儀器分析實(shí)驗(yàn)

1、儀器分析試驗(yàn)講義（第二版）授課人：李蓉王小剛西北大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系2004 年 6 月編制實(shí)驗(yàn)一 鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵一實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的構(gòu)造和使用方法。2掌握鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵的方法。（ 1）吸收曲線的測(cè)繪；（ 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪；（ 3）未知樣中鐵含量的測(cè)定；二原理圖 1-1 分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1- 光源 2- 進(jìn)光狹縫3 ， 6- 反射鏡4 ， 7- 透鏡 5- 棱鏡8- 出光狹縫9- 比色皿 10- 光電調(diào)節(jié)器11- 硒光電池12- 檢流計(jì)1 分光光度法及其測(cè)量的條件: 分光光度法主要利用的是物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收，按照郎伯比爾定律，在一定

2、的線性范圍內(nèi)（即濃度范圍內(nèi)）找出吸光度A 與物質(zhì)含量之間的定量關(guān)系。主要受顯色條件和測(cè)量吸光度條件的影響，其中顯色條件主要與顯色劑的用量、介質(zhì)的酸度、顯色溫度、顯色時(shí)間以及干擾離子的消除等有關(guān)；而測(cè)量吸光度的條件則與入射波長(zhǎng)入、吸光度范圍以及參比溶液等有關(guān)。2 .鄰二氮雜菲-亞鐵配合物：在顯色前，首先用鹽酸羥胺把Fe3+離子還原為Fe2+離子，其反應(yīng)式如下：在pH=2-9的條件下，F(xiàn)e2+離子與鄰二氮雜菲生成極穩(wěn)定的橘紅色配合物，其反應(yīng)式如下：該配合物的lgK穩(wěn)=21.3 ,摩爾吸光系數(shù)&10= 1.1 X 1040測(cè)定時(shí)，溶液酸度控制在pH=5.0,以避免酸度過(guò)高導(dǎo)致反應(yīng)速度過(guò)慢，酸

3、度過(guò)低Fe2+離子水解，從而影響顯色；此外，若溶液中存在著可與顯色劑生成沉淀（Bi 3+、 Cd2+、 Hg2+、 Ag+、Zn2+）或有色配合物（CsT、Cu2+、Ni2+）的離子時(shí)，應(yīng)注意它們的干擾作用。三 752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用1 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20 分鐘；2 .按“方式鍵” （MODE將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式；3 .按“波長(zhǎng)設(shè)置”鍵（p,力設(shè)置想要的分析波長(zhǎng)；4 .打開樣品室蓋，將盛有參比和被測(cè)溶液（約 2.5 cm）的比色皿分別插入 比色槽中，蓋上樣品室蓋；5 .將參比溶液推入光路中，按“ 100%T鍵調(diào)整零ABS 6將被測(cè)溶液拉入到光路中，此時(shí)顯示器上所顯示的

4、是被測(cè)樣品的吸光度值。四試劑10 Ng/mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液；10%勺鹽酸羥胺溶液；0.1%的鄰二氮雜菲溶液；1 mol/L NaAc 溶液。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 .吸收曲線的測(cè)繪：準(zhǔn)確移取 10 Ng/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入10%fc酸 羥胺溶液1 mL,搖勻，稍冷，加入1 mol/L溶液5 mL和0.1%鄰二氮雜菲溶液3 mL,以蒸儲(chǔ)水 稀釋至刻度，在752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，用比色皿以蒸餾水為參比溶液，用不同的波長(zhǎng)從570 nm開始到430 nm為止，每隔10或20 nm測(cè)定一次吸光度（其中從 530-490 nm每隔10 nm 測(cè)一次）。然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱

5、坐標(biāo)繪制出吸收曲線，從吸收曲線上確定該測(cè)定的適宜波長(zhǎng)。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪：取50 mL容量瓶6只，分別移取10 g/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、4.0、6.0、3 .0和10.0 mL于5只容量瓶中，另一容量瓶中不加鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后各加1 mL10%鹽酸羥胺，搖勻，經(jīng)2 min后，冉各加5 mL 1 mol/L NaAc溶液及3 mL 0.1%鄰二氮雜菲，以蒸儲(chǔ)水稀釋 至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上，用比色皿在最大吸收波長(zhǎng)( 510 nm)處，測(cè)定各溶液的吸光 度。以鐵含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.未知液中鐵含量的測(cè)定：吸取 5 mL未知液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟均同上，測(cè)定吸光度。

6、 由未知液的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出 5 m/知液中的鐵含量，然后以每毫升未知液中含鐵多少 微克表示結(jié)果。六.記錄及分析結(jié)果比色皿： 光源電壓：(1)吸收曲線的測(cè)繪波長(zhǎng)/ (nm)吸光度A570550530520510500490470430(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪與鐵含量的測(cè)定試液編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液的量/mL總鐵含量/心g10022.02034.04046.06058.080610.0100未知液450吸光度七.課堂提問(wèn)1 .鄰二氮雜菲分光光度法測(cè)定鐵的原理、反應(yīng) pH條件、用什麼控制酸度、力口 NHOH-HCl的目 的？2 .為什麼繪制吸收曲線？為什麼在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定？每改變？用參比液進(jìn)行重新調(diào)零

7、？3 .為什麼繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線？如何繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線？是否每測(cè)一點(diǎn)必須用參比液進(jìn)行調(diào)零？實(shí)驗(yàn)二 醋酸的電位滴定（間接電位法）一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握用酸堿電位滴定法測(cè)定醋酸的原理和方法。2 .學(xué)會(huì)用二階微商法計(jì)算終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）的方法。3 .學(xué)會(huì)用電位滴定法測(cè)定和計(jì)算 HACfe離常數(shù)的原理和方法。二.原理圖2-1電位滴定儀器裝置1-滴定管2-滴定池3-指使電極4-參比電極5-攪拌棒6-電磁攪拌器 7-電位計(jì)1 .二階微商法計(jì)算終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）：在酸堿滴定的過(guò)程中，利用酸堿中和反應(yīng)，隨著滴定劑 的不斷加入，被測(cè)物與滴定劑發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，溶液的批pH值不斷變化。由加入滴定劑的體積V和測(cè)得的pH值，可

8、繪制 為H/V-V滴定曲線。根據(jù)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)，二階微商值等于零，計(jì)算 出滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗的終點(diǎn)體積（V終點(diǎn)）。2 . HAC4離常數(shù)的測(cè)定：醋酸在水溶液中的離解如下HAc= H Ac-其離解常數(shù)Ka =H Ac HAc當(dāng)醋酸被NaOHf定了一半時(shí)，溶液中根據(jù)上式，此時(shí)H + = Ka或pH = pKa ；由此可知，醋酸電離常數(shù) Ka的負(fù)對(duì)數(shù)值，就 等于NaOHf定一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值。3 .PHS-2型酸度計(jì)的使用1 .在去離子水中過(guò)夜浸泡玻璃電極使電極活化；2 .安裝電極，調(diào)節(jié)零點(diǎn)；3 .用鄰苯二甲酸氫甲標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=4.0）校準(zhǔn)儀器；4 .用蒸儲(chǔ)水洗凈電極；5 .將玻璃電極和甘汞電極插入

9、到待測(cè)溶液中，測(cè)量溶液的pH值。4 .儀器和試劑1 .儀器：PHS-2型酸度計(jì)一臺(tái)；玻璃電極及飽和甘汞電極各一支。2 .試劑：0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L 醋酸，鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。五.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 . HACfe位滴定過(guò)程中溶液pH值的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.1 mol/L HAC溶液20 mL于150 mL燒杯 中，用蒸儲(chǔ)水稀釋至約100 mL加入酚酥2滴，放入電極及鐵芯攪拌棒，開動(dòng)電磁攪拌器，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測(cè)量并記錄消耗的 NaOH容液的體積（VNao）和相對(duì)應(yīng)的溶液pH 值。上述滴定實(shí)驗(yàn)做1次。2 .計(jì)算滴定終點(diǎn)時(shí)消耗的NaOH

10、§液的體積數(shù)（V終點(diǎn)）：V終點(diǎn)=Vi +V2 -Vl（內(nèi)插法）3 .計(jì)算HAC勺準(zhǔn)確濃度（Ga& :其中GaoH為準(zhǔn)確標(biāo)定后的NaOH勺濃度4 .計(jì)算HAC勺pK值（2V終點(diǎn)時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值）：PK a = （ph 1 + 9H J，1父：v 終點(diǎn)Vi j （內(nèi)插法）V 2 - v 126 .記錄及分析結(jié)果VNao/mLpHpH/ V7 .課堂提問(wèn)1 .二階微商法確定滴定終點(diǎn)的方法原理？2 .為什麼鄰苯二甲酸氫甲溶液也可作為緩沖溶液？實(shí)驗(yàn)三 水的pH測(cè)定（直接電位法）一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? . 了解電位法測(cè)定水的pH值的原理與方法。2 .學(xué)習(xí)酸度計(jì)的使用方法。二.原理圖3-1玻璃電極測(cè)

11、定pH的工作電池示意圖1.玻璃電極與甘汞電極插入到被測(cè)溶液中組成原電池：赳拿繇嚴(yán)隔嬲學(xué)端品m紫"KCl （飽和），Hg2c12Hg但因式中K”無(wú)法測(cè)得，因此在實(shí)際工作中，用酸度計(jì)測(cè)定溶液的pH值時(shí)，首先必須用已知pH值的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液來(lái)校正酸度計(jì)（即“定位”），根據(jù)上式測(cè)得測(cè)定液的相對(duì)pH值。校正時(shí)應(yīng)選用與被測(cè)溶液pH值相接近的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，以減 少在測(cè)量過(guò)程中可能由于液接電位、不對(duì)稱電位以及溫度變化等引起的誤差。嚴(yán)格地講，一支電極應(yīng)用兩種不同pH值的緩沖溶液校正，在用一種pH值的緩沖溶液定位后，測(cè)第二種 緩沖溶液的pH值時(shí)，誤差應(yīng)在0.05之內(nèi)。校正后的酸度計(jì)可直接用來(lái)測(cè)量水或其他溶

12、液的 pH值。三.221型玻璃電極的使用1 .在去離子水中過(guò)夜浸泡玻璃電極使其活化；2 .將玻璃電極和甘汞電極插入到標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中溶液中，進(jìn)行pH值的校正；3 .用校正后的酸度計(jì)測(cè)量水溶液的 pH值。四.儀器和試劑1 .儀器：25型酸度計(jì)或PHS-29A型酸度計(jì)一臺(tái)；221型玻璃電極及222型飽和甘汞電極各一支；100 mL燒杯4只。2 .試劑：pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（20 C）。標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液通常能穩(wěn)定兩個(gè)月，其 pH隨溫度 不同稍有差異。五.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 .將電極和燒杯用蒸儲(chǔ)水沖洗干凈，用 pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液淌洗電極1-2次,電極用濾紙 吸干；2 .用pH=4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶

13、液校正酸度計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液用完后，可倒回原試劑瓶，反復(fù)使 用。3 .用水樣將電極淌洗4-5次后，測(cè)量水樣，由儀器刻度表上讀取 pH值，重復(fù) 測(cè)量三次。4 .測(cè)量完畢后，將電極和燒杯沖洗干凈，妥善保管。六.記錄及分析結(jié)果測(cè)量次數(shù)測(cè)量?jī)?nèi)行123pH個(gè)別絕對(duì)偏差相對(duì)平均偏差七.課堂提問(wèn)1 .電位法測(cè)定水的pH值原理？2 .酸度計(jì)為什麼要用已知pH的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正？3 .玻璃電極在使用前應(yīng)如何處理？為什麼？實(shí)驗(yàn)四 水中微量氟的測(cè)定（離子選擇電極法）一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? . 了解用F-離子選擇電極測(cè)定水中微量氟的原理與方法。2 , 了解總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液的意義和作用。3 .掌握標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量 F

14、離子的方法。二.原理圖4-1氟離子測(cè)量裝置1 氟離子電極：氟離子電極（LaF3 單晶敏感膜電極，內(nèi)裝0.1 mo/L NaCl-NaF 內(nèi)參比溶液和Ag-AgCl內(nèi)參比電極）是一種電化學(xué)傳感器，它將溶液中F-離子的活度轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電位。當(dāng)氟電極插入溶液時(shí)，其敏感膜對(duì) F-離子產(chǎn)生響應(yīng)，在膜和溶液間產(chǎn)生一定的膜電位：當(dāng)氟電極（指示電極）與飽和甘汞電極（參比電極）插入被測(cè)溶液中組成原電池時(shí)，電池的電動(dòng)勢(shì)E與F-離子活度的關(guān)系當(dāng)加入TISAB （總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液）時(shí)，由于離子活度系數(shù)丫為一定值，則電動(dòng)勢(shì)E則與F離子濃度有如下的關(guān)系：2標(biāo)準(zhǔn)加入法：當(dāng)試液為離子強(qiáng)度比較大的金屬離子溶液，且溶液中存

15、在絡(luò)合劑，若要測(cè)定金屬離子的總濃度（包括游離的和絡(luò)合的），則應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。該法是在原待測(cè)試樣（待測(cè)離子總濃度為Cx,體積為 V 中，加入少量體積（VS約為原試液體積的1/100）高濃度（Cs 約為Cx的100倍）的待測(cè)離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后試樣濃度的增加量Ac,以及標(biāo)準(zhǔn)溶液加入前后電動(dòng)勢(shì)的差值 AE,推算出待測(cè)金屬離子的總濃度 Cx。該法的優(yōu)點(diǎn)是僅需一種 標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作簡(jiǎn)單快速，適用于組成比較復(fù)雜，份數(shù)較少的試樣。三 7601 型氟電極的使用1 在去離子水中過(guò)夜浸泡氟電極使其活化；2 .用去離子水洗到空白電位（E）為300 mV左右。3將氟電極和甘汞電極插入到待測(cè)溶液中，測(cè)量溶

16、液的E 值。四儀器和試劑1 儀器：7601 型氟電極；232 或 222 型甘汞電極；電磁攪拌器。2 .試劑：0.1000 mo/L氟標(biāo)準(zhǔn)溶液；TISAB （總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖溶液）。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量F-離子的濃度：1 .準(zhǔn)確吸取50 mL F-離子試液于100 mL容量瓶中，加入10 mL TISAB溶液，用去離子水稀釋 至刻度，搖勻，吸取50 mL于燒杯中，測(cè)定Ei02 .在上述試液中準(zhǔn)確加入0.5 mL（VS）濃度約為10-2 mol/L（C s）的氟標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，繼續(xù)測(cè)定 E2。3 .在測(cè)定過(guò)巳的試液中，力口 5 mL TISAB溶液及45 mL去離子水，混勻，測(cè)定

17、E3。4 .計(jì)算水中微量F-離子的濃度（G）:六記錄及分析結(jié)果12EoEiE2E3CS1,用氟電極測(cè)定F-離子濃度的原理是什麼？2 . TIASB包含哪些組分？各組分的作用怎樣？3 .標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定水中微量F-離子的原理實(shí)驗(yàn)五 苯系物的分析（定性與定量）一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握SP-2100型氣相色譜儀的操作和苯系物的分析。2 .掌握用保留值定性的方法。3 .學(xué)習(xí)色譜校正因子的測(cè)定。4 .學(xué)習(xí)面積歸一化法計(jì)算各組分的含量。二.原理圖5-1氣相色譜分析流程圖1-載氣鋼瓶2-減壓閥3-凈化干燥器 4-針形閥5-流量計(jì)6-壓力表7-進(jìn)樣器、氣化室 8-色譜柱9-檢測(cè)器10-放大器11-記錄儀1 .氣相

18、色譜定性、定量原理（面積歸一化法）：定性原理：利用物質(zhì)在氣固或氣液兩相中的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離的分析方法，稱之為氣 相色譜法；按照同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時(shí)間（tR） 一致，進(jìn)行氣相色譜的定性分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為氣相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情況，通 常的定量方法分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合樣中所有組分均被洗脫時(shí)，可 用面積歸一化法計(jì)算各組分的含量，其計(jì)算公式如下所示：其中fi為相對(duì)校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子的比化2 .苯系物：苯系物指苯、甲苯、乙苯等混合物，在本實(shí)驗(yàn)中使用有機(jī)皂土配入適量的鄰苯二 甲酸二壬酯

19、作固定液，氫氣作載氣，在適當(dāng)?shù)纳V條件下（柱溫、進(jìn)樣器溫度、檢測(cè)器溫度、 熱絲溫度、橋電流、載氣流速等），能將各組分分開，其色譜圖如圖 4-2所示。圖4-2苯系物色譜圖1- 苯；2-甲苯；3-乙苯三.SP-2100型氣相色譜儀的操作1 .儀器的操作及參數(shù)的設(shè)定i .通載氣：打開H瓶總閥，輸出壓力調(diào)為0.4 MPa,調(diào)節(jié)儀器氣路箱版面的兩路載氣穩(wěn)壓 閥，以獲得TCD僉測(cè)器的流量；ii .通電：打開電源開關(guān)；iii .檢查或設(shè)定儀器的工作參數(shù)：A）設(shè)定柱箱溫度、進(jìn)樣器溫度、TCD僉測(cè)器溫度；待儀器顯示“就緒后，設(shè)定熱絲溫度、放大、極性；B）操作條件;TCD檢測(cè)器柱箱溫度60 c進(jìn)樣器溫度90 cT

20、CD檢測(cè)器溫度110 c熱絲溫度C橋電流130 mA放大10極性正載氣流速H:50 mL/min進(jìn)樣量15iv .穩(wěn)定儀器：先調(diào)零點(diǎn)平衡粗調(diào)（調(diào)節(jié)氣路板面后方的多圈電位器），將輸出調(diào)在土100 mV以內(nèi)檢測(cè)器達(dá)到熱平衡后，然后再按面板上的“調(diào)零”按鍵將基線調(diào)零；2 .進(jìn)樣：當(dāng)基線足夠穩(wěn)定時(shí)，即可進(jìn)樣分析；i .用去離子水徹底清洗10小微量注射器;ii .用幾微開樣品溶劑潤(rùn)洗注射器 2-3次；iii .用注射器從樣品容器中慢慢抽出幾微開樣品，取出注射器，將注射器的推桿仔細(xì)地推 倒1人刻度處（注意將氣泡排出）；iv .將注射器的針頭全部插入到進(jìn)樣器中，迅速進(jìn)樣并拔出注射器，同時(shí)按下數(shù)據(jù)處理裝 置的

21、“啟動(dòng)”按鈕，開始采集并顯示譜圖；3.譜圖的采集及數(shù)據(jù)處理i .譜圖的采集：A） “文件”“工作目錄”，在彈出的對(duì)話框中選擇某一文件夾作為程序的工作目錄；B） “文件”“褥塞；C） 在“譜圖參數(shù)表”的“信號(hào)通道”里選擇譜圖信號(hào)的采集通道；D） 選擇“操作”菜單中的“譜圖采集”命令，這時(shí)文檔窗口譜圖區(qū)內(nèi)開始有譜圖走 動(dòng)；E） 當(dāng)所有峰出完后，選擇“操作”菜單中的“手動(dòng)終止”命令；ii .校正歸一法操作步驟：A） 檢查“定量組分表”里是否已含有校正因子。若無(wú)，則應(yīng)按計(jì)算校正因子操作步驟 計(jì)算待測(cè)組分的校正因子：a）在譜圖中用鼠標(biāo)指著某一組分對(duì)應(yīng)的峰，按下鼠標(biāo)右鍵在彈出的菜單中選擇“自 動(dòng)填寫定量組

22、分表中套峰時(shí)間”命令。重復(fù)此步，將標(biāo)樣中全部組分所對(duì)應(yīng)的峰 選進(jìn)“定量組分表”；b） ”定量組分表”里填上標(biāo)樣中各組分的質(zhì)量（g）;c）在“定量方法表”中選擇“計(jì)算校正因子”；d）選擇“操作”菜單中“定量計(jì)算”命令，程序隨即將計(jì)算結(jié)果填入“定量結(jié)果 表”中；e）在“定量組分表”中單擊“取校正因子”，將剛剛計(jì)算得到的但尚在“定量結(jié)果 表”中的校正因子取到“定量組分表”中；f）選擇“文件”菜單中的“存為摸板”命令將上述文檔窗口中的幾張表格保存到當(dāng) 前工作目錄下的“默認(rèn)模板.tab ” ；B）待測(cè)樣品質(zhì)量百分含量的計(jì)算：a）按譜圖處理操作步驟所述采集并處理待測(cè)樣品的譜圖據(jù):b）在“定量方法表”中選擇

23、“校正歸一”；c） 選擇“操作”菜單中“定量計(jì)算”命令，程序隨即將計(jì)算結(jié)果填入“定量結(jié)果表”中；4. 儀器的關(guān)閉：i. .將TCDB導(dǎo)檢測(cè)器熱絲溫度設(shè)定為關(guān)閉；ii. 關(guān)閉儀器的總電源，并從電源插座上拔下儀器的電源電纜插頭；iii. 關(guān)閉載氣氣瓶總閥；四儀器和試劑1.儀器：SP-2100型氣相色譜儀；微量注射器；氫氣鋼瓶。2試劑：101 白色擔(dān)體 （ 60-80 目） ；固定液：有機(jī)皂土-34 + 鄰苯二甲酸二壬酯。苯、甲苯、乙苯單樣的標(biāo)準(zhǔn)樣品（分析純）；苯、甲苯、乙苯混合標(biāo)準(zhǔn)樣（分析純）。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 苯系物的定性分析：根據(jù)保留值用苯、甲苯和乙苯的單樣標(biāo)準(zhǔn)液定性混合液中的三組分；2. 苯系

24、物的定量分析：歸一化法計(jì)算各組分的含量i .校正因子的求?。簩⒁阎M分量（g）的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用“計(jì)算校正因子”法計(jì)算出校正因 子；ii 待測(cè)樣品百分含量的計(jì)算（“校正歸一”化法計(jì)算）六記錄及分析結(jié)果打印出實(shí)驗(yàn)結(jié)果：包括保留時(shí)間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖譜。七課堂提問(wèn)1保留值定性分析的原理？2 如何用面積歸一化法進(jìn)行定量？實(shí)驗(yàn)六 原子吸收光譜法測(cè)定自來(lái)水中鎂的含量一目的1 掌握原子吸收光譜分析法的基本原理；2了解原子吸收分光光度計(jì)的主要結(jié)構(gòu)，并學(xué)習(xí)其操作和分析方法；3學(xué)習(xí)選擇操作條件和干擾抑制劑的應(yīng)用；4了解從回收率來(lái)評(píng)價(jià)分析方案和測(cè)得結(jié)果的方法。二原理1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定鎂的含

25、量：溶液中的鎂離子在火焰溫度下變成鎂原子蒸汽，光源空心陰極鎂燈輻射出波長(zhǎng)為285.2 nm的鎂特征譜線，被鎂原子蒸汽強(qiáng)烈吸收，其吸收的強(qiáng)度與鎂原子蒸汽的濃度關(guān)系符合朗伯比爾定律，即鎂原子蒸汽濃度N 與溶液中鎂離子濃度c 成正比，當(dāng)測(cè)定條件固定時(shí)，利用A與c的關(guān)系，用已知不同濃度的鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)出不同的吸光度，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)試液的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試液中鎂的含量。2干擾抑制劑：自來(lái)水中除鎂離子外還含有其他陰離子和陽(yáng)離子，這些離子鎂的測(cè)定能發(fā)生干擾，使測(cè)得結(jié)果偏低。加入鍶離子作干擾抑制劑，可以獲得正確的結(jié)果。3回收試驗(yàn)：對(duì)于試樣的組成不完全清楚的或分析反應(yīng)不完全引起的系統(tǒng)誤差，可以

26、采用回收試驗(yàn)進(jìn)行校正。該法是向試樣中或標(biāo)準(zhǔn)試樣中加入已知含量的被測(cè)組分的純凈物質(zhì)，然后用同一方法進(jìn)行測(cè)定，由測(cè)得的增加值與加入量之差，估算系統(tǒng)誤差，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。三.TAS-990型原子吸收儀的操作1 開機(jī)依次打開打印機(jī)，顯示器，計(jì)算機(jī)開關(guān)，等計(jì)算機(jī)完全啟動(dòng)后，打開原子吸收主機(jī)電源，打開蓋箱。2儀器初始化i .雙擊“AAwin”圖標(biāo)，選擇聯(lián)機(jī)方式，點(diǎn)擊“確定”，初始化 3-5分鐘；ii 選擇元素?zé)艉皖A(yù)熱等（雙擊元素?zé)粑恢茫筛臒粑恢蒙系脑胤?hào)）。點(diǎn)擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置元素測(cè)量參數(shù)”窗口；iii 設(shè)定光譜帶寬，燃?xì)饬髁?，燃燒器高度等參?shù)（一般工作燈電流，預(yù)熱燈電流，負(fù)高壓以及燃燒器位

27、置不用更改），點(diǎn)擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置波長(zhǎng)窗口”：iv 不要更改默認(rèn)的波長(zhǎng)值，直接點(diǎn)擊“尋峰”，尋峰完畢，出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸收峰，點(diǎn)擊“關(guān)閉”，點(diǎn)擊“下一步”，點(diǎn)擊“完成”。3火焰吸收的光路調(diào)整點(diǎn)擊“儀器”下的“燃燒器參數(shù)”，輸入燃?xì)饬髁亢透叨龋ㄖ苯佑绊懳罩礎(chǔ)的大?。c(diǎn)擊“執(zhí)行”，用白色濾紙觀察光電即燃燒頭是否在光路的正上方，若有偏離，更改相應(yīng)參數(shù)，點(diǎn)擊“執(zhí)行”，可以反復(fù)調(diào)節(jié)，直到燃燒頭和光路平行并位于光路正上方 （如不平行，可通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)燃燒頭角度來(lái)完成），點(diǎn)擊“確定”。4設(shè)置樣品：點(diǎn)擊“樣品”圖標(biāo)i 選擇校正方法（一般為標(biāo)準(zhǔn)曲線法），曲線方程（一般為一次方程），濃度單位，樣品名

28、稱和起始編號(hào)，點(diǎn)擊“下一步”；ii 輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和個(gè)數(shù)（可依照提示增加和減少標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)量），點(diǎn)擊“下一步”；iii 選擇需要或不需要空白校正和靈敏度校正（一般為不要），然后點(diǎn)擊“下一步”；iv 輸入待測(cè)樣品數(shù)量，名稱，起始編號(hào)，以及相應(yīng)的稀釋倍數(shù)等信息，點(diǎn)擊“完成”。5設(shè)置參數(shù)：點(diǎn)擊“參數(shù)”圖標(biāo)，彈出測(cè)量參數(shù)窗口。i “常規(guī)”：輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品，空白樣品，未知樣品等的測(cè)量次數(shù)（測(cè)幾次計(jì)算出平均值），選擇測(cè)量方式（手動(dòng)或自動(dòng)，一般為自動(dòng)），輸入間隔時(shí)間和采樣延時(shí)（一般均為1 秒）；ii “顯示”：設(shè)置吸光值最小值和最大值（一般為 0-0.7 ），刷新時(shí)間（一般為300 秒）；iii “信號(hào)處

29、理”：設(shè)置計(jì)算方式（一般火焰吸收為連續(xù)或高峰），積分時(shí)間和濾波系數(shù)（積分為 1，系數(shù)為0.3 秒）；iv “質(zhì)量控制”：適用于帶自動(dòng)進(jìn)樣的設(shè)備；點(diǎn)擊“確定”，退出參數(shù)設(shè)置窗口。6測(cè)量i 依次打開空氣壓縮機(jī)的風(fēng)機(jī)開關(guān)，工作開關(guān)，調(diào)節(jié)壓力調(diào)節(jié)閥，使空氣壓力為0.2-0.25MPa打開乙烘鋼瓶主閥，調(diào)節(jié)出口壓力為0.05-0.06 MPa ,檢查水封；點(diǎn)擊“點(diǎn)火”圖標(biāo)，火焰穩(wěn)定后，首先吸噴純凈水（將塑料管插入到蒸儲(chǔ)水中）15 min,防止燃燒頭結(jié)鹽;ii 點(diǎn)擊“測(cè)量”，吸噴空白液（將塑料管插入到空白液中）校零，即線平直后，吸噴標(biāo)準(zhǔn)溶液，點(diǎn)擊“開始”；每測(cè)一次標(biāo)準(zhǔn)溶液前，均需吸噴空白液校零，最終得到標(biāo)

30、準(zhǔn)曲線；按照相同操作方法測(cè)量未知樣；測(cè)量完后，點(diǎn)擊“終止”，退出測(cè)量窗口，關(guān)閉乙炔鋼瓶主閥，點(diǎn)擊“確定”，退出“熄火提示窗口”吸噴純水 1 分鐘；iii 點(diǎn)擊“視圖”下的“校正曲線”，查看曲線的相關(guān)系數(shù)，決定測(cè)量數(shù)據(jù)的可靠性，點(diǎn)擊“保存”或“打印”處理；7關(guān)機(jī)依次關(guān)閉AAwin軟件，原子吸收主機(jī)電源。乙烘鋼瓶主閥，空壓機(jī)工作開關(guān)，按放水閥， 排空氣壓縮機(jī)中的冷凝水，關(guān)閉風(fēng)機(jī)開關(guān)，退出計(jì)算機(jī)windows操作程序，關(guān)閉打印機(jī)，顯示器和計(jì)算機(jī)電源。蓋上儀器罩，檢查乙炔是否已經(jīng)關(guān)閉，清理實(shí)驗(yàn)室。四、儀器和試劑1、儀器：TAS-990型原子吸收分光光度計(jì)，鎂元素空心陰極燈，乙烘,空氣供氣設(shè)備；容量瓶（

31、 50 mL 17 支， 100 mL 1 支）；吸量管（1 mL 1 支， 5 mL 3 支）。2、試劑：10.00 ug/mL 鎂的標(biāo)準(zhǔn)溶液；10.00 mg/mL 鍶溶液；二級(jí)純鹽酸，硝酸，去離子水，自來(lái)水樣五.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容調(diào)整波長(zhǎng)到285.2 nm，燈電流3 mA;1、燃?xì)夂椭細(xì)獗壤倪x擇：調(diào)整空氣壓力為 0.2 MP價(jià)口流量，使霧化器處于最佳霧化狀態(tài)。再用去離子水調(diào)A=0,然后固定乙快壓力為0.05 MPa改變乙快流量，測(cè)量50 mL0.4 ug/mL 鎂標(biāo)準(zhǔn)液（含2.0 mL鍬溶液）的A值。記錄各種壓力、流量下的 A值（注意：每改變乙快 流量，都要用去離子水調(diào)節(jié) A至零。），經(jīng)若干次

32、測(cè)試后，從記錄結(jié)果選擇出穩(wěn)定性好且 A 值又較大時(shí)的乙快-空氣的壓力和流量。2、燃燒器高度的選擇：改變?nèi)細(xì)飧叨龋瑴y(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)鎂溶液的A值，選擇出穩(wěn)定性好且A值又較大的燃燒器高度。3、干擾抑制劑鍬溶液加入量的選擇：移取自來(lái)水樣 5 mL,分別放入6只50 mL容量瓶中，分 別加入2 mL 1:1 HCl;六瓶中分別加入0、1、2、3、4、5 mL鍬溶液，用水稀釋至刻度， 搖勻。每次用去離子水調(diào)A為零，依次測(cè)定各瓶試樣的吸光度，由測(cè)得的穩(wěn)定性好且A值較大的結(jié)果，選擇出抑制干擾最佳的鍬溶液加入量。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線白繪制：于6只50 mL容量瓶中，分別加入0、10、20、30、40、50 ug鎂的標(biāo)準(zhǔn) 溶

33、液，每瓶中加入選得的最佳量鍬溶液，每次用去離子水調(diào)零，依次測(cè)得各瓶溶液的 A值，以此數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、自來(lái)水樣的測(cè)定：準(zhǔn)確移取 5 mL自來(lái)水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中加入最佳量的鍬 溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零，測(cè)出其 A值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出 水樣中鎂的含量R!6、回收率的測(cè)定：準(zhǔn)確移取 5 mL自來(lái)水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中，加入已知量的鎂 標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加最佳量的鍬溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零，測(cè)出 其A值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出鎂的含量，根據(jù)回收率公式計(jì)算出樣品的回收率。六.記錄及分析結(jié)果波長(zhǎng)： 燈電流： 乙快-空氣壓力：乙快-空

34、氣流量： 助燃器高度： （1）鍬溶液加入量的選擇試液編號(hào)鋰溶液的量/mL吸光度1.02.03.04.05.0(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪與鎂含量的測(cè)定試液編號(hào)鎂含量/ 11 g吸光度(3)七.1.2.3、10210320430540650未知液根據(jù)下式計(jì)算出鎂的濃度:回收率的測(cè)定試液編號(hào)加入的鎂量/心g 吸光度總的鎂含量/心g根據(jù)下式計(jì)算出鎂的回收率:課堂提問(wèn)原子吸收光譜分析法的原理?連續(xù)測(cè)定幾個(gè)試樣為什麼每次都要用去離子水調(diào)零?是否可用回收率來(lái)校正測(cè)量結(jié)果？如何校正?實(shí)驗(yàn)七離子交換液相色譜法分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握AKTA Purifier-900 型液相色譜儀的操作。2 .掌握離子

35、交換色譜分離蛋白的原理。3 .掌握液相色譜定性分析方法。4 .掌握液相色譜定量分析方法。二原理圖 7-1 高效液相色譜示意圖1 液相色譜定性、定量原理（面積歸一化法）：定性原理：利用物質(zhì)在液固兩相中的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離的分析方法，稱之為液相色譜法；按照同一蛋白在相同色譜條件下保留時(shí)間（tR） 一致，進(jìn)行液相色譜的定性分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為液相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情況，通常的定量方法分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合蛋白樣中所有組分均被洗脫時(shí)，可用面積歸一化法計(jì)算各組分的含量，其計(jì)算公式如下所示：.f 一 , 一 一 -一 , 一 -一 , 其中fi為相

36、對(duì)校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子的比值：2離子交換色譜分離蛋白的原理：利用各蛋白質(zhì)與固定相間的靜電作用大小的差異性，在適當(dāng)?shù)纳V條件下（色譜柱、流動(dòng)相、洗脫方式等），能將各蛋白組分分開，其色譜圖如圖6-2所示。圖 7-2 IDA- 裸柱分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物色譜圖1. BSA 2. RNase 3. Cyt-C 中雜蛋白4. Cyt-C 5. Lys色譜條件：色譜柱：IDA-柱（100 X 4.6 mm I.D.）; 流動(dòng)相：A: 0.02 mol/L KH 2PO （pH 6.0）;B: 0.02 mol/L KH 2PO4 （pH 6.0） + 0.5 mo

37、l/L NaCl；梯度洗脫: 20 min B 從 0 到 100%；流速：1 mL/min ; 檢測(cè)器：UV （入=280 nm）;進(jìn)樣量：15 g L;各蛋白濃度：2.0 mg/mL.三 AKTA Purifier-900 型生物色譜儀的操作1 開機(jī)：依次打開計(jì)算機(jī)、生物色譜儀主機(jī)，待色譜儀初始化完畢后，點(diǎn)擊“Unicorn ”圖標(biāo)，輸入用戶名和密碼（均為“default ”），則 UNICORN Message、 r Method Editor 、System Control 、 Evaluation 四個(gè)窗口同時(shí)出現(xiàn)。2樣品測(cè)試操作i 手動(dòng)式操作：A.色譜柱的平衡：點(diǎn)擊“ System

38、 Control 窗口下“ Manual”菜單，選擇“ Alarm & Mon”窗 口，設(shè)定色譜柱最大限壓和操作波長(zhǎng)，點(diǎn)擊“ insert ;選擇“ Pump窗口，設(shè)定操作流 速，點(diǎn)擊“insert ”，再點(diǎn)擊“ Execute”，讓色譜柱在上述條件下平衡；待基線平直后， 在“Alarm & Morn"窗口中點(diǎn)擊“ Autozero UV ,進(jìn)行自動(dòng)校零，再在此條件下讓柱子平衡 幾個(gè)柱體積。B.樣品測(cè)試：選擇“ Flowpath”窗口，選擇“inject ”，點(diǎn)擊“insert ,選擇“ Pump窗口，設(shè)定洗脫方式和洗脫時(shí)間，點(diǎn)擊“insert ”；回到“Flowpa

39、th ”窗口，將樣品注入樣品環(huán)，選擇“inject ”， 點(diǎn)擊“ Execute ”，開始進(jìn)行樣品的測(cè)試；當(dāng)圖譜中紅線出現(xiàn)時(shí)（表明樣品已進(jìn)入系統(tǒng)），將選擇“Flowpath ”窗口中的“l(fā)oad ”，讓樣品環(huán)復(fù)位。C.系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。ii 自動(dòng)操作：A.方法編*5:在“ Method Editor ”中選擇“新建”圖標(biāo)，選中“ Method Editor "，點(diǎn)擊 “OK ,進(jìn)入梯度編寫程序，按照梯度要求編寫成序。編寫好后，在“ File ”中選擇 “save as”，將編輯好的方法保存到設(shè)定的文件夾下（一般為C：

40、'defaultMethod）。B.方法運(yùn)彳T：在“ System Control 中選擇“ Run”，然后從編輯的方法文件中選擇出自己的 方法文件，點(diǎn)擊“ OK ,在"Result name ”對(duì)話框中，點(diǎn)擊“ Browse”，選中保存實(shí)驗(yàn) 結(jié)果數(shù)據(jù)的文件夾，給出文件名；將待測(cè)樣品注入樣品環(huán)，點(diǎn)擊“Start ”，開始進(jìn)行樣品的測(cè)試。C.系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。3數(shù)據(jù)處理：在“Evaluation ”窗口中打開保存的數(shù)據(jù)文件，手動(dòng)操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在“C：.default中的Manual Runs（ System 1

41、）”中按時(shí)間順序查找；自動(dòng)操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在"C: 'default中自己設(shè)定的文件中查找。選擇“ File ”里“ Open to Compare”中的“Curves”進(jìn)行圖譜的對(duì)比。4數(shù)據(jù)輸出：在“Evaluation ”窗口中打開保存的數(shù)據(jù)文件，得到色譜圖，選擇“File ”里“Export”中的“Curves”，選中圖譜的波長(zhǎng)，點(diǎn)擊“ Select ”確認(rèn)后，點(diǎn)擊 “Export" ；選擇圖譜輸出路徑以及文件名，點(diǎn)擊“ OK ,從"Excel”中打開該文件，即 可將色譜圖由ACSII碼轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可用“ Excel”或“Origin ”作

42、圖軟件，做 出對(duì)應(yīng)的色譜圖。5.關(guān)機(jī)：點(diǎn)擊 “ System Control 中的 “End'鍵，關(guān)閉 " UNICORN Message r,點(diǎn)擊 “System Control,選中“ Unlock”，點(diǎn)擊“ OK ,生物色譜儀主機(jī)系統(tǒng)退出（計(jì)算機(jī)與主機(jī)脫機(jī)），依次關(guān)閉生物色譜儀和計(jì)算機(jī)。四儀器和試劑1 .儀器：AKTA Purifier-900 型液相色譜儀；IDA-硅膠柱；微量注射器。2 .試劑：BSA RNase Cyt-C、Lys標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL ,以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液；其它試劑均為 分析純；水為二次蒸餾水。五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白的定性分析：根據(jù)保留信用蛋白

43、單樣標(biāo)準(zhǔn)液定性混合液中的四組分;C=1 mg/mL,進(jìn)樣量 10山標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物BSACyt-CRNaseLyst R2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白的定量分析：歸一化法計(jì)算各托白組分的含量i .校正因子的求?。簩⒁阎M分量（g）的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用“計(jì)算校正因子”法計(jì)算出校正因子；C=1 mg/mL,進(jìn)樣量 10 L標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物BSACyt-CRNaseLysm （g）ii .待測(cè)樣品百分含量的計(jì)算（“校正歸一”化法計(jì)算）：六.記錄及分析結(jié)果打印出實(shí)驗(yàn)結(jié)果：包括保留時(shí)間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖譜。七.課堂提問(wèn)1 .離子交換色譜分離蛋白的機(jī)理？2 .保留值定性分析的原理？3 .如何用面積歸一化

44、法進(jìn)行定量？實(shí)驗(yàn)八小鼠腎臟組織蛋白的雙向電泳分離一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握2-DE電泳儀（PROTEAN IEF Cell等點(diǎn)聚焦儀，PROTEAN! Xi垂直電泳槽）的操作2 .掌握2-DE分離蛋白質(zhì)組的原理。3 .掌握2-DE定性分析方法。4 .掌握2-DE定量分析方法。圖8-1 2-DE 電泳儀1. 2-DE分離原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向 SDS-PAGE基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離。這樣就從兩方面 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，最終得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。如圖 8-2所示：圖8-2被動(dòng)式再水合低分子區(qū)小鼠腎臟組織蛋白的2-

45、D圖譜17cm pH 3-10 IPG 膠條，200X 200X 1.0mm SD照一月里（12%）, 120ug 上樣量，銀染2. 2-DE定性原理：通過(guò)蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對(duì)比，根據(jù)同一蛋白點(diǎn)在凝膠上所處的位置相同 進(jìn)行定性。3. 2-DE定量原理：通過(guò)蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對(duì)比，根據(jù)蛋白點(diǎn)顏色的深淺、以及蛋白點(diǎn)的大小進(jìn)行初步定量。三、2-DE操作步驟（一）第一向等電聚焦1. 水化液的制備：i從冰箱中取-20 C冷凍保存的水化上樣緩沖液（I ）（不含DTT；不含Bio-Lyte ） 一小管（1ml/ 管），置室溫溶解。ii 在小管中加入 0.01g DTT,澳酚蘭，3.5ul （0.5%v/v）

46、 IPG buffer （pH 3-10） 振蕩混勻， 13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。iii從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，振蕩器上振蕩混合，13200rpm離心 15min除雜質(zhì)，取上清。2. 點(diǎn)樣、上樣i從冰箱中取-20 C冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 3-10）,室溫中放置10分鐘。ii沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。iii當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用銀子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。

47、iv將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。v 在每根膠條上覆蓋2-3ml 礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。3. IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為 20C）i 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子，設(shè)置等電聚焦程序：S1 、 S2 、 S3 、 S4 、 S5 ；其中S1用于泡脹水化膠

48、條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦ii聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡、第二向 SDS-PAG電泳，否則將膠條置于樣品水化盤-20 冰箱保存。（二）平衡1 配制膠條平衡緩沖液I 。在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml 膠條平衡緩沖液I 。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。2 配制膠條平衡緩沖液II 。第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液 I 。并濾紙吸取多余的平

49、衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II ，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。（三）第二向SDS-PAG電泳1. 配膠、灌膠i配制10%勺丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板 夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整，聚 合 30 分鐘。ii 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ 水沖洗2. 轉(zhuǎn)移i從-20 C冰箱中取出的膠條，先于室溫放置 10分鐘，使其溶解。用濾紙吸去 SDS-PAG限內(nèi) 烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將

50、處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。ii 將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。11. 將 10倍電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，制成1 倍電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。iii 第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II 。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1 倍電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。將放有膠條的SDS-PAGEE膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封

51、膠液。iv 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。放置5 分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。3跑膠i在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流 （或電壓）（20-30mA/gel/17cm）, 待澳酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。ii電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切

52、角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。（四）銀染固定 一敏化 一洗滌 一銀染 一洗滌WT?顯影？ 找B? 洗滌？ 注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。四.儀器和試劑1 .儀器：PROTEAN IEF Cell等點(diǎn)聚焦儀，PROTEAN! Xi垂直電泳槽（Bio-Rad公司）；玻 璃勻漿器（陜西化玻器械有限公司）；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀 器廠）;電熱恒溫水浴鍋（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；ULTFreezer （美國(guó)Thermo Forma公司）。2 .試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris ）,兩性離子表面活性劑（CHAPS,苯甲基磺酰氟（PMSF）,

53、 二硫蘇糖（DTT ,丙烯酰胺（Acrylamide ） , N,N -甲叉雙丙烯酰胺（N,N -Methylene bisacrylamide ）,過(guò)硫酸?。ˋPS,十二烷基磺酸鈉（SDS,四甲基乙二胺（TEMER 澳酚藍(lán)（Bromophenol Bule） , 2-琉基乙醇（2-ME），低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)均購(gòu)自華 美生物工程公司；載體兩性電解質(zhì)（CA pH=3.5-9.5 ）,購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù) 有限公司；礦物油（Silicon Oil ） , IPG干膠條均購(gòu)自Bio-Rad公司；其他試劑均 為國(guó)產(chǎn)分析純。五.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 .樣品的溶解預(yù)冷生理鹽水沖洗鼠腎臟組織 3次，迅速將清洗的組

54、織分割成適宜的小塊，濾紙吸取多余 的液體，稱量50mg濕組織，放入玻璃組織勻漿器中加 1mL裂解液（裂解液I : 9.5 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+ 4%w/v CHAPS 裂解液 口 ： 9.8 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+4%w/v CHAPS+1mmol/L PMSF+1mmol/L EDTA+65mmol/L DTT+ 0.5%v/v IPG buffer ,冰浴中勻漿，冰 上靜置10-15min, 17c下，15000rpm離心10min；取上清，用LOWORY定量5 ,蛋白濃度約為 20 mg/mL ,分裝于小離心管中，-78 C下

55、凍存?zhèn)溆?；取一定量上述樣品液，加再水合液?mol/L Urea+2%w/v CHAPS +微量澳芬蘭）稀釋至終體積 300仙L,混勻后室溫下靜置1hr, 離心后即為含樣品的再水合液。2 .凝膠電泳移取含有適量蛋白濃度的泡脹液 300uL,采用被動(dòng)式和主動(dòng)式（加 50V低壓）的膠內(nèi)樣品 再水合法泡脹17cm的IPG膠條16 hr。按照IEF程序20c下恒溫等電聚焦：0150V40min（線 性）；150500V 40min （線性）;5001000V1hr （線性）；5001000V1hr （線性）；1000 2000V1hr （線性）；20003000V1hr （線性）；30004000V 1hr （線性）；40006000V 1hr （線性）；60008000V 1hr （線性）8000V 4hr （快速）。聚焦后IPG膠條在6mL平衡緩沖液中（ 1.5 mol/L Tris-HCl（pH=8.8）+ 6 molL Urea + 2%（w/v） SDS+30%（