米曲霉的制備

1、 畢 業(yè) 論 文課題名稱 米曲霉的制備姓 名 學 號 所在系 制藥與生物工程系 專業(yè)年級P09生物制藥 指導教師 職 稱 講師 指導教師 職 稱 二O一二年六月八日淄博職業(yè)學院畢業(yè)論文摘要頁眉來？ 微生物在醬油生產(chǎn)制曲工藝和發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，在高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝過程中，培養(yǎng)良好的米曲霉菌種不僅可以提高醬油中總氮、氨基酸態(tài)氮含量和醬油風味,而且還可以提高原料利用率。因此米曲霉種曲培養(yǎng)是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油的有效保證。本論文主要介紹米曲霉在不同階段的擴大培養(yǎng)方法，包括試管菌種、錐形瓶菌種、種曲罐菌種、種曲等方面的培養(yǎng)方法及注意事項。米曲霉培養(yǎng)溫度為2832英文數(shù)字的字體。不要讓我再提醒第三次了。

2、,培養(yǎng)時間為72h,半角全角的標點，回去一個一個的標點點著改，我也不想提醒第三次了。我重申一下，我只負責指出你哪塊有問題，不是負責?？?。你得自己檢查的差不多再發(fā)給我吧。米曲霉生長最旺盛作用,此時,曲料的曲酶孢子數(shù)大于8×109個/g,蛋白酶活力可達1000mg/100g以上。關(guān)鍵詞 米曲霉；溫度；時間；試管菌種；三角瓶菌種；擴大培養(yǎng)9目錄引言11 菌種的種類11.1 米曲霉11.2 黑曲霉12 菌種的選擇條件12.1 不產(chǎn)生黃曲霉毒素及其他真菌毒素12.2 酶系全、酶活力高22.3 對環(huán)境適應能力強，生長繁殖快22.4 釀制的醬油風味好23試管實驗23.1 滅菌23.2 培養(yǎng)基的制備

3、23.3 培養(yǎng)基的鑒別23.4 接種培養(yǎng)33.5 菌種的留選34 錐形瓶培養(yǎng)34.1 原料配比34.2 接種培養(yǎng)35種曲制備35.1 種曲原料要求35.2 做料前檢查事項45.3 做料45.4 蒸料45.5 抽真空45.6 降溫45.7 接種55.8 自動培養(yǎng)55.9 開罐55.10操作過程中應注意的問題56種曲的質(zhì)量標準66.1感官特性66.1.1外觀66.1.2香氣66.1.3手感66.2孢子數(shù)的測定66.2.1樣品的稀釋66.2.2制片76.2.3觀察計數(shù)76.2.4注意事項7參考文獻9謝辭10引言還是段前段后的問題，自己上百度查查。米曲霉是一類產(chǎn)復合酶的菌株，半知菌亞門，絲孢綱，屬真菌

4、中的一種常見種。菌落生長較快，質(zhì)地疏松，初成白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，分布甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機物和土壤等處。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，廣泛應用于食品、釀酒等發(fā)酵工業(yè)中，培養(yǎng)良好的米曲霉菌種不僅可以使醬油產(chǎn)生濃郁的醬香及酯香，提高醬油的的風味而且還可以提高其原料利用率。因此培養(yǎng)優(yōu)良的米曲霉種曲是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油的重要保障。1 菌種的種類1.1 米曲霉米曲霉滬3.042菌株是目前國內(nèi)醬油生產(chǎn)廠家普遍使用的優(yōu)良菌，其來源是福建省永春縣醬園中篩選出來米曲霉，中國科學院編號為3.863菌株，后經(jīng)上海釀造科學研究所進一步誘變篩選獲得滬釀3.042

5、，中科院保藏好3.951。該菌株分生孢子大，數(shù)量多，生長繁殖速度快，對雜菌抵抗力強，易制曲，制曲時間為48h，其蛋白酶活力比原處發(fā)的菌株提高30%以上。1.2黑曲霉黑曲霉AS3.350與米曲霉滬釀3.042混合制曲，對提高蛋白質(zhì)原料的利用率以及產(chǎn)品風味均有一定的效果。2 菌種的選擇條件2.1 不產(chǎn)生黃曲霉毒素及其他真菌毒素目前國內(nèi)外生產(chǎn)中應用的米曲霉、醬油米曲霉、溜曲霉等菌株，雖然屬于黃曲霉菌群，但均未發(fā)現(xiàn)黃曲霉素，因而是安全的。2.2 酶系全、酶活力高段前段后尤其是蛋白酶活力要求高。醬油的成分絕大部分來自制曲過程中微生物分泌的多種酶類對原料的分解，除蛋白酶、淀粉酶等酶系以外，還有谷氨酰胺酶、

6、脂肪酶和植物組織分解酶（包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶）等，當前國內(nèi)普遍推廣的米曲霉滬釀3.042,酶系比較全，酶活力較高，適于釀造醬油，但其酸性蛋白酶及纖維素酶活力不高。因此，將其和酸性蛋白酶活力高的黑曲霉混合制曲發(fā)酵，能夠明顯的提高原料的利用率。2.3 對環(huán)境適應能力強，生長繁殖快這樣的菌株生長適應期短，孢子萌發(fā)快，能迅速居于生長優(yōu)勢地位，抑制雜菌的生長。滬釀3.042米曲霉十幾年來在釀造工業(yè)一直保持著生命力，最主要原因就在于它對環(huán)境適應性強，制曲管理容易。2.4 釀制的醬油風味好優(yōu)良的菌株不僅要求無毒性、酶系全，酶活力高、生長快、制曲容易，而且釀造出來的醬油風味必須良好，否則就不適用。

7、 試管實驗3.1 滅菌凡用于菌種培養(yǎng)的皿具要徹底清洗和滅菌，試管滅菌前需要配上棉塞并用防潮紙包扎管口。3.2 培養(yǎng)基的制備試管菌種用土豆培養(yǎng)基（配制方法：將300g去皮馬鈴薯切塊加1000ml蒸餾水煮沸1020min再用紗布過濾，濾液補加蒸餾水至1000ml再加20g葡萄糖和20g瓊脂，加熱溶化分裝后，在121的條件下滅菌20分鐘）。3.3 培養(yǎng)基的鑒別把新配制并經(jīng)滅菌的斜面菌種于2530條件下培養(yǎng)34天，然后檢查確保無污染方可使用。3.4 接種培養(yǎng)段前段后把在無菌條件下移接的米曲霉斜面菌種于2530條件下培養(yǎng)72h待菌種發(fā)育成熟后方可使用。3.5 菌種的留選為使菌種保持良好特性應定期做好分純

8、工作宜半年進行一次留選產(chǎn)生性能好的菌株。4 錐形瓶培養(yǎng)4.1 原料配比錐形瓶種培養(yǎng)基每瓶采用麩皮20g面粉4g經(jīng)混合后，拌入20ml清水，充分拌勻裝入預先洗滌，干燥配制好棉塞及經(jīng)1kg/c蒸汽壓、滅菌30min的300ml錐形瓶中裝瓶量及料厚1cm為準。4.2 接種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)過程，搖兩次瓶，首次在曲料開始發(fā)白結(jié)塊時（約20小時）進行，相隔4-6h當曲料再行結(jié)塊，則進行第二次搖瓶，經(jīng)過兩天培養(yǎng)后把三角瓶輕輕倒置過來（也可不倒置）繼續(xù)培養(yǎng)1天，全部長滿黃綠色孢子米曲霉發(fā)育成熟即可使用，或4冰箱待用。5 種曲制備5.1 種曲原料要求制種曲是為了培養(yǎng)優(yōu)良的種子，原料必須適應曲霉菌旺盛繁殖的需要。曲霉

9、菌繁殖時需要大量糖分，而豆粕含淀粉較少，因此在生產(chǎn)加工時，在加入豆粕的同時還要加入一定量的面粉或炒麥。為了使曲霉菌繁殖旺盛，大量著生孢子，保持曲料松散和空氣流通是很必要的，炒麥或麩皮過細會影響通風，應時刻注意曲料的生長情況，隨時開風機看曲料是否發(fā)白結(jié)塊，進行翻曲。5.2 做料前檢查事項段前段后(1) 檢查設備是否清洗干凈。(2) 水、電、氣是否送到(3) 將冷熱水灌水注滿。(4) 對蒸汽過濾器進行消毒，注意消毒時壓縮氣閥打開。(5) 檢查噴霧頭的噴霧狀態(tài)是否良好（水珠不宜過大）。(6) 調(diào)整好電柜，各項溫度指標。5.3 做料將麩皮與面粉按9:1比例，混合均勻后按1:1的比例混合（一般117kg

10、麩皮、13kg面粉、130kg水）用面碎機打兩遍后裝盤，裝盤不宜過厚（按130kg來算，每盤重2.7kg左右）。5.4 蒸料將料車放入罐后，將溫度計放好（以能清晰看到30-40）之間為宜，關(guān)閉罐門，打開密封條、閥門，同時將罐體相連的閥門關(guān)好，打開蒸汽閥進蒸汽，首先要預熱一次，通氣壓力開之0.1Mpa后排氣目的是將罐內(nèi)冷氣排除，預熱完畢后方可蒸料，將溫度開之121左右、壓力0.2Mpa左右，關(guān)閉蒸汽閥計時，保溫保壓30min左右，目的是殺菌（切記保溫保壓過程中溫度要一直在120左右，壓力在0.2Mpa左右，保溫完成后打開排氣閥排氣之壓力為0）。5.5 抽真空將與外界相連的一個排氣閥關(guān)閉同時疏水閥

11、關(guān)閉，加層的排水閥關(guān)閉，然后再打開真空總閥，自來水閥，最后打開真空泵閥，將氣壓將至-0.04Mpa左右時，按順序關(guān)閉抽真空裝置。5.6 降溫首先用熱水循環(huán)（因開始時熱水罐溫度很低，與我們所需溫度相差甚遠），當熱水罐溫度開至40左右時，可以關(guān)閉熱循環(huán)，改為冷水循環(huán)，在降溫過程中，為加速降溫，可以打開風機，將風機頻調(diào)的稍大即可，當溫度降至60左右時，開始增壓至壓力到-0.04Mpa（開始抽真空到-0.04Mpa，但在降溫過程中壓力壓力會將至-0.08Mpa終于）蒸料降溫過程中冷干機是一直開著的。5.7 接種段前段后當風溫將至35時，方可接種，接種前要用75的酒精將接種容器消毒，消毒后將接種容器吹干

12、后方可倒入菌種接種量一般為26個三角瓶，接種時要慢慢晃動接種器避免接種菌容器被菌種阻塞，接種完成后 打開增氧閥門，增氧至壓力為0Mpa時打開罐后排氣閥。5.8 自動培養(yǎng)接種完成后打開自動培養(yǎng)開噴霧1.5-2小時前期噴霧不需要太多，一般以5min-8min/h為宜，在后期24h左右至50h噴霧10-12min/h為宜，后期50-60h 8min-10min/h，60h以后停止噴霧。表1 自動培養(yǎng)過程控制時間（h）0-66-3030-3838-6060-72風溫（）28-3228-3230-3430-3428-32風頻（Hz）1517202015自動培養(yǎng)過程中，風溫不要超過33，因為風溫在33時料

13、溫已超過34。5.9 開罐開罐后將風機的風頻調(diào)至20Hz 將種曲吹干備用。5.10 操作過程中應注意的問題（1） 這些無意義的空格都去掉麩皮和面粉的配比保證為9：1。（2） 加水量確保加水量和物料的總質(zhì)量之比為1：1。如果加水不足則會導致在培養(yǎng)過程中因前期缺水而后期無法彌補，從而導致孢子數(shù)過低。（3） 粉碎時至少用粉碎機粉碎兩遍，直到?jīng)]有成團的物料為標準。若粉碎不徹底米曲霉很難充分的利用碳源和氮源，因而影響米曲霉的生長繁殖。（4） 裝盤時應盡量保證每盤中的重量基本一樣，物料鋪的均勻一致，若鋪的時間過長后一段時間在物料裝盤之前還應先用手搓一下防止物料結(jié)塊，在培養(yǎng)過程中影響通風。（5） 入罐時一定

14、要記住放溫度計，以便在培養(yǎng)過程中控制溫度。（6） 蒸煮過程中切記不要開沖鏡水，防止觀察鏡遇涼水而炸裂，在排冷空氣時應盡量排盡，以便后期滅菌過程的保溫保壓。（7） 抽真空前或抽真空后記住一定要把排水閥、疏水閥關(guān)閉，使罐體保持一個相通的狀態(tài)確保后期罐體降溫的進行，抽真空時先開真空總閥最后開真空泵、，抽完真空后要及時生壓為后面的接種做準備。（8） 降溫時可打開風機同時將風頻調(diào)至45Hz。這樣即可縮短降溫時間又能節(jié)約資源。（9） 接種前應將和接種有關(guān)的器具進行消毒，接種時料溫一定要保持在36以下風溫38以下，此溫度最適合米曲霉的生長繁殖。（10） 培養(yǎng) 接種完后應立即打開與罐體相接的培養(yǎng)閥，這樣為了確

15、保罐體的氣壓與外界大氣壓相同，以便后期噴霧的進行。培養(yǎng)過程中噴霧水應定期進行更換，過濾器應定期進行消毒。噴霧時應該根據(jù)料面的干濕度來決定噴霧量的大小以及時間的長短。（11） 開罐以后將除風機以外的所有開關(guān)都關(guān)死，同時將風頻調(diào)至20Hz左右將種曲吹干。為了防止菌種發(fā)熱應將菌種放在低溫干燥的條件下保存。6 種曲的質(zhì)量標準6.1 感官特性6.1.1 外觀菌絲整齊健壯、孢子旺盛、頂囊肥大，米曲霉呈新鮮黃綠色、無夾心、無異色，發(fā)芽率不低于90%,孢子數(shù)達100億個/g（以干基計）。6.1.2 香氣具有種曲固有的曲香味，無霉味、酸味、氨味等不良氣味。6.1.3 手感用手指觸及種曲，松軟而光滑，孢子飛揚。6

16、.2 孢子數(shù)的測定6.2.1 樣品的稀釋稱取1g種曲放入250ml錐形瓶中然后加入5ml酒精（95%）10mlH2SO4(1：10)20ml蒸餾水45個玻璃珠放在旋渦混合器中振蕩23min，使分生孢子個個分散，然后用多層紗布過濾、沖洗，使濾渣不含孢子，稀釋至500ml容量瓶中。6.2.2 制片段前段后取稀釋液1d滴于血球計數(shù)板的計數(shù)格上，然后將蓋片輕輕由一遍向另一遍壓下，使蓋片與計數(shù)板完全密合，液中無氣泡，用濾紙吸干多余的溢出懸浮的孢子液，靜置數(shù)分鐘，待孢子沉淀。6.2.3 觀察計數(shù)用低倍鏡頭或高倍鏡頭觀察。由于稀釋液中的孢子在血球計數(shù)板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計數(shù)

17、時必須逐格調(diào)動微細螺旋，才能不使遺漏。孢子數(shù)位于大格的劃線上，應一律取二邊計數(shù)，而棄另兩邊，以減少誤差。使16×25計數(shù)板時，只計板上四個角上的4個大格（即100個小格）。如果使用25×16的計數(shù)板，除計四個角上的4個大格外，還需要計中央一大格的數(shù)目（即80個小格）。每個樣品重復觀察計數(shù)不少于2次，然后取平均值。即為該樣品種曲的孢子數(shù)。計算： （1）16×25血球計數(shù)板 孢子數(shù)（個/g）=N/100×400×10000×V/G =4×104×NV/G 式中 : N100小格內(nèi)包子總數(shù)，個； V孢子稀釋體積，mL；

18、G樣品重量，g。（2）25×16血球計數(shù)板： 孢子數(shù)（個/g）=N/80×400×10000×V/G =5×104×NV/G 式中 ：N80個小格內(nèi)孢子數(shù)總數(shù)，個； V樣品稀釋體積，mL； G樣品重量，g。6.2.4 注意事項(1)稱樣時要盡量防止孢子的飛揚。(2)測定時，如果發(fā)現(xiàn)有許多孢子結(jié)集成團或成堆，說明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱重、振搖、稀釋。（3）生產(chǎn)實踐應用時，種曲以干物質(zhì)計算。因而需要同時測定種曲水分，計算時樣品改為干重量。 樣品絕干重量=G(1-W）式中：G樣品重，g W樣品水分的百分比，%參考文獻段前段后1姚繼承,郭云芝.應用復合制曲技術(shù)提高大醬產(chǎn)品質(zhì)量J.中國調(diào)味品2006(01).2馬凈麗.優(yōu)選曲種提高醬油產(chǎn)量、質(zhì)量的探討2007(01).3柏芳青,馬新村,趙雙梅.醬油制曲過程中的分段控制法J.中國調(diào)味品2