結(jié)締組織生長因子單鏈抗體對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度及羥脯氨酸含量的影響

1、結(jié)締組織生長因子單鏈抗體對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度及羥脯氨酸含量的影響         11-03-25 11:48:00     編輯：studa20                 作者：劉朝朝，王西華，吳國球，茍麗霞【摘要】  目的:研究結(jié)締組織生長因子(CTGF)單鏈抗體(ScFv)對博萊霉素誘

2、導(dǎo)的肺纖維化小鼠的治療作用。方法：昆明小鼠36只，隨機分為對照組、模型組和治療組，每組12只;對照組氣管內(nèi)滴入生理鹽水，模型組和治療組氣管內(nèi)滴入博萊霉素(5 mg·kg-1)制備肺纖維化模型。第2天開始治療組尾靜脈注射ScFv(4 mg·kg-1)，對照組和模型組給予等量的生理鹽水(約100 l·次-1)，3次·周-1。第14、28天分兩批處理動物，用HE染色行病理組織學(xué)檢查并進(jìn)行纖維化分級，用酸水解法測定肺組織羥脯氨酸的含量。結(jié)果：對照組小鼠肺組織無纖維化形成;模型組肺組織可見肺泡破壞，肺泡間隔大量纖維化，肺組織中羥脯氨酸含量及纖維化程度較對照組明顯增

3、高(P<0.01)。治療組肺組織纖維化程度較模型組明顯減輕，且羥脯氨酸含量較模型組顯著降低(P<0.01)。結(jié)論：ScFv作為CTGF單鏈抗體可明顯減輕纖維化程度，有可能成為治療肺纖維化一種新的藥物。 【關(guān)鍵詞】  結(jié)締組織生長因子單鏈抗體; 羥脯氨酸; 肺纖維化; 小鼠Abstract Objective: To investigate therapeutic effect of singlechain variable fragment(ScFv) against connective tissue grouth factor(CTGF) on bleomycinin

4、duced pulmonary fibrosis of Kunming mice. Methods： 36 Kunming mice were randomly divided into three groups: the control group, the model group and the treatment group, 12 rats in each group. Mice in the control group were injected with normal saline via trachea, mice in the model and treatment group

5、 were injected with bleomycin(5 mg·kg-1) via trachea for preparing models. Then, mice the treatment group were injected with ScFv(4 mg·kg-1) via intravenous, and the mice in the other groups were injected with normal saline(about 100 l·time-1)via intravenous, 3 times·week-1. Afte

6、r be modeled 14 and 28 days, dealing with animals by hematoxylineosin staining for histopathological examination and fibrosis grade, by acid hydrolysis for assaying lung hydroxyproline content. Results： There was no pulmonary fibrosis in the control group; in the model group, a large number of alveo

7、lus damaged, alveolar septum fibrosis, hydroxyproline content and fibrosis were significantly higher than that in the control group(P<0.01); in the treatment group, lung fibrosis was significantly alleviated and the content of hydroxyproline was significantly lower than that in the model group(P&

8、lt;0.01). Conclusion： ScFv against CTGF can delay the fibrosis, which may become a new cure for pulmonary fibrosis.Key words singlechain variable fragment against connectwe tissue growth factor; hydroxyproline; pulmonary fibrosis; mice肺纖維化是嚴(yán)重威脅人類健康的致死性肺部疾病，病人平均生存時間為35年。目前特發(fā)性肺纖維化病人呈逐年增多的趨勢1-3,其病變以肺間質(zhì)

9、中間質(zhì)細(xì)胞的異常增殖、彌漫性或局限性成纖維細(xì)胞灶(主要由成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞組成)的存在為主要病理特征。研究證實成纖維細(xì)胞灶的數(shù)量與肺功能的減退、病情的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)4。目前尚無有效的內(nèi)科治療手段可以逆轉(zhuǎn)或者緩解自然病程的進(jìn)展。鑒于結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)在成纖維細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用，因此，本實驗?zāi)康脑谟谕ㄟ^拮抗CTGF在肺纖維化中的作用尋找肺纖維化新的治療方法。本實驗利用博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，通過監(jiān)測各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量及肺纖維化程度評分，觀察CTGF單鏈抗體(ScFv)對小鼠肺纖維化的作用

10、。1 材料和方法1.1 實驗動物及試劑昆明小鼠36只，雌性，平均體質(zhì)量(18±1) g，購于南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心;博萊霉素(15 mg·支-1)，為日本化藥株式會社產(chǎn)品;ScFv由本實驗室通過基因工程技術(shù)獲得;羥脯氨酸試劑盒由南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。1.2 肺纖維化模型制作及標(biāo)本采集參照文獻(xiàn)5報道制作小鼠肺纖維化模型。實驗小鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組12只。對照組小鼠予50 l生理鹽水氣管內(nèi)滴入,模型組和治療組小鼠予博萊霉素(5 mg·kg-1)緩慢氣管內(nèi)滴入。第2天開始，治療組小鼠尾靜脈注射ScFv(4 mg·kg-1)，模型組及

11、對照組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水(約100 l·次-1)，3次·周-1。3組小鼠分別于第14、28 天，通過腹主動脈放血各處死6只。開胸取肺，將右下肺以100 g·L-1中性福爾馬林固定,包埋、切片;左肺和右中上肺分別置液氮中保存?zhèn)溆谩?.3 肺組織形態(tài)學(xué)分析將小鼠右下肺固定于100 g·L-1中性福爾馬林24 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后制作成石蠟切片(厚度約4 m)，HE染色后觀察肺組織病理學(xué)改變，了解肺組織纖維化程度。由病理科醫(yī)生在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化(雙盲法)，根據(jù)Szapiel等6方法，將肺纖維化程度分級如下：(1) 無纖維化(-);(2) 輕度肺纖維化(+),病變范圍<20%,累及胸膜及胸膜下肺實質(zhì)，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;(3) 中度肺纖維化(+)，病變范圍20%50%，肺纖維化從胸膜開始蔓延，但仍屬局部;(4) 重度肺纖維化(+)，彌散性肺纖維化，病變范圍>50%，融合損傷伴廣泛肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。肺纖維化程度計分：(-)為0分，(+)為1分，(+)為2分，(+)為3分。1.4 羥脯氨酸含量測定每個肺組織樣本均稱取30 mg，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最終測得各個樣本羥脯氨酸的吸光