手動操作儀器，依照相關(guān)實驗標準進行。FRI與RRII的注入體積標準為100 l。12.4自動發(fā)光測定制備好的FRI與RRII放置在已經(jīng)連接好管道的測定儀里面，F(xiàn)RI連接第一管道，RRII連接第二管道。選取樣本20 l參加板孔以及測定管底部位置，然后正式進行測量。同時記錄F1與R1內(nèi)含的發(fā)光單位。13 細胞培養(yǎng)13.1細胞培養(yǎng)原代小鼠肝細胞，在含有胎牛血清20%、青鏈霉素150U/ml的完整培養(yǎng)板進

20、行培養(yǎng)，38、CO27%的細胞培養(yǎng)瓶中。14 免疫蛋白質(zhì)印跡Western Blot14.1 蛋白提取14.1.1 細胞蛋白提取取大約107個細胞，用TBS對其進行二次沖洗，在去除洗滌液之后加蛋白進行裂解RBPA200ul(每200ulRIPA中包含3ul的PMSF+1ulCocktail蛋白酶裂化劑+3ul磷酸酶裂化劑)，用細胞刷收集細胞。并且將其轉(zhuǎn)移到離心管中，進行18min的立新操作。取上面清的液體，在-90攝氏度條件下封存。14.1.2 蛋白濃度測定150:1配制適量BCA工作液。2取0.5mg/ml蛋白標準溶液，加到96孔板中，至30ul。3參加5ul樣品于98孔板的樣品板中，并且參

21、加TBS一直稀釋至30ul。4在每個孔參加300u工作液，在常溫條件下孵育0.6h。5測量583nm吸光程度的光度值。14.2 樣品處理依照5:3的比例，參加6倍實驗緩沖液，在100攝氏度的條件下，花費9min的時間進行處理。14.3 不連續(xù)SDS-PAGE蛋白電泳1制備聚丙烯胺溶液：2上樣3電泳14.4 濕轉(zhuǎn)1電泳后，截取目的蛋白區(qū)段。2將PVDF膜在甲醇中浸泡30分鐘。14.5 免疫檢測1封閉2一抗孵育：濃度按一抗推薦說明進行。 (3)二抗孵育 4熒光掃描儀掃描14.6 半定量分析使用Pro-gel analyzer圖像分析軟件進行分析結(jié)果，重復3次以上。 15 免疫組織化學染色15.1

22、脫蠟和水化 1在二甲苯中浸泡大約5-10分鐘，分兩次進行。2在無水酒精中浸泡6min 3在85%酒精純度中浸泡6min 4在65%酒精濃度中浸泡6min 15.2 抗原修復 微波熱修復：煮沸枸櫞酸鈉緩沖溶液，將組織芯片放入，斷電間隔5-10分鐘?？蛇M行2次。 15.3 免疫組織化學染色 TP法 1、 裂解、脫水；2、 分3-5次用TBS溶液清洗，每次時間約6min；3、 在TMA上滴上4%的TBS溶液，并且靜置12min；4、 用TBS清洗3-5次，每次約6min；5、 修復抗原； 6、 TBS清洗3-5次，每次約6min； 7、 參加乳牛血清封閉液。并且去除多余的洗滌液；8、 參加III抗4

23、0l，在36攝氏度的條件下靜置1.5h；9、 在5攝氏度的條件下避光放置12h然后在38攝氏度的溫水中喚醒1h；10、 TBS清洗3-5次，每次時間約6min；11、 參加III抗30-60l，在38攝氏度條件下靜置1.5h；12、 在III抗中可以參加濃度為0.06%的tween-25； 13、 TBS清洗3-5次，每次時間約6min。16 統(tǒng)計結(jié)果分析使用SBTS14.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)對實驗結(jié)果進行分析，顯示的結(jié)果均以偏離均值的差值來進行標志，組與組之間的比較需要用系數(shù)t進行約束，將P<0.07被設(shè)定為兩者之間之間的差異存在關(guān)系。多個組別之間的比較采用單向差實驗，將P<0.07設(shè)

24、定為差異存在統(tǒng)計學意義。碩士學位論文 結(jié)果結(jié)果1 臨床肝組織標本中miR-21的表達水平的評估收集臨床肝血管瘤患者瘤旁的肝組織作為對照組，收集非酒精性脂肪肝患者肝穿刺的肝組織作為模型組，把收集的肝組織研磨碗。再參加Trizol提取組織總RNA，測濃度后，再逆轉(zhuǎn)錄，用熒光定量PCR試劑盒檢測肝組織中miR-21的表達量。研究結(jié)果說明：與對照組的肝組織相比，非酒精性脂肪肝患者的肝組織中miR-21的表達明顯升高。圖1 檢測臨床肝組織標本中mir-21 的表達量。qRT-PCR檢測肝組織中mir-21的含量。n=12, * VS Normal, P<0.05.2 臨床肝組織標本中Spry1/E

25、RK/NF-B通路活性的評估收集臨床肝血管瘤患者瘤旁的肝組織作為對照組，收集非酒精性脂肪肝患者肝穿刺的肝組織作為模型組，把收集的肝組織研磨，提取組織總共蛋白，進行western blot實驗，檢測miR-21靶基因蛋白Spry1、ERK的磷酸化、核蛋白NF-B的表達水平。研究結(jié)果說明：與對照組肝組織相比，非酒精性脂肪肝患者的肝組織中ERK的磷酸化水平、核蛋白NF-B的表達水平明顯升高，而非酒精性脂肪肝患者的肝組織中miR-21靶基因蛋白Spry1表達水平明顯降低。圖2 檢測臨床肝組織標本中Spry1/ERK/NF-B通路的活性。取自于臨床的肝組織標本W(wǎng)B檢測結(jié)果，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織里

26、面p-ERK、核蛋白NF-B的表達卻比對照組高，但是Spry1的表達卻比對照組低。n=12,* VS Normal, P<0.05。3 臨床肝組織標本中NLRP3炎癥小體活化水平的評估 收集臨床肝血管瘤患者瘤旁的肝組織作為對照組，收集非酒精性脂肪肝患者肝穿刺的肝組織作為模型組。取自于臨床的肝組織放于研磨碗中，參加少許液氮研磨，提取組織蛋白，進行western blot實驗，檢測NLRP3炎癥小體、Caspase1、ASC、IL-1的表達水平。同時進行免疫組化實驗檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)組份的表達水平。Western Blot以及免疫組化實驗結(jié)果均顯示，在非酒精性脂肪肝患者的肝臟組織中N

27、LRP3炎癥小體、Caspase1、ASC、IL-1的表達水平比對照組要高。圖3.1 檢測臨床肝組織標本中NLRP3炎癥小體活化水平。臨床肝組織標本的WB實驗結(jié)果，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織里面NLRP3、具有活性的Caspase1P10、ASC、IL-1前體的和具有活性的IL-1P17的表達比對照組高。n=12,* VS Normal, P<0.05。圖3.2免疫組化檢測臨床肝組織標本中NLRP3炎癥小體活化水平。臨床肝組織標本的免疫組化實驗結(jié)果，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織里面NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達比對照組高。n=12,* VS Normal, P&l

28、t;0.05。4 臨床肝組織標本中脂肪變性情況的評估收集臨床肝血管瘤患者瘤旁的肝組織作為對照組，收集非酒精性脂肪肝患者肝穿刺的肝組織作為模型組，把收集的肝組織做成石蠟切片，進行H&E染色以及油紅O染色。結(jié)果提示，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織切片中有大量的脂肪滴的形成；同時，檢測肝組織以及血液中甘油三酯的含量，結(jié)果顯示，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織以及血液標本中中甘油三酯的含量比對照組要高。圖4檢測臨床患者肝臟脂肪變的程度。A. 臨床患者肝組織H&E染色以及油紅O染色，在非酒精性脂肪肝患者的肝組織中有大量的脂肪滴的形成。B, C. 臨床患者肝組織以及血液中甘油三酯的含量。在非酒精

29、性脂肪肝患者的肝組織以及血液中甘油三酯的含量比對照組高。n=12,* VS Normal, P<0.05。5 miR-21靶基因檢測電腦預測，Spry1的3'UTR區(qū)可以結(jié)合miR21的序列，為了證明上述預測，原代小鼠肝細胞分為：轉(zhuǎn)染Spry1野生對照質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組、轉(zhuǎn)染Spry1野生型質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組、轉(zhuǎn)染Spry1突變對照質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組、轉(zhuǎn)染Spry1突變型質(zhì)粒+轉(zhuǎn)染lenti-mir-21-up組，72小時后檢測原代肝細胞螢火蟲熒光值與海腎素熒光值的比值。結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染Spry1野生對照質(zhì)粒+ l

30、enti-mir-21-up組相比，轉(zhuǎn)染Spry1野生型質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值下降,差異有統(tǒng)計學意義；但是與轉(zhuǎn)染Spry1突變對照質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組相比，轉(zhuǎn)染Spry1突變型質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值變化無統(tǒng)計學意義。上述結(jié)果說明Spry1為miR-21的靶基因。圖5 mir21的靶基因檢測。A. 計算器預測的Spry1的3'UTR可以結(jié)合mir21的序列。B. 與轉(zhuǎn)染Spry1野生對照質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組相比，轉(zhuǎn)染Spry1野生型質(zhì)粒+ lenti-mir

31、-21-up組的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值下降, 差異有統(tǒng)計學意義；但是與轉(zhuǎn)染Spry1突變對照質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組相比，轉(zhuǎn)染Spry1突變型質(zhì)粒+ lenti-mir-21-up組的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值變化無統(tǒng)計學意義。說明Spry1為mir-21的靶基因。n=3,* VS lenti-NC,P<0.05。6 Lenti-mir21-up能夠激活Spry1/ERK/NF-B通路，Lenti-mir21-down能夠抑制Spry1/ERK/NF-B通路的活化原代小鼠肝細胞分別轉(zhuǎn)染Lenti-mir21-up、Lenti-mir21-down以及各自的Lenti-

32、NC病毒，收集細胞，提取細胞總蛋白進行WB實驗，檢測miR-21靶基因Spry1、p-ERK、核蛋白NF-B的表達量。結(jié)果顯示：Lenti-mir21-up能夠促進p-ERK、核蛋白NF-B的表達而抑制Spry1的表達。但是，Lenti-mir21-down能夠抑制p-ERK、核蛋白NF-B的表達而促使Spry1的表達，差異有統(tǒng)計學意義。圖6 Mir-21激活Spry1/ERK/NF-B通路。A. Lenti-mir21-up能夠促進p-ERK、核蛋白NF-B的表達而抑制Spry1的表達。B. Lenti-mir21-down能夠抑制p-ERK、核蛋白NF-B的表達而促使Spry1的表達，n=

33、3,* VS lenti-NC,P<0.05。7 Lenti-mir21-up能夠激活NLRP3炎癥小體，Lenti-mir21-down能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化原代小鼠肝細胞分別轉(zhuǎn)染Lenti-mir21-up、Lenti-mir21-down以及各自的Lenti-NC病毒，收集細胞，提取細胞總蛋白進行WB實驗，檢測NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達量。結(jié)果顯示：Lenti-mir21-up能夠促進NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達。但是，Lenti-mir21-down能夠抑制NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達，差異有統(tǒng)計

34、學意義。圖7 Mir-21激活NLRP3炎癥小體。A. Lenti-mir21-up能夠促進NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達。B. Lenti-mir21-down能夠抑制NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達，n=3,* VS lenti-NC,P<0.05。8 Lenti-mir21-up能夠誘導原代肝細胞脂肪變性，Lenti-mir21-down能夠抑制原代肝細胞脂肪變原代小鼠肝細胞分別轉(zhuǎn)染Lenti-mir21-up、Lenti-mir21-down以及對應(yīng)的Lenti-NC病毒，48小時后去掉培養(yǎng)基進行油紅O染色，結(jié)果顯示，與Lenti-NC組

35、相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-up病毒的肝細胞紅色面積增大，而轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-down病毒的肝細胞紅色面積減小。同時，收集細胞檢測肝細胞甘油三酯的含量，結(jié)果顯示，Lenti-mir21-up病毒能夠升高肝細胞甘油三酯的含量，而Lenti-mir21-down病毒能夠抑制肝細胞甘油三酯的含量。圖8 Mir-21促使原代小鼠肝細胞脂肪變。A. 原代小鼠肝細胞油紅O染色，轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-up病毒的肝細胞發(fā)生了脂肪變，Lenti-mir21-down能夠抑制肝細胞脂肪變的發(fā)生。B. 檢測原代小鼠肝細胞甘油三酯的含量，Lenti-mir21-up病毒能夠升高原代小鼠肝細

36、胞甘油三酯的含量，lenti-mir-21-down能夠抑制原代小鼠肝細胞甘油三酯的生成。n=3,* VS lenti-NC,P<0.05。9 油酸能夠促進原代肝細胞miR-21的表達別離培養(yǎng)原代小鼠肝細胞，用油酸誘導肝細胞脂肪變性，收集細胞提取總RNA，用熒光定量PCR檢測細胞中miR-21的表達量。結(jié)果顯示，細胞在油酸刺激后細胞中miR-21的表達升高，說明油酸能夠促進原代肝細胞miR-21的表達。圖9油酸能夠促進原代肝細胞mir-21的表達。qRT-PCR檢測肝組織中mir-21的含量。 n=3, * VS Control, P<0.05。10 Mir-21通過激活NLRP3

37、炎癥小體誘導原代肝細胞脂肪變原代小鼠肝細胞分別轉(zhuǎn)染Lenti-mir21-up與對應(yīng)的Lenti-NC病毒、si-NLRP3或者是VX-765刺激，48小時后去掉培養(yǎng)基進行油紅O染色以及收集細胞檢測細胞甘油三酯的含量，結(jié)果顯示，與Lenti-NC組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-up病毒的肝細胞紅色面積增大以及細胞甘油三酯含量升高，而轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+ si-NLRP3和Lenti-NC+VX-765的肝細胞紅色面積減小以及細胞甘油三酯含量降低。與Lenti-mir21-up組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+ si-NLRP3或者Lenti-NC+VX-765的肝細胞紅色面積減小以及細

38、胞甘油三酯含量降低。 圖10 Mir-21通過激活NLRP3炎癥小體誘導原代肝細胞脂肪變。A. 原代小鼠肝細胞油紅O染色，與Lenti-NC組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-up病毒的肝細胞紅色面積增大，而轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+ si-NLRP3和Lenti-NC+VX-765的肝細胞紅色面積減小。與Lenti-mir21-up組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+ si-NLRP3或者Lenti-NC+VX-765的肝細胞紅色面積減小。B. 檢測原代小鼠肝細胞甘油三酯的含量，與Lenti-NC組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-mir21-up病毒的肝細胞甘油三酯含量升高，而轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+

39、si-NLRP3和Lenti-NC+VX-765的肝細胞甘油三酯含量降低。與Lenti-mir21-up組相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-NC+ si-NLRP3或者Lenti-NC+VX-765的肝細胞甘油三酯含量降低。n=3, * VS lenti-NC, & VS Lenti-mir21-up, P<0.05。11 高脂飲食能夠誘導miR-21的表達健康雄性C57小鼠48只，小鼠分為對照組Control、高脂飲食組HFD、高脂飲食+lenti-NC組HFD+lenti-NC、高脂飲食+ lenti-mir-21-down組HFD+lenti-mir-21-down，每組12只。HD

40、F組小鼠喂食高脂肪飼料。HFD+lenti-NC組動物給予高脂肪含量飼料飲食，同時沿鼠尾靜脈注入lenti-NC病毒。HFD+lenti-mir-21-down組動物給予高脂肪含量飼料飲食以及沿鼠尾靜脈注入lenti-mir-21-down病毒。圖11 檢測小鼠肝組織標本中mir-21 的表達量。qRT-PCR檢測肝組織中mir-21的含量。 n=12, * VS Control, & VS HFD, P<0.05。12 高脂飲食能夠激活Spry1/ERK/NF-B通路，miR-21下調(diào)病毒能夠抑制Spry1/ERK/NF-B通路的活化健康雄性C57小鼠48只，小鼠分為對照組Co

41、ntrol、高脂飲食組HFD、高脂飲食+lenti-NC組HFD+lenti-NC、高脂飲食+ lenti-mir-21-down組HFD+lenti-mir-21-down，每組12只。HFD+lenti-NC組動物給予高脂肪含量飼料飲食，同時沿鼠尾靜脈注入lenti-NC病毒。HFD+lenti-mir-21-down組動物給予高脂肪含量飼料飲食以及沿鼠尾靜脈注入lenti-mir-21-down病毒。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠肝組織中ERK的磷酸化水平、核蛋白NF-B的表達水平比對照組要高，而miR-21靶基因蛋白Spry1表達水平比對照組要低，差異有統(tǒng)計學意義。與HFD組

42、相比，HFD+lenti-mir-21-down組小鼠肝組織中ERK的磷酸化水平、核蛋白NF-B的表達水平比對照組低，而miR-21靶基因蛋白Spry1表達水平比HFD組要高，差異有統(tǒng)計學意義。 圖12 檢測小鼠肝組織中Spry1/ERK/NF-B通路的活性。小鼠肝組織WB實驗結(jié)果，在HFD組小鼠肝組織里面p-ERK、核蛋白NF-B的表達卻比對照組高，但是Spry1的表達卻比對照組低。lenti-mir-21-down能夠逆轉(zhuǎn)HFD所產(chǎn)生的效應(yīng)。n=12, * VS Control, & VS HFD, P<0.05。13 Lenti-mir21-down能夠抑制高脂飲食所誘導的

43、NLRP3炎癥小體的活化健康雄性C57小鼠48只，小鼠分為對照組Control、高脂飲食組HFD、高脂飲食+lenti-NC組HFD+lenti-NC、高脂飲食+ lenti-mir-21-down組HFD+lenti-mir-21-down，每組12只。HFD+lenti-NC組動物給予高脂肪含量飼料飲食，同時沿鼠尾靜脈注入lenti-NC病毒。HFD+lenti-mir-21-down組動物給予高脂肪含量飼料飲食以及沿鼠尾靜脈注入lenti-mir-21-down病毒。Western blot、IHC檢測肝組織NLRP3炎癥小體、Caspase1、ASC、IL-1的表達水平。Western

44、 blot、IHC檢測實驗結(jié)果顯示，HFD組小鼠肝組織中NLRP3炎癥小體、Caspase1、ASC、IL-1的表達水平比對照組要高，差異有統(tǒng)計學意義。與HFD組相比，HFD+lenti-mir-21-down組小鼠肝組織中NLRP3炎癥小體、Caspase1、ASC、IL-1的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義。圖13.1 檢測小鼠肝組織標本中NLRP3炎癥小體活化水平。小鼠肝組織標本的WB實驗結(jié)果，在HFD組小鼠肝組織里面NLRP3、具有活性的Caspase1P10、ASC、IL-1前體的和具有活性的IL-1P17的表達卻比對照組高，lenti-mir-21-down能夠逆轉(zhuǎn)HFD所產(chǎn)生的效應(yīng)

45、。n=12, * VS Control, & VS HFD, P<0.05。圖13.2 免疫組化檢測小鼠肝組織標本中NLRP3炎癥小體活化水平。小鼠肝組織標本的免疫組化實驗結(jié)果，在HFD組小鼠肝組織里面NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1的表達比對照組高，lenti-mir-21-down能夠逆轉(zhuǎn)HFD所產(chǎn)生的效應(yīng)。圖13.3免疫組化檢測小鼠肝組織里面NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1表達的統(tǒng)計結(jié)果。n=12, * VS Control, & VS HFD, P<0.05。14 Lenti-mir21-down能夠抑制高脂飲食所誘導的脂肪變健康

46、雄性C57小鼠48只，小鼠分為對照組Control、高脂飲食組HFD、高脂飲食+lenti-NC組HFD+lenti-NC、高脂飲食+ lenti-mir-21-down組HFD+lenti-mir-21-down，每組12只。HFD+lenti-NC組動物給予高脂肪含量飼料飲食，同時沿鼠尾靜脈注入lenti-NC病毒。HFD+lenti-mir-21-down組動物給予高脂肪含量飼料飲食以及沿鼠尾靜脈注入lenti-mir-21-down病毒。H&E染色以及油紅O染色，結(jié)果顯示，在HFD組肝組織中有大量的脂肪滴的形成，與HFD組相比，lenti-mir-21-down組中脂肪滴的形成

47、減少。同時檢測相應(yīng)小鼠肝組織以及血液中甘油三酯的含量，結(jié)果顯示，在HFD組的肝組織以及血液中甘油三酯的含量比對照組要高，與HFD組相比，lenti-mir-21-down組中甘油三酯的含量降低。圖14 檢測小鼠肝臟脂肪變的程度。A. 小鼠肝組織H&E染色以及油紅O染色，在HFD組小鼠的肝組織中有大量的脂肪滴的形成。B, C. 小鼠肝組織以及血液中甘油三酯的含量。在HFD組小鼠肝組織以及血液中甘油三酯的含量比對照組高，lenti-mir-21-down能夠逆轉(zhuǎn)HFD所產(chǎn)生的效應(yīng)。n=12, * VS Control, & VS HFD, P<0.05。碩士學位論文 前言討論

48、慢性肝病早已經(jīng)成為全球公共問題，時刻威害人類的健康。在我國，慢性肝病的患病率持續(xù)上升，隨著經(jīng)濟開展水平的不斷提高，人民現(xiàn)在變得越來越富裕，生活質(zhì)量得到很大的改善，人民的飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了很大的變化，以高脂、高營養(yǎng)飲食為主以及過量飲酒，由此原因所引發(fā)導致的酒精性脂肪肝的發(fā)病率也逐年增加。脂肪肝進一步開展為肝纖維化以及肝硬化，如果不加以干預，甚至可以開展為肝細胞癌，這些同樣威脅著人民的健康和經(jīng)濟社會的開展與繁榮。因此，積極探尋非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、開展的分子機制，不僅是我們目前面臨的重大課題，而且可以保障我國有限的醫(yī)療資源、促進經(jīng)濟社會健康有序開展。非編碼RNANon-coding RNA是指不

49、編碼蛋白質(zhì)的RNA。包括miRNA、rRNA，snRNA、tRNA、snoRNA等多種功能的RNA，和其他一些功能沒有被發(fā)現(xiàn)的RNA。這些RNA的共性就是都來自于基因組，但是不能翻譯蛋白，在RNA層面發(fā)揮自己的生物學功能。從長度上來講，非編碼RNA可以分為3類：小于50個核苷酸，包括microRNA，siRNA，piRNA；50個核苷酸到500個核苷酸，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等。在腫瘤方面的研究中，許多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)，但是，在非酒精性脂肪肝方面的研究還不是很多。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達可介導胰島素信號通路的傳導，誘導IR，導致

50、肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積，從而促進非酒精性脂肪肝的形成，但這領(lǐng)域的研究尚在起步階段，結(jié)果也不統(tǒng)一18。MiR-21是miRNA系列中的重要成員之一，廣泛的研究使其成為研究最透徹的miRNA之一。通過對miR-21表達譜的研究，在各消化道、呼吸道、泌尿系統(tǒng)、淋巴血液系統(tǒng)等腫瘤中與正常組織具有顯著的表達差異14, 15。同時miR-21也能促進脂肪和糖類代謝紊亂所致的非酒精性脂肪肝的發(fā)生17。在我們的實驗研究中，與對照組相比，脂肪肝患者的肝組織miR-21的表達以及高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝的小鼠肝組織中miR-21的表達明顯升高，下調(diào)miR-21的表達時能夠抑制高脂飲食誘導的NALFD的發(fā)生，同時

51、油酸刺激原代小鼠肝細胞后能夠誘導miR-21的表達，說明miR-21可以誘導NAFLD的發(fā)生。眾所周知，“二次打擊學說是NAFLD/NASH發(fā)生、開展的重要機制，包括以“胰島素抵抗為主的“一次打擊和以“氧化應(yīng)激為主的 “二次打擊?！暗诙未驌糁饕且驗榘l(fā)生氧化應(yīng)激，促使活性氧ROS的大量生成，導致脂質(zhì)沉積和炎癥小體的釋放、產(chǎn)生無菌性炎癥。所以，炎癥小體蛋白介導了非酒精性脂肪肝的發(fā)生開展過程。在我們的課題實驗研究中，與對照組相比，脂肪肝患者的肝組織中NLRP3炎癥小體的組份NLRP3、Caspase1、ASC和IL-1的表達以及高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝的小鼠肝組織中NLRP3、/Caspas

52、e1、/ASC和IL-1的表達明顯升高。有大量實驗研究說明：miR-21能夠通過作用及調(diào)控于靶基因Spry1激活NLRP3炎癥小體，進而誘導肝纖維化的發(fā)生。然而，miR-21是否能夠通過激活NLRP3炎癥小體誘導非酒精性脂肪肝的發(fā)生？基于這一問題的，我們設(shè)計并進行了臨床、小鼠體外體內(nèi)實驗，原代小鼠肝細胞轉(zhuǎn)染miR-21/UP的病毒能促使細胞炎癥小體組份NLRP3、Caspase1、IL-18、ASC和IL-1等的表達以及脂肪變；與此相反，當轉(zhuǎn)染miR-21/down病毒能夠抑制細胞炎癥小體組分NLRP3、Caspase1、ASC和IL-1的表達以及脂肪變。當用NLRP3干擾RNA以及Caspase1的抑制劑VX-765把炎癥小體組成成分進行沉默或者是抑制后能夠緩解miR-21上調(diào)所引起的細胞脂肪變。在小鼠體內(nèi)，鼠尾靜脈注射m