玉米中SOD的分離提取及性質(zhì)研究

1、 玉米中SOD的分離提取及性質(zhì)研究 學(xué)生姓名 王旭學(xué) 號(hào) 2013213827專業(yè)班級(jí) 生物工程13-01班指導(dǎo)教師 錢鑫華 樊婷婷院系名稱 生物與食品工程學(xué)院組 員 王旭，崔洪源，戴琦澤，范立峰 一，前言SOD廣泛存在生物界，是防御氧毒害的關(guān)鍵酶。SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三種類型的同工酶，它們的共同的生物學(xué)作用是專一的清除氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（對(duì)細(xì)胞組分及細(xì)胞器，尤其是生物膜有嚴(yán)重的損壞作用），具有抗衰老，抗輻射，抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病，自身免疫性疾病，炎癥等；在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老，抗炎，防曬等作用。

2、植物中大蒜的SOD含量豐富，所以，本實(shí)驗(yàn)研究大蒜中SOD的性質(zhì)，并且確定SOD同工酶的類型。根據(jù)SOD的性質(zhì)，我們采用鄰苯三酚自氧化法判斷同工酶的最適溫度，最適PH，以及雙氧水對(duì)酶的活力抑制。并采用改進(jìn)的自氧化法測(cè)酶的活力.1，SOD性質(zhì)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)簡(jiǎn)稱SOD，是一種生物活性蛋白質(zhì)，是人體不可缺少、重要的氧自由清除劑，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的以自由基為底物的酶。SOD金屬蛋白酶，對(duì)pH、熱和蛋白酶水解等反應(yīng)比一般酶穩(wěn)定。它廣泛存在于各類生物體內(nèi)，按其所含金屬離子的不同，可分為3種：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu·ZnSOD)、錳超氧化物歧化酶(

3、MnSOD)和鐵超氧化物歧化酶(FeSOD)2、鄰苯三酚自氧化法根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白質(zhì)具有的酶活性單位（Umg蛋白）來(lái)表示。因此，測(cè)定樣品的比活性必須測(cè)定：每mL樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)（mgmL）;每ml樣品中的酶活性單位數(shù)（UmL）。酶的純度越高酶的活性也就越高。SOD酶活性測(cè)定方法很多，如鄰苯三酚自氧化法、腎上腺素自氧化法、黃嘌呤氧化酶法、NBT光還原法、化學(xué)發(fā)光法等。在一般情況下，SOD酶活性只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法，本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開(kāi)始

4、后先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線性時(shí)間維持在34min。加入酶液則抑制其自氧化速度，在325nm處測(cè)定溶液的吸光度。酶活性單位采用1mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶定量為一個(gè)活力單位。鄰苯三酚自氧化速率隨其濃度的升高而增加3、不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品（即使是稀樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。雖然不連續(xù)電泳在緩沖系統(tǒng)的選擇和制膠（特別是梯度膠）的操作方面比較繁雜，但它可以得到電

5、泳分離最重要的指標(biāo)-高分辨，因而是目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。二，實(shí)驗(yàn)試劑玉米，氯仿-乙醇混合液、維生素、冷丙酮、鄰苯三酚、濃鹽酸、蒸餾水、雙氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、溴酚藍(lán)、5.0mol/L PH7.8 磷酸鈉、10 mmol/LHCl、Tris（三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘氨酸。1 2.45mol/LNBT溶液：稱取200mgNBT溶于蒸餾水中并定容至100ml置棕色試劑瓶中，避光貯存。2. 3.60mol/L PH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含2.8mol/L TEMED和2.8 維生素）：在100ml 3.60mol/

6、L PH7.8 磷酸鈉緩沖液中加0.42mlTEMED及1.32mg維生素 ，置棕色瓶中貯存。3 PH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀釋10倍。4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 緩沖液：稱取18.2g三羥甲基氨基甲烷（Tris）加24ml 1mol/L鹽酸，加水至100ml.5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 緩沖液:稱取Tris6.0g,加48ml 1.0mol/L 鹽酸溶液100ml 。6. 以及不同濃度的磷酸緩沖液。0.05mol/L， PH如下 5.86.57.07.37.6

7、7.87.98.3三，實(shí)驗(yàn)儀器移液管、離心機(jī)5000r/min,量筒、燒杯、研缽、玻璃棒、微量移液器、試管、分光光度計(jì)、1cm比色皿、恒溫水浴槽、電泳槽、電泳儀、培養(yǎng)皿、4*108日光燈、容量瓶、燒杯、冰箱等。四，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容玉米粗酶液的提取 1、提?。悍Q15g左右的玉米粒至于研缽（事先冷藏）中，使細(xì)胞破碎，再加入5ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸鹽緩沖溶液（事先冷藏），繼續(xù)淹沒(méi)攪拌15min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后10000r/min,離心10min，棄去沉淀，得蒜的提取液。 2、取出雜蛋白：玉米粒提取物加入2倍體積的氯仿-無(wú)水乙醇混合溶劑，攪拌15min，10000r/mi

8、n離心10min,取出雜蛋白，得粗酶液。 3、沉淀SOD：將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min,使SOD凝聚，10000r/min離心10min，得SOD沉淀溶于2ml PH7.8的磷酸鹽緩沖溶液中。SOD性質(zhì)的研究 表一鄰苯三氛自氧化法測(cè)定SOD的酶活性： 1、鄰苯三氛自氧化速率的測(cè)定：取兩支試管按表1加入25預(yù)熱過(guò)的緩沖液，然后加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三氛（空白管用10mmol/l HCL代替鄰苯三氛），迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化，得出每分鐘的自氧化速率。（可增減鄰苯三氛自的加入量以控制光吸收值

9、） 表一試劑空白管/ml自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL3310mmol/l HCL0.0150.0150mmol/l 鄰苯三酚-00052、SOD樣液活性的測(cè)定 樣品管取代自氧化管（表2）。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，再加鄰苯三氛。其余步驟同鄰苯三氛自氧化速率的測(cè)定。表二試劑空白管/ml自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL3310mmol/l HCL0015-SOD樣液-00150mmol/l 鄰苯三酚-0005 酶活性的計(jì)算：酶活性=(自氧化速率-樣液速率)/自氧化速率)*(100%)/(50%)*反應(yīng)液總體積*樣液稀釋倍數(shù)/樣

10、液體積 根據(jù)上述SOD酶活性的測(cè)定方法測(cè)定在不同PH下、不同溫度下、激活劑和抑制劑下求出酶活性。做出酶活性和不同PH曲線、酶活性與溫度曲線、以及在抑制劑條件下酶活力的大小。 不同PH對(duì)酶活力的影響：首先按下表（表三）加入PH分別為7.1的25預(yù)熱過(guò)的緩沖液，注意加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三氛，迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每 隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化，記錄自氧化速率和樣液速率，計(jì)算出酶活力。改變PH分別為7.7,8.2,8.6,9.0，記錄自氧化速率和樣液速率，計(jì)算出酶活力。表三試劑空白管/ml自氧化管/ml樣品管/mlPH 7.1 50m

11、mol/l Tris-HCL33310mmol/l HCL00150.01-SOD樣液-00150mmol/l 鄰苯三酚-00050005不同溫度對(duì)酶活力的影響: 首先取試管按下表加入0的緩沖液，然后加入相同溫度下的鄰苯三氛，迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。記錄自氧化速率和樣液速率，計(jì)算出酶活力。改變溫度分別為25,50,75,100。記錄自氧化速率和樣液速率，計(jì)算出酶活力。表四試劑空白管/ml自氧化管/ml樣品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL33310mmol/l HCL0015

12、0.01-SOD樣液-00150mmol/l 鄰苯三酚-00050005 抑制劑的影響：試劑空白管/ml自氧化管/ml樣品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL33310mmol/l HCL00150.01-SOD樣液-00150mmol/l 鄰苯三酚-0005000530%H2O25滴5滴5滴按下表25預(yù)熱過(guò)的液體，最后加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三氛，迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化，記錄自氧化速率和樣液速率，計(jì)算出酶活力。與不加抑制劑的相比較得出結(jié)論。表五PAGE定位染色法鑒定同工酶的類型按配方

13、（表七）在模具中灌注分離膠后，小心的在分離膠的表面加一層水（或水飽和的異丙醇或正丁醇），封住膠面，以促使聚合并使凝膠表面垂直。凝膠在30-40放置約40分鐘-1小時(shí)后，可以看到一個(gè)界面，表示凝膠聚合。吸水（或水飽和的異丙醇或正丁醇），用濃縮膠緩沖液貯液淋洗凝膠，然后灌注濃縮膠。并插入與模具大小相同，與凝膠厚度相當(dāng)?shù)氖嶙?。為防止氣泡陷入，梳子?yīng)傾斜插入。然后讓模具再靜止放置在30-40，聚合約40分鐘-1小時(shí)（注意在分離膠和濃縮膠聚合時(shí)，應(yīng)用日光燈照射以促使凝膠凝聚） 2、 加樣：按下表（表八）加入試劑，充分振蕩，使醇液與變性劑均勻混合。（Mn-SOD的活性受氯仿 乙醇的影響，CuZnSOD和F

14、e-SOD這兩種同工酶均對(duì)H2O2酶感，CuSOD對(duì)KCN 酶感，MnSOD不受CN的影響）3、 表七貯液100ML溶液中含量pH凝膠的配置A1M hcl 48MLTris 36gTemed 0.24ml8.9分離膠T=10%A:C:E:H2O=1：3:1:3CAcr 30gBis 0.8gE核黃素 4mgB1M HCL 48mlTis 5.9gTEMED 0.46ml6.7濃縮T=3.75%B:D:E:F=1:3:1:3DAcr 10gBis 2.5gF蔗糖 40g電極緩沖液甘氨酸 28.8g蒸餾水 1L8.3用時(shí)稀釋十倍編號(hào)試劑123粗酶液/ul20202040%蔗糖溶液/ul（內(nèi)含少量0

15、.1%溴酚藍(lán)）202020氯仿-乙醇/ul-7-30%H2O2/ul-7蒸餾水7-待各管溶液配置好后，分別取10ul加入凝膠的3個(gè)齒上。3、電泳：SOD同工酶的分離采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳。連接電源，調(diào)節(jié)電流至15mA，待樣品由濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí)，再將電流調(diào)至20-30mA，當(dāng)染料前言距離凝膠邊緣1-2cm時(shí)，關(guān)閉電源，電泳結(jié)束。4、SOD活性染色：取凝膠板，采用SOD負(fù)染色方法，按以下次序浸泡于培養(yǎng)皿中染色：在2.45×10 3mol/l氮藍(lán)四唑(NBT)黑暗下浸泡20分鐘；在3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸鈉緩沖溶液（內(nèi)含2.8×10-2

16、mol/l四甲基乙二胺(TEMED)、2·8×10-5mol/l核黃素）中，在黑暗條件下浸泡15min；5×10-2mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖溶液。凝膠板移入此浸泡液，在4×108W日光燈下光照射2030min。 經(jīng)上述染色和光照后的凝膠板，在藍(lán)色背景上出現(xiàn)清晰的透明的SOD活性染色帶。染色后的膠板用水漂洗數(shù)次后，比較觀察凝膠板條帶，分析得出結(jié)論。 五，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定，sod樣液測(cè)定.空白管000000000自氧化0.1230.2360.2540.2820.3170.3440.3890.4430.462pH值相同溫度不同

17、溫度、/時(shí)間00.511.522,533.540自氧化0.0070.0490.0730.1120.1320.1600.1850.2060.224樣品0.1300.1830.1870.1940.2050.21.0.2130.2190.22125自氧化0.1020.1240.2010.2360.2750.2900.3030.3100.319樣品0.1260.1770.2350.2870.3070.3310.3640.3480.33365自氧化0.0180.0600.0740.0880.1040.1210.1480.2290.286樣品0.1290.1610.1940.2040.2690.3320.

18、3570.3830.399100自氧化0.0230.0700.0790.0930.1100.1310.1560.2410.297樣品0.0880.1720.1950.2060.2570.3010.3120.3200.329溫度相同PH不同對(duì)SOD酶活性的影響Ph/時(shí)間00.511.522.533.547.1自氧化0.0200.0560.1180.1400.1390.1460.1530.1600.172樣品0.2590.3580.3600.3790.4040.4090.4160.4260.4357.7自氧化0.0120.0300.0530.0770.1060.1230.1550.1700.194

19、樣品0.4500.4800.4820.4870.5030.5160.5220.5360.5398.2自氧化0.1020.1240.2010.2360.2750.2900.3030.3100.319樣品0.1260.1770.2350.2870.3070.3310.3640.3480.3338.6自氧化0.0950.1590.1980.2330.2690.2870.3980.4680.495樣品0.0960.1480.1940.2250.2600.2650.3020.3560.4019.0自氧化0.0950.1460.2450.2680.3020.3560.4350.4890.536樣品0.09

20、90.1260.2560.2660.3120.3680.4010.4900.523抑制劑對(duì)酶活性的影響抑制劑/時(shí)間.不含30%的自氧化0.1020.1240.2010.2360.2750.2900.3030.3100.319樣品0.1260.1770.2350.2870.3070.3310.3640.3480.333含30%的自氧化0.0860.1100.1200.1270.1330.1370.1400.1430.146樣品0.0880.1230.1380.160.1540.1620.1690.1760.181數(shù)據(jù)處理結(jié)果PH相同溫度不同對(duì)SOD活性的影響 溫度/自氧化速率樣液速率酶活性/(U

21、/ml)00.03980.03802036250.083230.070462.50.063250.05780237.51000.040130.0390198.7PH自氧化速率樣液速率酶活性/(U/ml)7.10.009250.0090850.87.70.02370.019527828.20.083230.070462.58.60.083550.07650165.19.00.078530.0752087.5溫度相同PH不同對(duì)SOD酶活性的影響抑制劑對(duì)酶活性的影響自氧化速率樣液速率酶活性/(U/ml)不含有30%的H2O20.083230.070462.5含有30%的H2O20.031260.02

22、9892237凝膠板條帶觀察結(jié)果經(jīng)過(guò)三步染色，得到一條紫色條帶，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有成功。六，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，有很強(qiáng)的抗氧化作用，驗(yàn)證了前言中所說(shuō)的具有抗衰老，抗輻射，抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病，自身免疫性疾病，炎癥等；在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老，抗炎，防曬等作用。根據(jù)鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活力的原理，當(dāng)酶處 在最適溫度，最適PH條件下時(shí)酶活力最大。由數(shù)據(jù)可知最適溫度為攝氏度，最適ph值在左右。在分析H2O2對(duì)SOD的活力影響時(shí)，有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)知當(dāng)加入H2O2，吸光光度值增大，及酶的活力減小。所以H2O2對(duì)SOD有抑制作用.，提取酶液要在

23、冰水浴中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量保持酶在在低溫環(huán)境中，配置其他試劑時(shí)將酶液放入冰箱冷藏。在染色時(shí)前兩次一定要在黑暗中進(jìn)行，最后一次在光照下進(jìn)行。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論本次綜合實(shí)驗(yàn)個(gè)人認(rèn)為比較失敗，在實(shí)驗(yàn)前忘記預(yù)習(xí)，在實(shí)驗(yàn)中有時(shí)不知如何去做，在實(shí)驗(yàn)中犯了很多錯(cuò)誤，在此反思一下實(shí)驗(yàn)中所出現(xiàn)的問(wèn)題，以及做一下誤差分析。，沒(méi)有預(yù)習(xí)在實(shí)驗(yàn)中犯了許多錯(cuò)誤，如在第二次離心時(shí)忘記取上清液，耽誤了許多時(shí)間。，由于酶容易失活所以酶液是現(xiàn)配的，但是在第二天蔬菜并沒(méi)有買新的，蔬菜中的酶可能已經(jīng)失活，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。，在實(shí)驗(yàn)中個(gè)別組測(cè)酶活性時(shí)結(jié)果呈波浪形，與理論值不符。可能是由于在加酶液或鄰苯三酚是沒(méi)有攪勻所致。凝膠電泳最終沒(méi)有成功，認(rèn)為可能是隔夜之后蔬菜中的酶失活，但是測(cè)酶活力表明酶并沒(méi)有失活，可能是膠片的問(wèn)題。在測(cè)溫度對(duì)酶活性影響時(shí)，除度的樣品，其他試管必須水浴保存，在待測(cè)試再取出。參 考 文 獻(xiàn)1 李永樂(lè), 張焱.