苗藥八爪金龍半仿生提取工藝優(yōu)選及其提取物抑菌活性研究

1、苗藥八爪金龍半仿生提取工藝優(yōu)選及其提取物抑菌活性研究         10-08-31 09:04:00     編輯：studa20                    作者：王瑞，劉曉燕，馬立志，高蓬明，徐洪 【摘要】  目的通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選八爪金龍半仿生提取工

2、藝條件，并對(duì)其提取物的抑菌活性進(jìn)行研究。方法以巖白菜素含量、HPLC總面積、干浸膏得率為指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)判，并將3種工藝提取物的抑菌活性進(jìn)行比較。結(jié)果最佳半仿生提取工藝為八爪金龍加8倍、8倍、6倍水提取3次，3次煎水pH值分別為2.0，6.5，9.0；提取時(shí)間依次為85，40，20 min。綜合評(píng)價(jià)Y值及抑菌活性順序?yàn)椋捍继崛》?gt;半仿生提取法>水提法。結(jié)論優(yōu)選出的半仿生工藝是可行的，且優(yōu)于水提工藝。 【關(guān)鍵詞】  八爪金龍；半仿生提??；工藝條件；抑菌活性Abstract：ObjectiveTo obtain the best extraction condition of

3、 semi-bionic for Ardisia crenata Sims by uniform design and study its antibacterial activity.MethodsThe semi-bionic extraction (SBE) conditions were optimized by comprehensive evaluation with the content of bergenin, total HPLC integrate area and dried extract weight were adopted as markers. The ant

4、ibacterial activities of extracts from three different processes were investigated. ResultsThe Ardisia crenata Sims was extracted in water 8, 8, 6 times as much as it for 3 times; the pH values of the water for the thrice extraction were 2.0, 6.5, 9.0; the extraction time were 85, 40, 20 min. The or

5、der of comprehensive evaluation value and antibacterial activities was as follows: AE, SBE, WE.ConclusionOptimization of SBE method of Ardisia crenata Sims by uniform design is available and better than WE method.Key words：Ardisia crenata Sims;   Semi-bionic extraction method;  

6、Process conditions;   Antibacterial activities    八爪金龍，被苗族奉為喉科良藥，為紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims的干燥根及根莖, 具清熱解毒、散瘀止痛、祛風(fēng)除濕之功能, 用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、心胃氣痛、勞傷吐血、跌撲損傷、風(fēng)濕骨痛1。該藥材在貴州省分布廣、蘊(yùn)藏量大，為貴州民間習(xí)用中藥。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該藥材提取物巖白菜素及其衍生物對(duì)白血細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、口腔上皮癌細(xì)胞、宮頸瘤、肝H22腫瘤等具有明顯抑制作用2及良好的抗HIV病毒作用3；所含三萜總皂苷具有抑制血小板凝

7、聚作用4；環(huán)苯縮酚酸肽具有降低血壓作用5。    半仿生提取法(Semi-bionic Extraction method，簡(jiǎn)稱SBE法)已在單方和復(fù)方制劑工藝中得到一定應(yīng)用，其結(jié)果表明該技術(shù)符合口服藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的原理，該工藝提取物更接近藥物在體內(nèi)達(dá)到平衡后的有效成分群，有可能替代傳統(tǒng)的中藥提取技術(shù)6。本研究通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法，以巖白菜素含量、HPLC總面積、干浸膏得率為綜合評(píng)判指標(biāo)，優(yōu)選出八爪金龍SBE工藝條件，并將其SBE工藝產(chǎn)物與醇提法產(chǎn)物、水提法產(chǎn)物進(jìn)行綜合評(píng)判指標(biāo)及抑菌活性對(duì)比。1  儀器與材料    高效液相

8、色譜儀(Agilent 1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器、原裝色譜工作站)；色譜柱：DiamonsilTM(鉆石)C18 (250 mm×4.6 mm, 5 m)；PHS2-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；AUW220D電子分析天平(島津)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；ES-315 TOMY高壓蒸氣滅菌鍋(基因公司)；BCN-1360B生物潔凈工作臺(tái)(廣東半球儀器廠)；GNP-9000系列生化培養(yǎng)箱(嘉興中新醫(yī)療儀器公司)。    八爪金龍樣品于2006-12采集于貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)，經(jīng)貴陽(yáng)學(xué)院生物教研室高蓬明副教授鑒定為紫金?？浦焐案鵄

9、rdisia crenata Sims植物，規(guī)范炮制。巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為：111532-2002-02)；甲醇(美國(guó)TEDIA公司，色譜純)；水為娃哈哈純凈水；大腸桿菌(Escherichia coli.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)由貴州大學(xué)生命科學(xué)院提供。抑菌活性實(shí)驗(yàn)中所使用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。其余試劑均為分析純。2  方法2.1  分析方法確立2.1.1 干浸膏得率干浸膏得率（%）=干浸膏質(zhì)量八爪金龍粉末質(zhì)量×100%2.1.2 

10、  巖白菜素含量測(cè)定    色譜條件7：色譜柱為DiamonsilTM(鉆石)C18 (250 mm×4.6 mm, 5 m)；流動(dòng)相為甲醇-水(2575)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流速1 ml·min-1。每次進(jìn)樣之前用流動(dòng)相平衡10 min。按該色譜條件下理論板數(shù)以巖白菜素峰計(jì)算不低于2 900，分離度不低于1.5。對(duì)照品及樣品譜圖見圖14。    對(duì)照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取巖白菜素對(duì)照品并用甲醇溶解、配成1.0 mg/ml的對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液依次配成0.05，0.1，0.2，0.4，0

11、.6，0.8，1.0 mg/ml的混合溶液。依次精密吸取10 l進(jìn)行分析。以巖白菜素的進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y= 54.34X +1.65，(r=0.999 2)，表明巖白菜素的進(jìn)樣量在0.510 g成良好線性關(guān)系。    樣品溶液的制備：精密稱取八爪金龍樣品0.1 g，置具塞錐形瓶中, 精密加入甲醇25 ml , 稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，微孔濾膜(0.45 m)過(guò)濾，即得，避光保存。    精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品溶液10

12、l，重復(fù)進(jìn)樣5次，RSD為1.97 % (n=5)，表明精密度較好。    穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一份樣品溶液，分別在0，4，8，10 h進(jìn)樣，巖白菜素含量RSD為2.16 %，表明樣品至少在10 h內(nèi)穩(wěn)定。    重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一份樣品，精密稱量，按“樣品溶液的制備”方法制備樣品溶液5份，分別進(jìn)樣，測(cè)定巖白菜素含量，RSD分別為2.24 % (n=5)，表明重復(fù)性良好。     10-08-31 09:04:00     編輯：studa202.2 

13、;  八爪金龍不同工藝提取物的制備2.2.1   水提(Water Extraction method, WE)法產(chǎn)物的制備稱取八爪金龍粗粉30 g兩份，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，加入其質(zhì)量8，8，6倍水，依次加熱回流3次，2 h/次。提取液用6層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)離心處理(2 000 r·min-1，20 min)，合并濾液并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，再放入真空干燥箱(60)內(nèi)制成干浸膏，稱重，置于干燥器皿內(nèi)備用，按“2.1.1”項(xiàng)法計(jì)算干浸膏得率及測(cè)定提取物中巖白菜素含量。2.2.2   醇提法(Alcohol Extraction method,

14、 AE)產(chǎn)物的制備依次使用8，8，6倍乙醇對(duì)30 g八爪金龍粗粉回流浸提，2 h/次，其余處理同上。23  SBE工藝的均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選及結(jié)果2.3.1  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與安排根據(jù)SBE理論方法6，在藥材粒度、煎煮加水量(8，8，6倍)、煎煮溫度及次數(shù)、過(guò)濾、濃縮等條件相同的前提下，確定考察的因素和水平。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及仿生學(xué)原理，人體胃、小腸、大腸的體液酸度最佳pH分別為2.0，7.5，8.3，以巖白菜素、干浸膏得率的標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果為考察指標(biāo)，使用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件DPS 7.55安排混合水平均勻設(shè)計(jì)表U9(9×33)，中心化偏差CD=0.2072安排實(shí)驗(yàn)(見表1)。其結(jié)果及

15、數(shù)據(jù)分析(見表2)。每次稱取30 g八爪金龍粗粉兩份，其余處理同上。表1  U9(9×33)混合水平均勻設(shè)計(jì)（略）表2  SBE工藝提取物各指標(biāo)成分含量及標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果（略）2.3.2  工藝條件的優(yōu)化為體現(xiàn)中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)8，以巖白菜素含量、HPLC總面積、干浸膏得率為指標(biāo)，按公式Xi.j=(Xi.j-j)/Sj進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理9。Xi.j為樣品中成分j的含量， j為9個(gè)水平樣品液成分j的標(biāo)準(zhǔn)差， Sj為9個(gè)不同水平樣品成分j的標(biāo)準(zhǔn)差。Xi.j為標(biāo)準(zhǔn)化值。根據(jù)各指標(biāo)在提取工藝中的主次地位，給予不同的加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化值 加權(quán)后求和后得

16、綜合評(píng)價(jià)Y值(Y = 巖白菜素含量 × 7 + 干浸膏得率× 2 + HPLC總面積 × 1)，并將Y值經(jīng)DPS 7.55進(jìn)行逐步回歸分析，(見表2)。將表2內(nèi)Y值(綜合評(píng)判指標(biāo))進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程：Y= -1 001.641 2 - 54.078 0X1 + 284.699 6X2 + 25.334 3X3 - 22.027 3X2 X2 + 12.149 1X1 X2 - 4.012 6X1 X3 - 1.875 4X2 X3，理論最大優(yōu)化值為Y= 14.12。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 6，F(xiàn)=7 520.078 9，而F0.01(4, 4)1

17、5.98，因此該方程在=0.01的水平上顯著。因此，用該模型預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)對(duì)八爪金龍的半仿生提取的影響是可行的。由方程得到的最優(yōu)提取工藝條件是：第1,2,3次煎水pH值分別為2.02,6.54,9.00，總煎提時(shí)間為2.35 h。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定其工藝條件為：第1次煎水用HCl調(diào)至2.0；第2,3次煎水pH分別為6.50，9.00；煎提總時(shí)間2.35 h，即依次為85，40，20 min。2.3.3  優(yōu)化條件驗(yàn)證分別取150 g八爪金龍粗粉3批，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行提取，測(cè)得平均巖白菜素含量為10.87 mg/g，RSD：3.39%；平均HPLC總面積5 949，RSD：4.63

18、%；平均干浸膏得率32.37 %，RSD：4.94 %；Y=14.36，與回歸模型預(yù)測(cè)值較為接近。2.3.4  抑菌活性研究(杯碟法)    供試樣品的制備：取3種工藝提取物分別稀釋成一定濃度梯度的水溶液(見表3)，備用。    培養(yǎng)基與菌種液的制備：培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，瓊脂粉15 g，NaC1 5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.2。    菌種液：將菌種進(jìn)行斜面活化3次后，于培養(yǎng)基斜面37培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取具有代表性菌體于肉湯培養(yǎng)基中混勻、37

19、培養(yǎng)24 h，取出作為原菌液。再用無(wú)菌生理鹽水稀釋，振蕩幾分種，調(diào)整菌濃度約為105 106 cfu/ml。    抑菌圈的測(cè)定：采用杯碟法比較八爪金龍不同工藝提取物的抑菌活性。取牛津杯(ID = 0.6 cm)，高壓滅菌，37 培養(yǎng)24 h。蒸餾水為空白對(duì)照，每樣品重復(fù)兩次，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。結(jié)果見表3。表3  不同工藝提取物對(duì)金色葡萄球菌、大腸桿菌、（略）3  結(jié)論    對(duì)3種工藝的巖白菜素含量、HPLC總面積及干浸膏得率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較 (表4)， AE法所得產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)，

20、而SBE法的綜合評(píng)判指標(biāo)較WE法更為接近AE法。八爪金龍?zhí)崛∥飳?duì)金色葡萄球菌具有明顯抑菌活性，大腸桿菌次之(表3)，3種工藝提取物對(duì)以上兩種菌的抑菌活性順序?yàn)椋篈E>SBE>WE。而SBE、WE法提取物對(duì)枯草芽孢桿菌略高于AE法，結(jié)合HPLC譜圖(圖24)，推測(cè)為不同溶劑對(duì)有效成分的浸出選擇性差異所致。表  不同提取物各指標(biāo)成分的含量及標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果（略）    本文首先對(duì)八爪金龍半仿生提取工藝的優(yōu)選，并將最佳工藝產(chǎn)物與醇提法、水提法產(chǎn)物的巖白菜素含量、HPLC總面積、干浸膏得率的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)及抑菌活性進(jìn)行了比較。相對(duì)于傳統(tǒng)水提工藝，半仿生提取工藝可有效降低浸膏得率，較傳統(tǒng)水提工藝為佳?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1貴州省中醫(yī)研究所. 貴州中草藥名錄M. 貴陽(yáng)：貴州人民出版社, 1998: 411.2邊寶林,王素芬,楊 健,等.朱砂根及同屬植物中三萜總皂苷及制備方法P. 中國(guó)專利，1270174. 2000. 10. 18.3Piacente S.