第六節(jié)免疫標(biāo)記技術(shù)

1、第十一章 血清學(xué)試驗(yàn) 第六節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫標(biāo)記 技術(shù)是利用抗原抗體反響的特異性和標(biāo)記分子極易檢測的高度敏 感性相結(jié)合形成的試 驗(yàn)技術(shù)。 免疫標(biāo)記技術(shù)主要有熒光抗體標(biāo)記技術(shù)、 酶標(biāo)抗體 技術(shù)和同位素標(biāo)記抗體 技術(shù)。它們的敏感性和特異性大大超過常規(guī)血清學(xué)方法， 現(xiàn)已廣泛用于傳染病的診斷、 病原微生物的鑒定、 分子生物學(xué)中基因表達(dá)產(chǎn)物分 析等領(lǐng)域。 其中酶標(biāo)抗體技術(shù)最 為簡便， 應(yīng)用較廣。 這里主要介紹熒光抗體標(biāo)記 技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù)。一、熒光抗體標(biāo)記技術(shù)熒光抗體標(biāo)記技術(shù) fluorescent-labelled antibody technicque 是用熒 光色素 標(biāo)記在抗體或抗原上， 與

2、相應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合， 然后用熒光顯微 鏡觀察所 標(biāo)記的熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。一原理 熒光素在 10-6 的超低濃度時(shí)，仍可被專門的短波光源激發(fā)，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光。熒光抗體標(biāo)記技術(shù)就是將抗原抗體反響的特異性、 熒光檢測 的高敏性、以及顯微鏡技術(shù)的精確性三者結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。二熒光色素 熒光色素是能產(chǎn)生明顯熒光， 又能作為染料使用的有機(jī)化 合物。 主要是以苯環(huán)為根底的芳香族化合物和一些雜環(huán)化合物。 它們受到激發(fā)光 如紫外 光 照射后，可發(fā)射熒光?？捎糜跇?biāo)記的熒光色素有異硫氰酸熒光黃 FITC 、四乙基羅丹明 RB 200 和四甲基異硫氰酸羅丹明 TMRIT

3、C 。其中 FITCM 用最廣，為黃色結(jié)晶，最大吸 收 光波長為490? 495nm,最大發(fā)射光波長520? 530nm可呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC 分子中含有異硫氰基，在堿性 pH9.0? 9.5條件下能與 IgG 分子的自由氨基 結(jié)合， 形成 FITC-IgG 結(jié)合物，從而制成熒光抗體?？贵w經(jīng)熒光色素標(biāo)記后， 不影響與抗原的結(jié)合能力和特異性。 當(dāng)熒光抗體與 相 應(yīng)的抗原結(jié)合時(shí)， 就形成了帶有熒光性的抗原抗體復(fù)合物， 從而可在熒光顯微 鏡下 檢出抗原的存在。三熒光抗體染色及熒光顯微鏡檢查 1標(biāo)本片的制備 標(biāo)本制作的要求首先 是保持抗原的完整性，并盡可能減 少形態(tài)變化， 抗原位置保持不變。

4、 同時(shí)還必須使 抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物易于接受激 發(fā)光源，以便很好地觀察和記錄。 這就要求標(biāo)本要 相當(dāng)薄， 并要有適宜的固定處 理方法。根據(jù)被檢樣品的不同，采用不同的制備方法。細(xì)菌培養(yǎng)物、血液、膿汁、糞 便、 尿沉渣及感染的動(dòng)物組織等， 可制成涂片或壓印片。 感染組織最好制成冰凍 切片或 低溫石蠟切片。也可用生長在蓋玻片上的單層細(xì)胞培養(yǎng)作標(biāo)本。標(biāo)本的固定有兩個(gè)目的， 一是防止被檢材料從玻片上脫落， 二是消除抑制抗 原 抗體反響的因素。最常用的固定劑是丙酮和 95%勺乙醇。固定后用 PBS 反復(fù)沖洗, 干 后即可用于染色。2染色方法 熒光抗體染色法有多種類型， 常用的有直接法和間接法兩種。1直接法

5、取待檢抗原的標(biāo)本片，滴加熒光抗體染色液于其上，置濕盒 中，于 37C作用30min ,用pH7.2的PBS?漂洗15min ,沖去游離的染色液，枯燥后 滴加緩沖 甘油分析純甘油 9 份加 PBS1 份封片，在熒光顯微鏡下觀察。標(biāo)本片 中假設(shè)有相應(yīng)抗原存在， 即可與熒光抗體結(jié)合， 在鏡下見有熒光抗體圍繞在受檢的 抗原周圍，發(fā) 出黃綠色熒光 圖 11-8 。直接法應(yīng)設(shè)以下對照，標(biāo)本自發(fā)熒光對照，陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本對照。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡便、特異性高，非特異性熒光染 色少。缺點(diǎn)是敏感性 偏低，而且每檢一種抗原就需要制備一種熒光抗體。2間接法 取待檢抗原的標(biāo)本，首先滴加特異性抗體，置濕盒中，于37C 作用

6、30min ,用pH7.2的PBS?漂洗后，再滴加熒光色素標(biāo)記的第 2抗體抗抗體染 色，再置濕盒中，于37E作用30min,用PBS?漂洗，枯燥后封片鏡檢。陽性者 形成 抗原 -抗體-熒光抗抗體復(fù)合物 ,發(fā)黃綠色熒光 圖 11-9 。間接法對照除自 發(fā)熒光、 陽性和陰性對照外， 首次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)無中間層對照 標(biāo)本加標(biāo)記抗抗體 和陰性血 清對照中間層用陰性血清代替特異性抗血清。間接法的優(yōu)點(diǎn)是， 比直接法敏感， 對一種動(dòng)物而言， 只需制備一種熒光抗抗 體， 即可用于多種抗原或抗體的檢測，鏡檢所見熒光也比直接法明亮。3抗補(bǔ)體法 將抗血清與補(bǔ)體等量混合，滴加于待檢抗原的標(biāo)本片上， 使 其形成抗原 -抗體

7、-補(bǔ)體復(fù)合物，漂洗后再滴加熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體染色 ?， 感作一 定時(shí)間，漂洗、枯燥后鏡檢。此法特異性和敏感性均高，但易產(chǎn)生非特異 性熒光。3熒光顯微鏡檢查 標(biāo)本滴加緩沖甘油后用蓋玻片封載，即可在熒光顯微 鏡下觀 察。 熒光顯微鏡不同于光學(xué)顯微鏡之處， 在于它的光源是高壓汞燈或溴鎢 燈，并有 一套位于集光器與光源之間的激發(fā)濾光片， 它只讓一定波長的紫外光及 少量可見光 藍(lán)紫光通過。此外，還有一套位于目鏡內(nèi)的屏障濾光片，只讓激 發(fā)的熒光通過， 而不讓紫外光通過， 以保護(hù)眼睛并能增加反差。 為了直接觀察微 量滴定板中的抗原 抗體反響， 如感染細(xì)胞培養(yǎng)物上的熒光， 可使用現(xiàn)已有商品的 倒置熒光顯微鏡

8、觀察。四熒光抗體標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用 熒光抗體標(biāo)記技術(shù)具有快速、 操作簡單的 特 點(diǎn)，同時(shí)又有較高的敏感性、特異性和直觀性，已廣泛用于細(xì)菌、病毒、原蟲 的鑒定 和傳染病的快速診斷。 此外還可用于淋巴細(xì)胞外表抗原的測定和自身免疫 病的診斷 等方面。1細(xì)菌病診斷 能利用熒光抗體標(biāo)記技術(shù)直接檢出或鑒定的細(xì)菌約有 30 余 種， 均具有較高的敏感性和特異性， 其中較常應(yīng)用的是鏈球菌、 致病性大腸桿菌、 沙門 氏菌、馬鼻疽桿菌、豬丹毒桿菌等。動(dòng)物的糞便、黏膜拭子涂片、病變部滲 出物、體 液或血液涂片、病變組織的觸片或切片以及尿沉渣均可作為檢測樣本， 經(jīng)直接法檢出 目的菌，這對于細(xì)菌病的診斷具有很高的價(jià)值。2病

9、毒病診斷 用熒光抗體標(biāo)記技術(shù)直接檢出患畜病變組織中的病毒，已 成為病 毒感染快速診斷的重要手段， 如豬瘟、 雞新城疫等可取感染組織做成冰凍 切片或觸 片，用直接或間接免疫熒光染色可檢出病毒抗原，一般可在 2h 內(nèi)作出診斷報(bào)告；豬流行性腹瀉在臨床上與豬傳染性腸胃炎十分相似，將患病小豬小腸冰 凍切片，用豬流行性腹瀉病毒的特異性熒光抗體做直接免疫熒光檢查， 即可對豬 流行 性腹瀉進(jìn)行確診。二、酶標(biāo)抗體技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù) enzyme-labelled antibody technicque 是繼免疫熒光技 術(shù)之 后開展起來的一大新型的血清學(xué)技術(shù)， 目前該技術(shù)已成為免疫診斷、 檢測和 分子生 物學(xué)研究中

10、應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。一原理 酶標(biāo)抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反響的特異性和酶催化反響的高 度敏 感性而建立起來的免疫檢測技術(shù)。 酶是一種有機(jī)催化劑， 催化反響過程中不 被消耗， 能反復(fù)作用， 微量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過程， 如果產(chǎn)物為有色可見 產(chǎn)物，那么極 為敏感。酶標(biāo)抗體技術(shù)的根本程序是： 將酶分子與抗原或抗體分子共價(jià)結(jié)合， 這種 結(jié) 合既不改變抗體的免疫反響活性， 也不影響酶的催化活性。 將此種酶標(biāo)記的 抗體 抗抗體與存在于組織細(xì)胞或吸附在固相載體上的抗原抗體發(fā)生特異 性結(jié)合， 并洗下未結(jié)合的物質(zhì)。滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色， 但在底物水解過程中由另外的供氫

11、體提供氫離子， 使供氫體由 無色的復(fù)原型 變?yōu)橛猩难趸停?呈現(xiàn)顏色反響。 因而可通過底物的顏色反響來 判定有無相應(yīng)的 免疫反響發(fā)生。 顏色反響的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原 抗體的量 呈正比。此種有色 產(chǎn)物可用肉眼或在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下看到， 或用分光 光度計(jì)加以測定。 這 樣，就將酶化學(xué)反響的敏感性和抗原抗體反響的特異性結(jié)合 起來，用以在細(xì)胞或亞細(xì) 胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位， 或在微克、 納克 水平上測定它們的量。 所 以，本法既特異又敏感， 是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免 疫檢測方法之一。二用于標(biāo)記的酶 用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶 HRP 、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以 HR

12、 應(yīng)用最廣泛，其次是堿性磷酸酶。 HR 廣泛分布于植 物 界，辣根中含量最高。 HR 是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖 蛋白， 分子量為 40 000 。 HRP 勺作用底物是過氧化氫，常用的供氫體有鄰苯二胺0PD和 33-二氨基聯(lián)苯胺 DAB ，二者作為顯色劑。因?yàn)樗鼈兡茉?HR 催化 HQ 生成 HO 過程中提供氫，而自己生成有色產(chǎn)物。QP 氧化后形成可溶性產(chǎn)物， 呈橙色，最大吸收波長為 492nm 可用肉眼判定。 QP 不穩(wěn)定，須現(xiàn)用現(xiàn)配，常作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的顯色劑。QP 有致癌性，操作時(shí)應(yīng)予注意。 DA 反響后形成不溶性的棕色物質(zhì)，可用光學(xué)顯微鏡和肉眼觀 察， 適用于

13、各種免疫酶組織化學(xué)染色法。HR 可用戊二醛交聯(lián)法或過碘酸鹽氧化法將其標(biāo)記于抗體分子上制成酶標(biāo)抗體。生產(chǎn)中常用的酶標(biāo)抗體技術(shù)有免疫酶組織化學(xué)染色法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)兩 種。三免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù) 又稱免疫酶染色法。 是將酶標(biāo)記的抗體應(yīng) 用 于組織化學(xué)染色， 以檢測組織和細(xì)胞中或固相載體上抗原或抗體的存在及其分 布位置的技術(shù)。 圖 11-10 。1 標(biāo)本制備和處理 用于免疫酶染色的標(biāo)本有組織切片冷凍切片或低溫 石蠟切 片、組織壓印片、涂片以及細(xì)胞培養(yǎng)的單層細(xì)胞蓋片等。這些標(biāo)本的制 備和固定與 熒光抗體技術(shù)相同，但尚要進(jìn)行一些特殊處理。用酶結(jié)合物作細(xì)胞內(nèi)抗原定位時(shí)，由于組織和細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性過氧化

14、酶， 可與 標(biāo)記在抗體上的過氧化物酶在顯色反響上發(fā)生混淆。 因此，在滴加酶結(jié)合物 之前通 常將制片浸于0.3% HO2中室溫處理15?30min,以消除內(nèi)原酶。應(yīng)用1%- 3%HO甲醇 溶液處理單純細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本或組織涂片， 低溫條件下作用 10? 15min , 可同時(shí)起到固定和消除內(nèi)原酶的作用 , 效果比擬好。組織成分對球蛋白的非特異性吸附所致的非特異性背景染色，可用10% 卵蛋 白作用30min進(jìn)行處理，用0.05%吐溫-20和含1%牛血清白蛋白BSA的PBS寸細(xì) 胞 培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行處理，同時(shí)可起到消除背景染色的效果。2 染色方法 可采用直接法、間接法、抗抗體搭橋法、雜交抗體法、酶抗 酶復(fù)合

15、 物法、 增效抗體法等各種染色方法， 其中直接法和間接法最常用。 反響中 每加一 種反響試劑，均需于37C作用30min,然后以PBS反復(fù)洗滌三次，以除去 未結(jié)合物。 1 直接法 以酶標(biāo)抗體處理標(biāo)本，然后浸入含有相應(yīng)底物和顯色劑的反 應(yīng) 液中，通過顯色反響檢測抗原抗體復(fù)合物的存在。 2間接法 標(biāo)本首先用相應(yīng)的特異性抗體處理后， 再加酶標(biāo)記的抗抗體， 然 后經(jīng)顯色揭示抗原 - 抗體- 抗抗體復(fù)合物的存在。3 顯色反響 免疫酶組化染色中的最后一環(huán)是用相應(yīng)的底物使反響顯色。不同的酶所用底物和供氫體不同。同一種酶和底物如用不同的供氫體，那么其反 應(yīng)物的 顏色也不同。如辣根過氧化物酶，在組化染色中最常用

16、DAB 用前應(yīng)以0.05%mol/L,pH7.4 ? 7.6 的 Tris-HCI 緩沖液配成 50? 75mg/100m 溶液，并加少量約0.01%? 0.03% HO2混勻后加于反響物中置室溫10? 30min ,反響產(chǎn)物呈深 棕 色；如用甲萘酚，那么反響產(chǎn)物呈紅色，用4-氯-1- 萘酚, 那么呈淺藍(lán)色或藍(lán)色。4 .標(biāo)本觀察 顯色后的標(biāo)本可在普通顯微鏡下觀察，抗原所在部位DAB!色 呈棕黃色。 亦可用常規(guī)染料作反襯染色， 使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為清晰， 有利于抗原的定 位。 本法優(yōu)于免疫熒光抗體技術(shù)之處， 在于毋須應(yīng)用熒光顯微鏡， 且標(biāo)本可以長 期保存。四酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) Enzyme linked

17、 immunosorbent assay， ELISA ELISA 是應(yīng)用最廣、開展最快的一項(xiàng)新技術(shù)。其根本過程是將抗原或抗體吸附于固相載體， 在載體上進(jìn)行免疫酶反響， 底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié) 果。1 固相載體 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。聚苯乙烯微量滴 定板 40 孔或 96 孔板是目前最常用的載體，小孔呈凹形，操作簡便，有利于 大批樣 品的檢測。新板在應(yīng)用前一般無需特殊處理，直接使用或用蒸餾水沖洗 干凈，自然干 燥后備用。一般均一次性使用，如用已用過的微量滴定板，需進(jìn) 行特殊處理用于ELISA的另一種載體是聚苯乙烯珠，由此建立的ELISA又稱微球ELISA。珠 的直徑

18、 0.5? 0.6cm, 外表經(jīng)過處理以增強(qiáng)其吸附性能，并可做成不同顏色。此 小珠可 事先吸附或交聯(lián)上抗原或抗體， 制成商品。檢測時(shí)將小球放人特制的凹 孔板或小管中， 參加待檢標(biāo)本將小珠浸沒進(jìn)行反響，最后在底物顯色后比色測 定。本法現(xiàn)已有半自動(dòng) 化裝置，用以檢驗(yàn)抗原或抗體，效果良好。2包被 將抗原或抗體吸附于固相外表的過程，稱載體的致敏或包被。用 于包被 的抗原或抗體，必須能牢固地吸附在固相載體的外表，并保持其免疫活 性。大多數(shù)蛋 白質(zhì)可以吸附于載體外表，但吸附能力不同?？扇苄晕镔|(zhì)或蛋白 質(zhì)抗原，例如病毒蛋 白、細(xì)菌脂多糖、脂蛋白、變性的DN 等均較易包被上去。較大的病毒、細(xì)菌或寄生蟲等難以吸

19、附，需要將它們用超聲波打碎或用化學(xué)方 法提取 抗原成分，才能供試驗(yàn)用。用于包被的抗原或抗體需純化，純化抗原和抗體是提高 ELISA 敏感性與特異 性的關(guān)鍵。抗體最好用親和層析和 DEA 纖維素離子交換層析方法提純。有些抗 原含 有多種雜蛋白，須用密度梯度離心等方法除去，否那么易出現(xiàn)非特異性反響。蛋白質(zhì)抗原或抗體很易吸附于未使用過的載體外表，適宜的條件更有利 于該 包被過程。包被的蛋白質(zhì)數(shù)量通常為 1? 10 卩 g/ml 。高 pH 值和低離子強(qiáng)度緩 沖液一 般有利于蛋白質(zhì)包被，通常用 0.1mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液作包被液。 一般包被均 在4C過夜，也有經(jīng)37C 2? 3h到達(dá)最

20、大反響強(qiáng)度。包被后的滴定板 可置于4C冰箱， 可貯存 3 周。如真空塑料封口，于 -20 C 冰箱可貯存更長時(shí)間。 用時(shí)充分洗滌。3?洗滌 在 ELISA 的整個(gè)過程中，需進(jìn)行屢次洗滌，目的是防止重疊反響，防止引起非特異吸附現(xiàn)象。 因此，洗滌必須充分。通常采用含助溶劑吐溫 -20 最 終質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為 0.05% 的 PBS 乍洗滌液。洗滌時(shí)，先將前次參加的溶液倒空，吸 干，然 后參加洗滌液洗滌 3 次，每次 3min, 倒空，并用濾紙吸干。4?試驗(yàn)方法 ELISA 的核心是利用抗原抗體的特異性吸附，在固相載體上一層層地疊加， 可以是兩層、 三層甚至多層。 整個(gè)反響都必須在抗原抗體結(jié)合的最 適

21、條件下進(jìn)行。每層試劑均稀釋于最適和抗原抗體反響的稀釋液0.01 ?0.05mol/L pH7.4 PBSA加吐溫-20至0.05%, 10賑牛血清或1%BSA中，參加后置4C 過夜或37E 1? 2h。每加一層反響后均需充分洗滌。陽性、陰性應(yīng)有明顯區(qū)別。陽性血清顏色深，陰性血清顏色淺， 二者吸收值的比值最大時(shí)的濃度為最適濃度， 試驗(yàn) 方法主要有以下幾種 圖 11-11 。1 間接法 用于測定抗體。用抗原包被固相載體，然后參加待檢血清樣品，經(jīng) 孵育一定時(shí)間后，假設(shè)待檢血清中含有特異性的抗體，即與固相載體外表 的抗原結(jié)合形 成抗原 - 抗體復(fù)合物。洗滌除去其他成分， 再加上酶標(biāo)記的抗抗體， 反響后

22、洗滌， 參加底物，在酶的催化作用下底物發(fā)生反響，產(chǎn)生有色物質(zhì)。樣 品中含抗體越多，出 現(xiàn)顏色越快越深。2夾心法 又稱雙抗體法，用于測定大分子抗原。將純化的特異性抗體 包 被于固相載體，參加待檢抗原樣品，孵育后，洗滌，再參加酶標(biāo)記的特異性 抗體，洗 滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體結(jié)合物，最后參加酶的底物，顯色，顏色的 深淺與樣品中的 抗原含量成正比。3 雙夾心法 用于測定大分子抗原。此法是采用酶標(biāo)抗抗體檢測多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。將抗體 如豚鼠免疫血清 Ab1 吸附在固相載體上，洗滌除去未吸附的抗體，參加待測抗原Ag樣品，使之與固相載體上的抗體結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的

23、抗原，參加不同種動(dòng)物制備的特異性相同的抗體如兔免疫血清 Ab2, 使之與固相載體上的抗原結(jié) 合，洗滌后 參加酶標(biāo)記的抗 Ab2抗體如羊抗兔球蛋白Ab3，使之結(jié)合在Ab2上。結(jié)果形成 Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRF 復(fù)合物。洗滌后加底物顯色，呈色反響的深 淺與樣品中的抗原 量呈正比。5 酶標(biāo)抗原競爭法 用于測定小分子抗原及半抗原。 用特異性抗體包被固 相 載體，參加含待測抗原的溶液和一定量的酶標(biāo)記抗原共同孵育，對照僅加酶 標(biāo)抗原， 洗滌后參加酶底物。被結(jié)合的酶標(biāo)記抗原的量由酶催化底物反響產(chǎn)生 有色產(chǎn)物的量來 確定。 如待檢溶液中抗原越多， 被結(jié)合的酶標(biāo)記抗原的量越少， 顯色就越淺?？捎?不

24、同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反響繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)樣品的 ODS 求出檢測樣品中抗原 的含量。6PPA-ELISA 以 HR 標(biāo)記 SPAt 替間接法中的酶標(biāo)抗抗體進(jìn)行的 ELISA 見 實(shí)訓(xùn)十五。因SPA 葡萄球菌蛋白A能與多種動(dòng)物的IgGFc片段結(jié)合，可用HR 標(biāo)記制成酶標(biāo)記 SPA 而代替多種動(dòng)物的酶標(biāo)抗抗體，該制劑有商品供給。此外，還有酶 -抗酶抗體法、酶標(biāo)抗體直接競爭法、 酶標(biāo)抗體間接競爭法等。5 底物顯色 與免疫酶組織化學(xué)染色法不同， 本法必須選用反響后的產(chǎn)物 為水溶性色素的供氫體，最常用的為鄰苯二胺OPD，產(chǎn)物呈棕色，可溶，敏感 性高，但對光敏感 , 因此要避光進(jìn)行顯色反響。 底物溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。底物顯色 以室溫 10 ?20min為宜。反響結(jié)束，每孔加濃硫酸50卩終止反響。也常用四甲基 聯(lián)苯胺TMB 為供氫體，其產(chǎn)物為藍(lán)色，用氰氟酸終止 如用 HS0 終止，貝 U 為