黃曲霉毒素的測定ELISA法

1、黃曲霉毒素的測定ELISA法測試前請仔細閱讀本說明在28冷藏不要凍結(jié)1.簡介 黃曲霉毒素黃曲霉毒素是一種劇毒且致癌的物質(zhì)，它是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株產(chǎn)生的。黃曲霉毒素有四種類型：B1，B2，G1和G2。黃曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。最容易產(chǎn)生黃曲霉毒素污染的物質(zhì)是谷物、花生、棉子、高梁和大多數(shù)的樹果。動物食入過量黃曲霉毒素的影響從慢性健康直到死亡，已經(jīng)證明黃曲霉毒素能引起肝損壞或癌癥、降低奶和蛋的產(chǎn)出、免疫抑制和干擾再生效率。美國食品藥物管理局已經(jīng)規(guī)定了食品和飼料中最大黃曲霉毒素限量。因此，準確測定黃曲霉毒素的含量，對于監(jiān)測可能發(fā)生黃曲霉毒素污染的食品和飼料的質(zhì)量來說，是非常

2、重要的。測試程序包括仔細的采樣、化學提取、衛(wèi)生學評價和定量分析。美國食品藥物管理局已經(jīng)頒布的黃曲霉毒素限量如下：適用對象限量物質(zhì)人20ppb除牛奶外的所有食品所有動物20ppb所有飼料（下列除外）除外：種牛，種豬，成熟的家禽100ppb谷物育肥期的豬（100磅）200ppb谷物育肥期的菜牛300ppb谷物育肥期的菜牛、豬、家禽300ppb棉籽粉2.方法原理本測試盒的測試原理是一種競爭性的直接酶聯(lián)免疫吸附劑測試方法（ELISA），可準確檢測出樣品中ppb級的黃曲霉毒素。樣品和標準控制液中游離的黃曲霉毒素與軛合物中的黃曲霉毒素競爭抗體結(jié)合位置。清洗后，加入底物，底物與軛合物反應出現(xiàn)蘭色，蘭色越深表

3、明黃曲霉毒素越少。將其置于微型孔閱讀器中可讀出透光度，以控制標準液的透光度作標準曲線，將樣品的透光度與標準曲線比較計算出樣品中黃曲霉毒素的準確濃度。 3.貯存要求本試劑盒存放在28時，可以一直使用到標簽上注明的到期日期。4.試劑與儀器4.1提供的材料48個包被了抗體的孔；48個紅色標記的混合孔；4瓶1.5ml濃度為0、5、15、50ppb黃曲霉毒素控制標準液(黃色標簽)（甲醇溶液的處理，見注意事項）；1瓶7ml黃曲霉毒素-HRP軛合物溶液(蘭色標簽)；1瓶24mlK蘭底物溶液(綠色標簽)；1瓶32ml紅色 (紅色標簽)。4.2需要但未提供的材料70%甲醇溶液；100ml量筒；150ml的具塞三

4、角瓶；濾紙；樣品收集具塞試管；漏斗；粉碎機；稱量為525克的秤；帶450nm濾光片的酶標儀；200l移液器；200l吸咀；紙巾或等效的吸水材料；計時器；防水記號筆；洗瓶；移液器用的試劑槽；蒸餾水或去離子水；12通道移液器5.注意事項甲醇易燃，其容器應密閉并遠離熱、火花、明火和煙。如果吞下或吸入蒸氣，它是有毒的。應避免與皮膚接觸。本測試盒不使用時應在28下存放。不要使用過期的測試盒。不要把不同測試盒中的試劑混合使用。遵守正確的移液技術(shù)，包括取液前先用該液潤洗一次。放置時間與本說明不一致時，可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。測試盒應先恢復到室溫狀態(tài)(1830)后才開始使用。避免測試盒在室溫下長時間放置。不要使

5、測試盒凍結(jié)。應將包括樣品提取液在內(nèi)的所有廢液和實驗器皿進行處理（如同已被黃曲霉毒素污染一樣）。應始終穿戴手套和其它防護服。為了避免交叉污染，每個樣品應使用清潔的吸咀和玻璃器皿，并在樣品之間徹底清洗所有的玻璃器皿。待測樣品的pH值應為68。酸堿過大的樣品應進行調(diào)整。關(guān)于pH值的調(diào)整，請技術(shù)服務部門聯(lián)系。每次試驗不要超過24孔。6.程序性的提示K-蘭底物隨時可用，底物為清亮的淺蘭色，如果變成了深蘭，則棄去。使用時，只倒出所需量到試劑槽中，未用完的不要再倒回試劑瓶中。不使用時應蓋住試劑槽，以避免光的照射。7.操作步驟7.1樣品制備和提取待測樣品應按公認的采樣技術(shù)采集。樣品應磨碎并充分混合后再提取。測

6、試前，將樣品在28存放。按以下程序進行：1 將7份分析級甲醇與3份蒸餾水或去離子水混合配成70%的甲醇溶液。取1份代表性樣品。研磨樣品至至少有75%的樣品通過20目的篩子，顆粒尺寸大約相當于細的速溶咖啡。把5克研磨過的樣品加入到25ml 70%的甲醇中，然后用力搖動15分鐘。用濾紙過濾出至少5ml的提取液。該濾液即為樣品的待測液。該待測液即可用于測試。7.2測試程序測試前應將所有的試劑恢復至室溫（1830）。7.2.1從箔包中取紅色標記混合孔，放在孔架上。7.2.2取同樣數(shù)量的包被了抗體的孔。把暫不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保護抗體。7.2.3在使用之前搖動試劑瓶，混合每種試劑。7.

7、2.4從蘭色標簽瓶內(nèi)吸取100l軛合物加到每個紅色標記的混合孔內(nèi)。棄去吸咀。7.2.5每次使用新吸咀，吸取100l控制標準溶液和樣品液按下列順序加到紅色標記的混合孔內(nèi) 7.2.6用12道移液器吸入、排出3次使孔內(nèi)溶液徹底混合，吸取100l加到相應的包被了抗體的孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動確保充分混合1020秒鐘，不要濺出試劑，混合后于室溫下（1830）放置2分鐘。7.2.7倒掉包被了抗體孔內(nèi)的溶液。在每個孔內(nèi)加滿蒸餾水或去離子水，再倒掉，如此重復5次，將板朝下，在吸水材料上拍擊以去除所有的水滴。7.2.8從綠色試劑瓶中倒出所需量的試劑到試劑槽中。7.2.9用12道移液器和新吸咀，吸取100l底物加到每個孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動確保充分混合1020秒鐘。7.2.10混合后放置1.5分鐘。倒掉試劑槽中剩余的底物并沖洗試劑槽。7.2.11從紅色試劑瓶（終止液）中倒出所需量的試劑到試劑槽中。7.2.12用12通道移液器吸出過量的底物溶液，再吸取100l紅色終止液加到每個微孔內(nèi)，在平的表面上將板前后滑動確保充分混合。7.2.13用干凈的布擦凈板底，將板置于微型孔閱讀器于450nm濾光片下讀數(shù)。由于氣泡會影響結(jié)果，應削除溶液中氣泡。應在加入終止液后2