肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在大鼠急性肺損傷發(fā)生中的作用

1、    肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在大鼠急性肺損傷發(fā)生中的作用        摘要目的：觀察肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損在大鼠急性肺損傷發(fā)病中的作用及地塞米松的影響。方法：給Wistar 大鼠靜脈注射脂多糖（LPS 5mg/kg BW）復(fù)制急性肺損傷模型。 采用ELISA、放射免疫、原位雜交等多種方法測定肺組織ICAM-1mRNA表達(dá)、iNOS活性、血中TNF-、NO-2/NO3-、ACE含量及肺血管通透性、肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)、蛋白含量等的變化。結(jié)果：注射LPS后，肺血管ICAM-1 mRNA表達(dá)

2、增加，從1 h開始至24 h達(dá)高峰。肺組織勻漿iNOS活性升高、肺血管通透性升高、肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，巨噬細(xì)胞數(shù)量減少、蛋白含量增加，血中TNF-、NO2-/NO3-含量升高而ACE含量下降等變化多在注LPS后2 h明顯。預(yù)先給予地塞米松對上述多種指標(biāo)的變化有明顯緩解作用。結(jié)論：提示LPS通過損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致急性肺損傷，地塞米松對其有一定保護(hù)作用。 主題詞肺；內(nèi)皮，血管； 細(xì)胞； 內(nèi)毒素類中分類號R563文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)09-0831-04 Effect of pulmonary vascular endothelial cells on t

3、hedevelopment of acute lung injury in ratsYANG Hong, SI Qin, SUN Ren-yu(Department of Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences,School of Basic Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100005， China)AbstractMeSHLung; Endothelium, vascular; Cells; E

4、ndotoxins急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是臨床ICU中一類極常見且十分兇險(xiǎn)的病癥1，2，如不及時(shí)糾正并發(fā)癥，極易引起病人轉(zhuǎn)為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）導(dǎo)致死亡。我國尚無有關(guān)發(fā)病率的報(bào)道，美國每年有150 000人發(fā)病。過去，人們多集中在對中性粒細(xì)胞及其釋放的炎癥介質(zhì)的研究，雖取得一定進(jìn)展，但針對ALI這一類以血管通透性增加為特征的炎癥綜合征，最有效的方法莫過于直接觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells， VEC）在ALI發(fā)生中的作用。本實(shí)驗(yàn)整體觀察脂

5、多糖（lipopolysaccharide, LPS）對大鼠肺血管通透性的影響，肺泡灌洗液中細(xì)胞，蛋白的變化，肺血管ICAM1mRNA表達(dá)，以及血中TNF-、NO2-/NO3-、ACE含量和肺組織iNOS活性的變化，以探討VEC在ALI發(fā)生中的作用。本研究還觀察地塞米松對ALI大鼠上述指標(biāo)變化的影響，為ALI的治療提供一條思路。材料和方法一、試劑脂多糖（LPS O55B5 Sigma），L-（2，3，4，5-3H）arginine(37 MBq/mL,Amersham life science),NG-nitro-L-arginine, DIG labeling and Detection k

6、it(Boehringer Mannheim),dextran sulfate,yeast extrant,Dowex 50w xg 200-400mesh(Sigma),TNF-檢測試劑盒，NO測試盒(購自邦定公司)，evans blue,地塞米松, 甲酰胺二、 大鼠急性肺損傷模型及分組雄性Wistar大鼠（200-350 g）共160只，購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病研究所實(shí)驗(yàn)動物部，大鼠經(jīng)腹腔注射烏拉坦麻醉后，舌下靜脈注射LPS（5mg/kg BW）復(fù)制ALI模型。動物分組：(一)對照組：舌下靜脈注射生理鹽水，2 h后采集標(biāo)本。 (二)ALI組：注射LPS后，分別于1、2、6及24 h采集

7、樣品。(三)地塞米松組：注射LPS前1 h，腹腔注射地塞米松(70 mg/kg BW)，注射LPS后2 h采集樣品。各組肺組織標(biāo)本行常規(guī)光鏡包埋切片，冰凍切片（8 m）備用。三、核酸探針制備3大鼠ICAM1 cDNA質(zhì)粒由本所病理生理室薛全福，王立榮惠贈。含目的片段的質(zhì)粒經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、抽提、純化后，得大量純化的含目的基因的質(zhì)粒，經(jīng)PstI/KpnI酶切，玻璃絲法回收探針，隨后使用Boehringer Mannheim公司生產(chǎn)的地高辛高效標(biāo)記檢測試劑盒標(biāo)記。四、肺組織濕重/干重及肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量測定開胸取出肺臟，稱濕重后，置烤箱（80，20 h）烤至恒重，稱干重，計(jì)算濕重/干重

8、比值。另一批大鼠，開胸后，行肺泡灌洗,灌洗液在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類，測定蛋白含量，計(jì)算肺通透指數(shù)（肺泡灌洗液蛋白/血漿蛋白，lung permeability index LPI）五、血清血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme ACE）及血漿TNF、NO2-/NO3-含量測定血清樣品加入底物緩沖液（0.1 mol/L K2HPO4 pH 8.3，0.3 mol/L NaCl,5 mmol/L hipparyl-L-histidyl-L-leucine）37,溫育15min，加入0.28 mol/L NaOH，1% OPT，10 min后，加3N

9、HCl，離心10min(3 000 r/min), MPF-4熒光分光光度計(jì)比色（激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長500 nm），測定ACE含量mol/(L*min)。 按說明書操作,測定TNF（ng/L）及NO2-/NO3-含量(mol）。六、肺血管通透性變化4各組動物均在注射LPS同時(shí)股靜脈注射Evans 藍(lán)(50 mg/kg BW),開胸后取出肺臟，剪去周圍組織，將肺浸泡于甲酰胺溶液中（甲酰胺用量20 mL/100 g BW）置4550溫箱中溫育72 h，待組織中色素與浸泡液中色素達(dá)到平衡，取出組織，離心，取上清液，用72型分光光度計(jì)620 nm進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Evans 藍(lán)含量

10、，以反映肺血管通透性的變化。七、 肺組織iNOS活性的測定5斷頭處死大鼠，速取左肺，按15（W/V）加入預(yù)冷的提取液，冰浴中勻漿，4，20 000 g離心60 min，收集上清液，即NOS提取液。用Lowry法測定NOS提取液蛋白含量，3H-精氨酸轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測定提取液NOS活性，以每min每g蛋白生成3H-胍氨酸的nmol數(shù)表示。八、肺組織切片的原位雜交6速取左肺，液氮速凍，恒冷切片，4多聚甲醛PBS固定，PBS洗，梯度乙醇脫水，5 mmol/L MgCl2結(jié)果一、 病理形態(tài)改變及原位雜交結(jié)果注LPS后1h組大鼠肺組織尤其是肺血管內(nèi)中性粒細(xì)胞滯留、聚集。以后隨時(shí)間延長的各組，中性粒細(xì)胞滯留、聚集

11、現(xiàn)象更加明顯，并有向毛細(xì)血管外移行增多趨勢。此外，肺臟還呈現(xiàn)廣泛的充血、水腫、肺泡膈增厚，肺泡腔積有滲出液。原位雜交結(jié)果：正常大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞有微弱的ICAM-1 mRNA表達(dá)，ALI組大鼠主要是肺靜脈VEC，其次是小血管和毛細(xì)血管VEC有ICAM-1 mRNA表達(dá)，表達(dá)逐漸加強(qiáng)，至24 h組達(dá)高峰。地塞米松組肺泡腔滲出少，肺臟充血、水腫減輕。同時(shí)肺VEC的ICAM-1 mRNA表達(dá)受抑制（見表1）。GroupValue of reflect lightControl9596.5±1 139.6LPS 1 h3 709.9±1 988.4*LPS 2 h1 140.3&#

12、177;878.0*LPS 6 h1 848.7±419.3*LPS 24 h678.8±389.6*Dexamethasone+LPS3 180.5±825.9     *P0.01 vs control; P0.01 vs LPS 2h group. 二、 肺組織濕重/干重，肺血管通透性變化ALI組大鼠肺組織濕重/干重的比值顯著高于對照組（P0.01）;同時(shí)肺組織浸泡液Evans藍(lán)含量也明顯高于對照組（P0.01）。地塞米松組肺組織濕重/干重比值及肺組織浸泡液Evans藍(lán)含量明顯低于ALI組（P0.01）。三、血清ACE

13、的變化注LPS后2 h血清ACE含量由對照組的144.4 降至106.92 mol/（L*min） （P0.05）。而注LPS后1、6及24h各組其血清ACE含量無明顯變化，分別為154.1、117.7、及156.2mol/（L*min）。四、肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)，蛋白含量及 LPI變化ALI組大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)，只有在給LPS后24 h組明顯高于對照組（P0.05）；細(xì)胞分類計(jì)數(shù)除給LPS后24 h組無明顯差異外，給LPS后1、2及6 h各組中性粒細(xì)胞數(shù)均高于對照組（P0.01），巨噬細(xì)胞數(shù)均低于對照組（P0.01）。給LPS后1、2及6 h各組肺泡灌洗液蛋白含量均明顯高于對照組（分別P

14、0.05、P0.01、P0.01），而各實(shí)驗(yàn)組LPI均高于對照組。地塞米松組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)，蛋白含量及LPI均低于ALI組（見表2）。GroupnCellcount（105）Neutrophil（）Macrophage（）Protein content（mg/L）LPI(10-3)Control6406±0.6323.29±9. 8471.56±9.5662.17±19.131.09±0.28LPS 1 h64.71±1.0755.47±7.58*37.06±8.25*180.83±117.70

15、*367±2.29*LPS 2 h63.78±1.9149.21± 8.58*36.23±13.75*240.33±109.62*4.78±1.90*LPS 6 h66.52±2.8162.77±3.23*31.32±4.28*204.00±107.01*3.45±1.87*LPS 24 h69.30±4.97*23.69± 17.9673.50±18.6382.33± 25.041.56±0.41*Dexamethasone+LPS5

16、4.82±3.2822.64± 16.8869.97±28.35116.00±38.472.88±0.19     *P0.05, *P0.01 vs control;P0.05,P0.01 vs LPS 2 h group. 表3給LPS后2 h大鼠血漿TNF-， NO2-/NO3-含量及肺組織iNOS活性變化Tab 3Alteration of serum level of TNF-， NO2-/NO3-GroupTNF-（ng/L）NO2-/NO3- (mol/L)iNOSnmol.g-1（prot

17、ein）.min-1Control2.19±0.89（7）2.10±0.34（6）37.25±12.10（7）LPS 3.00±0.49*（9）3.12±0.88*（6）109.87+50.28*（7）Dexamethasone+LPS 2.00±0.71（8）1.26±0.69（7）40.77±6.91（5）     *P0.05,* P0.01vs control;P0.01 vs LPS group.（）number of rats.五、血漿TNF-，NO2-/NO3-

18、含量及肺組織iNOS活性變化ALI組大鼠血清中TNF-，NO2-/NO3-含量明顯高于對照組（P0.05），同時(shí)肺組織勻漿 iNOS活性顯著高于對照組（P0.01），地塞米松組大鼠血中TNF-，NO2-/NO3-含量及肺組織中iNOS活性明顯低于ALI組(均P0.01,見表3)。 討論LPS作為一種致病因素，可直接損傷VEC，改變其表型。本研究表明，LPS使血管通透性增加7，大量富含蛋白質(zhì)的體液由肺血管內(nèi)溢出，形成肺間質(zhì)水腫，肺泡水腫，影響氣體交換及血氧合功能，造成廣泛的組織缺氧。有報(bào)道，在這個(gè)過程中，VEC與多形核白細(xì)胞（PMN）粘附是重要環(huán)節(jié)。LPS激活VEC使 ICAM1mRNA表達(dá)增強(qiáng)

19、，VEC與被激活的白細(xì)胞相粘附，使VEC長期暴露于白細(xì)胞釋放的氧自由基與多種蛋白酶的毒性作用之下。提示肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)在ALI發(fā)生中起重要作用。此外，ALI大鼠血中TNF-、NO含量，肺組織中iNOS活性升高，表明LPS可激活VEC，誘發(fā)其產(chǎn)生并釋放多種有害的炎癥介質(zhì)，并可進(jìn)入血管外間隙8。從而影響白細(xì)胞、血小板9、巨噬細(xì)胞、以及血管平滑肌細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)與功能，促使全身炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展。 若不阻斷，可形成一個(gè)逐級放大的連鎖反應(yīng)，形成第二次打擊。若預(yù)先給予地塞米松，LPS所致的變化顯著減輕。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，包括地塞米松在內(nèi)的類固醇抗炎藥，具有穩(wěn)定溶酶體膜，降低血管通透性，

20、抑制白細(xì)胞運(yùn)動，抑制免疫應(yīng)答和肉芽組織形成等多種抗炎作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示糖皮質(zhì)激素可能具有抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的作用，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不易被LPS激活，并通過減少中性粒細(xì)胞從血管內(nèi)滲出，減少炎癥介質(zhì)釋放，達(dá)到預(yù)防ALI發(fā)生的作用。此結(jié)果有助于對ALI發(fā)病機(jī)理的闡明，為尋找新的藥物和措施，防治ALI提供廣泛的應(yīng)用前景。Tel:E-mail: Nancyyh楊紅(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生理室， 北京 100005)斯琴(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生理室， 北京 100005)孫仁宇(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)

21、科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生理室， 北京 100005)參考文獻(xiàn)1Bernard GR,Artigas A, Brighet KL， et al. Report of the American-European consensus conference on ARDS:definition,mechanisms,relevant outcomes and clinical trial coordinationJ. Intensive Care Med,1994, 20:225-232.2Roger C,Charles J,Robert A ,et al .Sepsis:A new hypothesis for pathogenesis of the disease processJ. Chest,1997,112:235-243.3金冬雁， 黎孟楓，等譯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M. 北京： 科學(xué)出版社，1995. 55-56，19-24，259-262.4戴順齡,薛全福，王樹山,等.山莨菪鹼及川芎嗪預(yù)防大鼠肺水腫的實(shí)驗(yàn)研究J.中國病理生理雜志，1989,5（6）：354-357.5強(qiáng)文安，劉捷，呂芳玲,等.3H-精氨酸轉(zhuǎn)