基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

1、基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米顆粒制備研究納米顆粒制備研究070804227 070804227 張霞張霞 近幾年來近幾年來, , 隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展, ,將納米顆粒的制備技術(shù)引入殼聚糖將納米顆粒的制備技術(shù)引入殼聚糖- -蛋白蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸成為人們的質(zhì)藥物載體的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸成為人們的研究熱點(diǎn)研究熱點(diǎn). . 殼聚糖殼聚糖( chitosan)( chitosan)是甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物物, ,是地球上僅次于纖維素的最為豐富的是地球上僅次于纖維素的最為豐富的天然高分子化合物天然高分子化合物, , 其化學(xué)名稱為聚其

2、化學(xué)名稱為聚 2-2-氨基氨基- - 2-2-脫氧脫氧- - - 葡萄糖葡萄糖, ,是由是由N -N -乙酰乙酰氨基葡萄糖以氨基葡萄糖以 -1, 4-1, 4糖苷鍵縮合而成糖苷鍵縮合而成, , 是是一種天然聚陽離子堿性多糖一種天然聚陽離子堿性多糖. . 殼聚糖是一種用途很廣的天然高分子化殼聚糖是一種用途很廣的天然高分子化合物合物, , 具有無毒、具有無毒、 生物相容性、生物相容性、 吸附功吸附功能、能、 生物可降解性及多種生物學(xué)活性等生物可降解性及多種生物學(xué)活性等優(yōu)異性能優(yōu)異性能. .本文思路：本文思路： 采用基于殼聚糖采用基于殼聚糖(CS)(CS)與聚陰離子與聚陰離子( (多聚磷酸納多聚磷酸

3、納) )間靜電作間靜電作用的離子凝膠化方法用的離子凝膠化方法, ,以牛血清白蛋白以牛血清白蛋白(BSA)(BSA)為模型為模型, ,在在室溫下制備了包載蛋白質(zhì)的親水性殼聚糖納米顆粒室溫下制備了包載蛋白質(zhì)的親水性殼聚糖納米顆粒. .對對BSA-BSA-殼聚糖納米顆粒的形成條件進(jìn)行了考察殼聚糖納米顆粒的形成條件進(jìn)行了考察, ,結(jié)果表結(jié)果表明明: :在在pH pH 值為值為5. 0, CS 5. 0, CS 與與TPPTPP的質(zhì)量比為的質(zhì)量比為4, 4,殼聚糖分子殼聚糖分子量為量為400kDa400kDa的最優(yōu)化的條件下可制備粒徑小于的最優(yōu)化的條件下可制備粒徑小于100 nm100 nm的的BSA-

4、BSA-殼聚糖納米顆粒殼聚糖納米顆粒, ,對對BSABSA的包封率達(dá)到的包封率達(dá)到50%50%以上以上. .并將該體系初步應(yīng)用于蛋白類藥物丙種球蛋白并將該體系初步應(yīng)用于蛋白類藥物丙種球蛋白- -殼聚糖殼聚糖納米顆粒的制備研究納米顆粒的制備研究, , 這種殼聚糖納米顆粒對丙種球蛋這種殼聚糖納米顆粒對丙種球蛋白具有良好的緩釋作用白具有良好的緩釋作用. .1 1、實驗部分、實驗部分1.1 1.1 試劑及儀器試劑及儀器殼聚糖殼聚糖, Fluka , Fluka 公司公司; ; BCA BCA 蛋白質(zhì)試劑盒蛋白質(zhì)試劑盒, , 美國美國PiercePierce公司公司; ; 牛血清白蛋白牛血清白蛋白, ,

5、 上海伯奧科技有限公司上海伯奧科技有限公司; ;丙種球蛋白丙種球蛋白, , 南京軍區(qū)生物制品藥物研究所南京軍區(qū)生物制品藥物研究所; ;其他試劑均為國產(chǎn)分析純其他試劑均為國產(chǎn)分析純. .SPA-400 SPA-400 原子力顯微鏡原子力顯微鏡, , 日本精工公司日本精工公司; ;3000HS 3000HS 激光粒度分析儀激光粒度分析儀, , 英國英國 Malvern Malvern 公公司司; ;CR22G CR22G 高速冷凍離心機(jī)高速冷凍離心機(jī), ,日本日立公司日本日立公司. .1.2 1.2 實驗方法實驗方法1.2.1 BSA1.2.1 BSA殼聚糖納米顆粒的制備及影響殼聚糖納米顆粒的制備

6、及影響 因素的考察因素的考察 先將殼聚糖溶解到先將殼聚糖溶解到HAC-NaACHAC-NaAC緩沖緩沖溶液中溶液中, ,在磁力攪拌下在磁力攪拌下, ,將一定體積溶有將一定體積溶有BSA BSA 的的TPP TPP 溶液滴加到殼聚糖溶液中溶液滴加到殼聚糖溶液中, ,室溫下反應(yīng)室溫下反應(yīng)3 h 3 h 后即可后即可. . 改變緩沖溶液的改變緩沖溶液的pHpH值、值、 CS CS 及及TPPTPP的質(zhì)的質(zhì)量比量比以及以及選用不同分子量的殼聚糖選用不同分子量的殼聚糖制備制備BSA-BSA-殼聚糖納米顆粒殼聚糖納米顆粒( CS-BSA-TPP) ,( CS-BSA-TPP) ,在激光粒度分析儀上測定不同

7、條件下顆在激光粒度分析儀上測定不同條件下顆粒的平均粒徑粒的平均粒徑, ,分別考察上述條件對納米分別考察上述條件對納米顆粒粒徑的影響顆粒粒徑的影響. .1.2.2 BSA-1.2.2 BSA-殼聚糖納米顆粒的表征殼聚糖納米顆粒的表征 根據(jù)粒徑的最佳條件制備根據(jù)粒徑的最佳條件制備CS-BSA-T PP CS-BSA-T PP 納米顆粒納米顆粒, ,取適量產(chǎn)品溶液滴于云母片上取適量產(chǎn)品溶液滴于云母片上, , 自然干燥后通過原子力顯微鏡觀測納米顆自然干燥后通過原子力顯微鏡觀測納米顆 粒的直觀形貌圖粒的直觀形貌圖. .1.2.3 BSA 1.2.3 BSA 包封率的測定包封率的測定 按上述最佳條件制備按

8、上述最佳條件制備CS-BSA-T PP CS-BSA-T PP 納納米顆粒及未包載米顆粒及未包載 BSA BSA 的空白納米顆粒的空白納米顆粒( ( CS-TPP) , CS-TPP) , 取適量產(chǎn)品溶液在取適量產(chǎn)品溶液在1010下超下超速離心速離心( 26 000 r/ min) 30 min,( 26 000 r/ min) 30 min,量取適量量取適量上清液上清液, ,按照按照BCA BCA 蛋白質(zhì)試劑盒提供的蛋白質(zhì)試劑盒提供的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. . 測定上清液中測定上清液中 BSA BSA 的濃度的濃度, ,根據(jù)下列公根據(jù)下列公式求出式求出BSA BSA 的包封率的包

9、封率: : A . E. %= ( m - m1) / m 100%.A . E. %= ( m - m1) / m 100%. 式中式中: m : m 為為BSA BSA 總量總量; m1 ; m1 為上清液中為上清液中BSA BSA 的含量的含量. .2 2、結(jié)果與討論、結(jié)果與討論2.1 CS2.1 CS與與TPP TPP 質(zhì)量比對顆粒粒徑的影響質(zhì)量比對顆粒粒徑的影響 改變改變CS CS 與與TPP TPP 的質(zhì)量比的質(zhì)量比( (mcs/mTPP) , ) ,分別分別測定不同條件下測定不同條件下 CS-BSA-TPP CS-BSA-TPP 納米顆納米顆粒的粒徑粒的粒徑, , 當(dāng)當(dāng)mcs/m

10、TPP值在值在3 8 3 8 之間時之間時, , 顆粒的平均粒徑處于顆粒的平均粒徑處于80 250 nm80 250 nm之間之間, , 其其中以中以 mcs/mTPP為為 4 4：1 1時粒徑最小時粒徑最小; ; 而而mcs/mTPP值低于值低于 3 3 及高于及高于 10 10 以后以后, , 得到的得到的是微米顆粒是微米顆粒. .當(dāng)當(dāng) pH pH 值大于值大于 4 4 之后其粒徑迅之后其粒徑迅速減小速減小. .當(dāng)當(dāng)pH pH 值值為為 5. 0 5. 0 時時, CS-, CS-BSA-TPP BSA-TPP 納米納米顆粒的粒徑最顆粒的粒徑最小小. .2.2 pH 2.2 pH 值對顆粒

11、粒徑的影響值對顆粒粒徑的影響 原因：原因：由于由于CS CS 表面帶正電荷表面帶正電荷, , 而而TPP TPP 是是帶負(fù)電荷的多聚陰離子帶負(fù)電荷的多聚陰離子, , 二者基于靜電作二者基于靜電作用形成球珠狀凝膠用形成球珠狀凝膠, BSA , BSA 可被包裹進(jìn)其交可被包裹進(jìn)其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)骨架內(nèi)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)骨架內(nèi). .當(dāng)當(dāng)pH pH 值接近或超過值接近或超過BSA BSA 的等點(diǎn)電時的等點(diǎn)電時, TPP , TPP 及及BSA BSA 表面所帶負(fù)電表面所帶負(fù)電荷較多荷較多, , 更易于與帶正電荷的更易于與帶正電荷的CS CS 交聯(lián)交聯(lián), ,因因而形成的納米顆粒很緊密而形成的納米顆粒很緊密, , 粒徑很小粒

12、徑很小. . 由此可見由此可見, , 在在pH pH 值為值為5. 0 5. 0 的的HAC-HAC-NaAC NaAC 緩沖溶液中制備的殼聚糖納緩沖溶液中制備的殼聚糖納米顆粒平均粒徑最小米顆粒平均粒徑最小, ,穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好. .固定固定pH pH 值為值為5. 5. 0, CS 0, CS 與與TPP TPP 的質(zhì)量比為的質(zhì)量比為4 4：1, 1,制備制備3 3 種分種分子量的子量的 CS-CS-BSA-TPP BSA-TPP 納納米顆粒米顆粒. . 最最小小2.3 2.3 殼聚糖分子量對顆粒粒徑的影響殼聚糖分子量對顆粒粒徑的影響 結(jié)果見圖結(jié)果見圖3, 3,分子量分別為分子量分別為 30

13、0 kDa 300 kDa 及及 400 400 kDakDa時時, ,顆粒的粒徑小于顆粒的粒徑小于200 nm, 200 nm, 而分子量而分子量為為 400 kDa400 kDa時最小時最小. . 當(dāng)殼聚糖分子量增大當(dāng)殼聚糖分子量增大為為600 kDa600 kDa時時, ,產(chǎn)生的顆粒尺寸大于產(chǎn)生的顆粒尺寸大于500 500 nm.nm.進(jìn)一步比較了進(jìn)一步比較了3 3 種殼聚糖納米顆粒所種殼聚糖納米顆粒所包載包載BSA BSA 的包封率的包封率, , 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)2 2 種大分子量的種大分子量的殼聚糖包封率均比較高殼聚糖包封率均比較高. .原因：原因：殼聚糖自身具備高聚物的結(jié)構(gòu)特征殼聚糖自身具

14、備高聚物的結(jié)構(gòu)特征, ,分子量越大其聚合度越大分子量越大其聚合度越大, ,越有利于與聚越有利于與聚陰離子形成聚合物陰離子形成聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò), , 能被這種聚能被這種聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)包裹進(jìn)去的合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)包裹進(jìn)去的 BSA BSA 的量也越的量也越多多. . 因此因此, , 綜合考慮包封率和顆粒大小綜合考慮包封率和顆粒大小, , 我們選擇分子量為我們選擇分子量為 400 400 kDakDa的殼聚糖的殼聚糖作為藥物的合適載體作為藥物的合適載體. .2.4 BSA-2.4 BSA-殼聚糖納米顆粒的表征殼聚糖納米顆粒的表征 如圖如圖 4 4 所示所示, BSA-, BSA-殼聚糖納米顆粒呈殼聚

15、糖納米顆粒呈球球形形, , 粒徑分布在粒徑分布在 50 100 nm 50 100 nm 之間之間. . 同時利同時利用激光粒度分析儀對納米顆粒的粒徑進(jìn)用激光粒度分析儀對納米顆粒的粒徑進(jìn)行動力學(xué)統(tǒng)計行動力學(xué)統(tǒng)計, , 根據(jù)粒徑的數(shù)量分布顯示根據(jù)粒徑的數(shù)量分布顯示, , 99. 4%99. 4%的納米顆粒的粒徑為的納米顆粒的粒徑為( 67. 0 ( 67. 0 24. 24. 3) nm, 3) nm, 與原子力顯微鏡的觀測結(jié)果基本與原子力顯微鏡的觀測結(jié)果基本吻合吻合. .2.5 2.5 殼聚糖納米顆粒在丙種球蛋白納殼聚糖納米顆粒在丙種球蛋白納米藥物載體制備中的初步應(yīng)用米藥物載體制備中的初步應(yīng)用

16、 固定固定 CS CS 與與 TPP TPP 的質(zhì)量比為的質(zhì)量比為 4:1, 4:1, 在在 pH pH 值為值為5. 0 5. 0 的條件下的條件下, ,選擇分子量為選擇分子量為 400 kDa400 kDa的殼聚糖的殼聚糖, , 制備包載丙種球蛋白的殼聚糖制備包載丙種球蛋白的殼聚糖納米顆粒納米顆粒. .結(jié)果表明結(jié)果表明: : 制備的納米顆粒平制備的納米顆粒平均粒徑在均粒徑在50 100 nm 50 100 nm 之間之間, , 包封率為包封率為55. 55. 0% .0% . 同時同時, , 為進(jìn)一步考察該納米顆粒能否實現(xiàn)為進(jìn)一步考察該納米顆粒能否實現(xiàn)丙種球蛋白的釋放丙種球蛋白的釋放, ,

17、初步探討了其在初步探討了其在PBS PBS 中的體外釋放特征中的體外釋放特征, ,結(jié)果如圖結(jié)果如圖5 5 所示所示. .在釋藥初期在釋藥初期( 1 2d ( 1 2d 內(nèi)內(nèi)) , ) ,大約釋放大約釋放20%20%的丙種的丙種球蛋白球蛋白, , 在在隨后幾天內(nèi)隨后幾天內(nèi), ,釋放度一直釋放度一直趨于平緩趨于平緩, , 到第到第 10 10 天天釋放度達(dá)到釋放度達(dá)到52. 5% .52. 5% . 結(jié)果顯示結(jié)果顯示, ,該殼聚糖納米顆粒對丙種該殼聚糖納米顆粒對丙種球蛋白具有良好的緩釋作用球蛋白具有良好的緩釋作用. .3 、結(jié) 論 本法不但實驗條件溫和本法不但實驗條件溫和, , 不需要有機(jī)不需要有機(jī)溶劑及戊二醛等交聯(lián)劑溶劑及戊二醛等交聯(lián)劑, ,可在常規(guī)實可在常規(guī)實驗室大量制備大小均勻、分散性好驗室大量制備大小均勻、分散性好、 性質(zhì)穩(wěn)定的包載蛋白質(zhì)藥物的