目的基因的克隆

1、第九講 目的基因的克隆吳 乃 虎中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所2005年8月目 錄一、基因克隆的一般概念1 基因克隆定義2 “克隆”的不同含義3 基因克隆的過程4 DNA片段的產(chǎn)生與分離5 基因文庫二、基因克隆與分離的實驗策略1 物理策略2 生物策略3 克隆樣品的選擇4 基因文庫庫容測算三、cDNA基因克隆1 概述2 cDNA文庫的構(gòu)建3 低豐度mRNA之cDNA克隆4 稀少mRNA的cDNA克隆5 全長cDNA的合成6 cDNA克隆的優(yōu)越性四、基因組DNA克隆1 cDNA克隆的局限性2 基因組DNA克隆的優(yōu)越性3 構(gòu)建基因組文庫的載體類型五、基因定位定隆1 基因定位克隆概述2 RFLP分子

2、標(biāo)記3 RFLP作圖原理與步驟4 染色體步移5 大尺度物理圖譜的構(gòu)建目的基因的克隆一、基因克隆的概念1基因克隆的定義基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指將外源基因或DNA片段插入到克隆載體的分子上，構(gòu)成重組的DNA群體，并轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和繁殖，以便從大分子DNA或DNA片段混合物中分離純化目的基因或特定DNA片段的實驗操作，叫做基因克隆。嚴(yán)格地說，基因克隆應(yīng)叫做DNA克隆，因為被克隆的是基因組的全部(理論上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都編碼有基因。*要注意基因克隆與基因分離兩者在概念上的差別！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分離！盡管兩者之間存在密切

3、的相互關(guān)系。因此在日常交談中或是一般文字?jǐn)⑹鲋?，甚至于某些正式有關(guān)文件中，常把“基因克隆”與“基因分離”等同使用，不作區(qū)分，是不妥當(dāng)?shù)摹?有時我們所說的基因克隆，即所謂的“分子克隆”(Molecular cloning)，實質(zhì)上包含著目的基因的分離與鑒定兩個主要的內(nèi)容，基因克隆的全過程包括如下四個步驟：a.DNA材料的選擇與片段化；b.外源DNA片段與載體分子的連接；c.重組體分子的體外轉(zhuǎn)化；d.轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。2克隆的不同含義：(動詞、名詞與形容詞)(1)“克隆”的三種含義*1.“克隆”一詞作名詞時，是指從一個共同的祖先經(jīng)無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特

4、定的生命群體；*2.“克隆”一詞作動詞時，則是指從同一祖先經(jīng)無性繁殖產(chǎn)生這類遺傳分子上同一的DNA分子、細(xì)胞群體或個體群體的過程；*3.“克隆”一詞除了用作名詞和動詞之外，還可用作形容詞使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容詞，這是中文的一個有別于英文的地方。(2)名詞“克隆”的三個內(nèi)容在作名詞使用時，“克隆”涉及如下三個方面的內(nèi)容：a.在胚胎學(xué)、免疫學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科中，“克隆”一詞是指是同一祖細(xì)胞分裂而來的一群遺傳上同一的細(xì)胞群體；b.具有相同基因型的同一物種的兩個或多個個體亦可用克隆表示，因此從同一個受精卵分裂而來的單卵雙生子(monozygotic t

5、wins)便屬于同一克隆；c.在分子生物學(xué)中，帶有一段插入DNA序列的獨特的寄主/載體單位(例如細(xì)胞寄主中的重組質(zhì)粒載體)亦叫做克隆。3基因克隆的過程a.DNA分子的體外切割克隆用的DNA材料的片段化，它要求在其分子的準(zhǔn)確部位切割DNA分子的實驗方法，識別序列特異的核酸內(nèi)切限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA分子的體外切割提供了有力的工具。(A method for cutting DNA at precise locations)b.DNA分子的體外連接共價連接克隆DNA片段與載體分子的方法(A method for joining two DNA fragment covalently) DNA連接酶的發(fā)

6、現(xiàn)使這個問題得到了圓滿的解決。c.克隆載體的選擇選擇能夠自我復(fù)制的小分子量的載體DNA分子。(Selection of a small molecular of DNA capable of self-replication)待克隆的外源基因或DNA片段，可以被連接到質(zhì)?；虿《据d體的DNA分子上(克隆載體)。這些重組合的DNA分子是由兩個或數(shù)個不同來源的DNA片段共價連接而成，稱為重組體分子(recombinant DNAs)。d.重組DNA的轉(zhuǎn)化將重組DNA分子從試管中轉(zhuǎn)移到能使其進(jìn)行DNA復(fù)制的寄主細(xì)胞的方法。(A method for moving recombinant DNA fro

7、m test tube into a host cell that can provide the enzymatic machinery for DNA replication)e.轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定篩選或鑒定含有重組體DNA分子的寄主細(xì)胞的方法。(Method to select of identify those host cells that contain recombinant DNA)圖6-2 真核基因克隆的基本步驟4DNA片段的產(chǎn)生與分離我們知道所謂DNA文庫(DNA library)是指，來自特定生物有機(jī)體基因組的全部DNA片段之每一條片段，都與克隆載本單獨形成重組分子，此種

8、包含有該特定生物有機(jī)體之全部DNA片段的重組克隆分子的集合體，稱做DNA文庫。簡言之，是生物有機(jī)體的基因組DNA片段化之后形成的成千上萬的DNA片段都被同一克隆載體所克隆。因此生物有機(jī)體的全部遺傳信息通過基因文庫(DNA文庫)中的各種克隆得到了保存與體現(xiàn)，猶如書庫保藏著人類的全部知識一樣。由此可見，基因克隆與分離的頭一步就必須對基因組DNA進(jìn)行片段化。(1)核酸內(nèi)切限制酶的切割法真核基因組DNA經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶消化之后不進(jìn)行凝膠電泳分部分離而直接與克隆載體重組，這種克隆方法，在早期研究中使用過，特稱為“鳥槍法(shotgun approach)”。缺點：形成的重組體分子，實際上是一群帶有不同大

9、小的插入片段的重組載體的混合群體。造成目的基因篩選困難、工作量大、費時、費力、費錢。有些目的基因的核苷序列中可能會存在一個甚至數(shù)個限制酶識別位點。因此，克隆的目的基因有可能被切成若干片段。產(chǎn)生的有些片段可能太大，有些片段又可能太小，因此有些基因無法被克隆，形成不完全的基因庫。(2)機(jī)械切割法構(gòu)建DNA文庫最好使用隨機(jī)片段化的方法制備DNA的克隆片段。機(jī)械切割法和限制酶局部消化法處理基因組DNA，都可以產(chǎn)生出隨機(jī)片段化的DNA克隆片段群體；機(jī)械切割的標(biāo)準(zhǔn)狀況是：1500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵髦懈咚贁嚢瑁?0分鐘便可將DNA分子切成平均長度8kb的分子群體。(3)限制酶局部消化用來產(chǎn)生DNA克隆片段的限制酶

10、，必須考慮到它對DNA序列應(yīng)該具有最佳的識別位點分布規(guī)律。例如選用l噬菌體載體構(gòu)建基因文庫，就不能夠承載大小25Kb的EcoRI片段，在這種情況下最好選用識別序列為4bp的Sau3A、Hae以及AluI等限制酶。(4)DNA片段的大小分部*蔗糖密度梯度離心除去不適于克隆的過大或過小的DNA片段；*瓊脂糖凝膠電泳此法可以在很窄的范圍內(nèi)獲得高純度的某種DNA片段，或是大小同源的DNA片段。此法的缺點是，瓊脂糖的污染有時會抑制爾后的酶催反應(yīng)。5基因文庫(1)基因文庫和DNA文庫*基因文庫亦叫基因銀行(Gene bank)，系指在一種載體分子中隨機(jī)地克隆著某種生物、組織、器官或細(xì)胞類型的所有的DNA片

11、段而構(gòu)成的克隆集合體。在理想的情況下，它應(yīng)包含有該生物種全部的遺傳信息。在過去也稱基因文庫為鳥槍收集。*DNA文庫(DNA library)，基因文庫是在基因工程誕生的早期就已被使用，已經(jīng)習(xí)慣且通俗易懂。但近年來一般稱基因文庫為DNA文庫，這是一種更加符合實際更加科學(xué)的名稱。因為基因文庫從本質(zhì)上講是由來自染色體基因組的全部DNA片段組成的。(2)基因組文庫和cDNA文庫*基因組文庫(Genomic library)，系指生物體基因組DNA經(jīng)過核酸內(nèi)切限制酶作部分消化切割之后，克隆在適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后將這重組的混合物轉(zhuǎn)化給例如大腸桿菌這樣的寄主菌株，于是便構(gòu)成了包含該生物體整個基因組全部遺傳

12、信息的基因組文庫。*cDNA文庫(cDNA library)，將純化的某種生物的特定發(fā)育階段或組織之mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用合成雙鏈的DNA群體，同適當(dāng)?shù)妮d體分子重組之后轉(zhuǎn)化給寄主菌株，如此便構(gòu)成了特定的cDNA文庫。這種文庫與基因組文庫不同，它只包括特定的發(fā)育階段特定組織或器官中表達(dá)的基因，而不是全部的基因。二、基因克隆與分離的實驗策略1物理策略(physical strategy)基因的克隆與分離從大的方面看，可以區(qū)分為物理策略和生物策略兩大類。所謂物理策略是，首先構(gòu)建基因組的物理圖譜，如限制圖和測序圖，然后再據(jù)此確定基因的位置、全序列結(jié)構(gòu)、表達(dá)蛋白質(zhì)及其生物功能?；蚪MDNA是一種線性結(jié)

13、構(gòu)，使用物理策略分離目的基因，是按照染色體、YAC克隆(或BAC克隆)、Cosmid克隆、亞克隆這種由大到小的過程，逐漸克隆、分離和測序，最后完成目的基因及其基因組的全測序。2生物策略(biological strategy)從具有某種表型(生物功能)的個體或細(xì)胞的基因組中，分離出與表型相關(guān)的基因片段，再以此為分子探針，篩選出基因的全序列和表達(dá)序列。以這種方式克隆分離目的基因的策略，稱為生物學(xué)策略。3克隆樣品的選擇(1)蛋白質(zhì)大分子最早的功能基因克隆，是從分離純化與特異表型相關(guān)的蛋白質(zhì)開始的，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序反推出相應(yīng)的核苷酸順序，并以此為依據(jù)合成分子探針，從基因庫中篩選出目的基因。

14、*1.優(yōu)點：一般真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)種類的復(fù)雜度都比較低，僅有104種左右，故可比較容易地通過電泳分析得到間斷的可分辨的圖譜。因此，對于一些大量表達(dá)的功能蛋白質(zhì)之編碼基因的分離，還是比較容易的。*2.缺點：在任何類型的細(xì)胞中，都僅有少數(shù)基因表達(dá)成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，而且其表達(dá)活性和種類還隨著發(fā)育階段的不同及環(huán)境因素的變化而變化，所以在不同的發(fā)育階段和不同的環(huán)境條件下，不同類型的細(xì)胞中蛋白質(zhì)的種類都是不完全的，也不盡然相同。況且還有許多基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是未知的，或者其純化量不足以進(jìn)行氨基酸序列分析及相應(yīng)抗體的制備。因而要從蛋白質(zhì)水平來分離目的基因，顯然也是有困難的。(2)mRNA大分子*高等真核生物一般具

15、有105種左右不同的基因，但在一定的發(fā)育階段的單個細(xì)胞或個體中，都僅有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生出大約15000種不同的mRNA?？梢妋RNA的復(fù)雜度與蛋白質(zhì)的復(fù)雜度比較接近。*正是由于這種基因的差別表達(dá)，才決定了高等植物的發(fā)育分化、細(xì)胞周期、對環(huán)境壓力的反應(yīng)，以及衰老與死亡等所有的生命過程。*植物的正常代謝過程或者病理變化，以及光溫的育性效應(yīng)，不管其是由單基因控制的，還是由多基因控制的，本質(zhì)上都是由于基因表達(dá)的改變造成的。因此，比較不同的細(xì)胞或不同基因型的基因表達(dá)的差別，為我們了解植物的發(fā)育分化的分子本質(zhì)，以及克隆分離與此相關(guān)的基因打開了方便之門。*從mRNA出發(fā)克隆分離目的基因的技術(shù)程

16、序：a. 差別雜交技術(shù)(differential hybridization)b. 扣除文庫技術(shù)(subtracted library)c. mRNA差別顯示(mRNA differential display)d. 代表性差別分析法(representational difference analysis，簡稱RDA；中文又譯作cDNA差式分析法)(3)DNA大分子真核生物基因組DNA的復(fù)雜度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。因此無論是采用電泳分離技術(shù)還是通過雜交方法，都是難以直接分離到目的基因(或其片段)的。但基因組DNA具有完整性(包括protein和mRNA分子

17、所不具有的非編碼區(qū)序列)、恒定性(在單克隆細(xì)胞群體中，基因組DNA序列的種類和數(shù)量都是恒定的)、可直接進(jìn)行克隆、序列分析及雜交識別，因此是分離基因的主要樣品(出發(fā)材料)。以DNA為出發(fā)材料分離目的基因的優(yōu)點：a. 可以分離到完整的基因結(jié)構(gòu)序列，包括表達(dá)子和間隔子以及啟動區(qū)序列等；b. 數(shù)量恒定，不會受到生物體發(fā)育狀態(tài)、發(fā)育階段以及不同器官組織的影響；c. 不必經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄或是氨基酸測序合成引物等程序，便可直接進(jìn)行基因克??；d. 可直接進(jìn)行核苷酸序列分析；e. 可直接進(jìn)行核酸雜交鑒定；4基因文庫庫容測算(1)理論克隆數(shù)與實際克隆數(shù)由某種生物材料構(gòu)建的完全的基因組DNA之基因文庫，所應(yīng)具有的理論克隆

18、數(shù)和實際克隆數(shù)是有相當(dāng)差別的。*1.理論克隆數(shù)：是用給體生物(例如細(xì)胞、真菌及動物或植物)的基因組DNA總量(分子量大小)，除去克隆片段的平均大小所得的數(shù)值。理論克隆數(shù)受兩個因素的影響，其一是給體生物基因組分子量的大??；其二是克隆片段的平均分子量，亦即是所用的克隆載體可能承接的外源片段的克隆能力。*2.實際克隆數(shù)：由于DNA片段是隨機(jī)克隆的，因此理論克隆數(shù)只是基因組文庫所需的最小數(shù)值。從統(tǒng)計學(xué)上講，這意味著從一個只含有最低重組體DNA克隆數(shù)的基因庫中，篩選一種特定的單拷貝基因只有50%的幾率。而當(dāng)被篩選的基因庫是含有兩倍的最低重組體DNA克隆時，那么獲得某一特定基因的幾率則可達(dá)75%。因此，為

19、了達(dá)到以一種合理的幾率篩選出單拷貝目的基因，一個完全的基因文庫就必須含有3-10倍于最低重組體DNA克隆數(shù)。這個實際克隆數(shù)是由Clarke-Carbon公式計算。表9-1 不同生物的完全基因組DNA之基因文庫應(yīng)具有的理論克隆數(shù)和實際克隆數(shù)克隆片段之平均分子量大小(bp)基因組大小(bp)2×106(細(xì)菌)2×107(細(xì)菌)3×109(細(xì)菌)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)理論克隆數(shù)實際克隆數(shù)5×1034001831400018418600000276311010×10320091920009208300000138155020×

20、;1031004581000460315000069077440×10350278500230075000345386(2)Clarke-Carbon公式：這是在1975年由L. Clarke和J. Carbon提出的一種計算一個完全基因文庫所需要的實際克隆數(shù)的公式。上表所例的實際克隆數(shù)就是按照這個公式計算的。N=ln(1-p)ln(1-f)N=一個完全基因文庫所應(yīng)包含的重組DNA的轉(zhuǎn)化子克隆數(shù)(實際克隆數(shù))；P=重組體群體中出現(xiàn)目的基因序列的幾率(一般期望為99%)；f=為限制片段的平均大小與基因組總量之比值；以人b-珠蛋白基因(分子量約為1.5Kb)為例，其N值應(yīng)是：N=ln(1

21、-0.99)=9.2×106ln1-(1.5×103/3×109)*這個數(shù)字表明，如果使用的載體不具有選擇記號，那么就需要分離并鑒定9×106個獨立的菌落或克隆。*換句話說，我們必需擁有非常大量的重組體的DNA群體，才有可能匯集整個人基因組的全部DNA序列。要分離鑒定如此大量的克隆(9百萬個克隆)，再考慮到連接作用及轉(zhuǎn)化兩者的效率，那么要在一次實驗中產(chǎn)生如此大量的重組體的可能性，無疑是微乎其微的?？朔霓k法是選用克隆能力大的載體建庫：a. 應(yīng)用克隆能力為15kb(即插入片段平均分子量為15kb)的l載體，那么一個完全的基因文庫所需的重組體數(shù)量便可下降到9

22、×105；b. 如選用克隆能力為40kb的柯斯載體，這個數(shù)字還可以進(jìn)一步下降到3.5×105；三、cDNA基因文庫下圖示的是以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫的基本的步驟：圖9-1 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可合成出雙鏈cDNA，隨后將它與質(zhì)粒載體構(gòu)成重組體分子，并轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用這種方法能夠分離和擴(kuò)增我們所期望研究的基因或DNA片段。1cDNA基因克隆概述真核生物基因組DNA十分龐大，以人的為例高達(dá)3×109bp，而且含有大量的重復(fù)序列。因此無論是用電泳分離技術(shù)，還是通過雜交

23、的方法，都是難以直接分離到目的基因片段。這是以真核染色體基因組DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的困難所在。cDNA基因克隆可以部分解決上述的困難，這是因為它的復(fù)雜度僅及基因DNA的1%左右。cDNA基因克隆的基本過程是通過一系列的酶催反應(yīng)，使總poly(A)mRNA雙鏈cDNA與適當(dāng)載體分子重組轉(zhuǎn)化給寄主菌株細(xì)胞。如此便構(gòu)成了cDNA基因文庫，此種技術(shù)已成為當(dāng)今研究真核生物分子生物學(xué)及基因工程的基本手段之一。2cDNA文庫的構(gòu)建第一步：分離細(xì)胞的總RNA，并根據(jù)其3¢-端具有poly(A)尾巴的特征，應(yīng)用oligo(dT)法，從中純化出主要含mRNA的分部第二步：合成第一鏈cDNA，

24、即以mRNA分子為模板加上適當(dāng)?shù)囊?，引?dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。常用的有oligo(dT)引物法，和隨機(jī)引物法。應(yīng)用oligo(dT)纖維素柱純化poly(A) mRNA分子的流程示意圖圖9-3 用纖維素柱純化poly(A) mRNA的流程示意圖第三步：將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，其具體的辦法有：a. 自我引導(dǎo)合成法，系用堿處理使mRNA模板水解，并在第一鏈cDNA末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為第二鏈合成的引物；b.RNaseH降解法該酶可識別mRNA-DNA雜交分子，并將其中的mRNA模板消化成許多短片段第四步：將雙鏈DNA同適當(dāng)載體分子重組，并導(dǎo)入寄主細(xì)胞增殖，于是便構(gòu)成了

25、cDNA文庫。體外重組的方法有：a. 用末端轉(zhuǎn)移酶給雙鏈cDNA分子作同聚物加尾；b. 加adapter或linker；RNaseH酶降解法：圖9-4 合成雙鏈cDNA的RNaseH酶降解取代法具poly(A)的mRNA同oligo(dT)短序列保溫時，兩者便會雜交形成帶oligo(dT)引物的模板結(jié)構(gòu)，并在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成出mRNA-DNA雜交分子。加入RNaseH酶切割mRNA使之產(chǎn)生出許多缺口，隨后大腸桿菌DNA聚合酶I便以這些缺口為起點合成DNA。結(jié)果大部分的mRNA鏈都被新合成的DNA鏈取代，經(jīng)DNA連接酶封閉缺口形成雙鏈cDNA。以l為載體之cDNA庫構(gòu)建法：圖9-5 以l噬菌

26、體作載體構(gòu)建cDNA文庫的流程圖3低豐度mRNA的cDNA克隆(1)mRNA豐度在許多組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中，各種mRNA的含量都是極不相同的。有些類型mRNA含量十分豐富，每個細(xì)胞可擁有數(shù)千拷貝；有些類型mRNA則相當(dāng)稀少，每個細(xì)胞僅有少數(shù)幾個拷貝。所謂mRNA豐度，系指一個細(xì)胞 中某種特定mRNA分子拷貝數(shù)的多寡，即通常所說的豐富程度。據(jù)此可將mRNA分成高豐度、中豐度和低豐度三種不同的類型。表9-2 一種典型的真核細(xì)胞mRNA群體的豐度等級及其復(fù)雜性豐度等級相應(yīng)豐度等級的mRNA群體占總mRNA的百分?jǐn)?shù)在相應(yīng)豐度等級中所含的不同種類mRNA序列數(shù)目(個)每個細(xì)胞所含的相應(yīng)豐度mRNA序列的拷

27、貝數(shù)(個)高豐度22303500中豐度491090230低豐度291067014(2)高豐度mRNA的cDNA克隆有些基因的mRNA含量相當(dāng)豐富，例如：胰臟組織中的胰島素基因的mRNA；血紅蛋白細(xì)胞中珠蛋白基因的mRNA；雞輸卵管中卵清蛋白基因的mRNA。從這些組織或細(xì)胞中分離出來的總mRNA，不需進(jìn)一步純化，就可直接用來合成雙鏈DNA，并構(gòu)建基因文庫，分離上述這些目的基因。因此說，分離高豐度的mRNA的目的基因之cDNA克隆，實際上并不存在什么困難。例如應(yīng)用digo(dT)纖維素層析法，就可以從富含poly(A)mRNA制劑中純化出珠蛋白mRNA。(3)低豐度mRNA的cDNA克隆對于低豐度

28、的mRNA的cDNA克隆，通常是構(gòu)建cDNA基因文庫。組成一個合理的、完全的cDNA基因文庫所必須的重組體克隆的數(shù)目，可以根據(jù)Clarke-Carbon公式計算。在典型的情況下，對大多數(shù)的低豐度mRNA，建立105個克隆就已足夠了。大體上講來，在一定的發(fā)育階段，哺乳動物的細(xì)胞含有10000到30000種不同的mRNA序列。例如人成纖維細(xì)胞大約有12000種不同的mRNA序列。從表9-2可以看到，低豐度的mRNA每個細(xì)胞僅有14個拷貝左右，其總量約占總mRNA的30%，其中約有11000個左右不同種類的mRNA。因此，為獲得一個能夠代表全部低豐度mRNA的序列的cDNA基因文庫，所必須的最低克隆

29、數(shù)(理論值)應(yīng)是11000/0.30=37000。但考慮到在實驗取樣的差異；以及有些序列容易克隆，有些序列不易克隆等因素，因此就必須增加克隆數(shù)目。以人成纖維細(xì)胞為例，為使其中某些特異的低豐度mRNA之cDNA克隆達(dá)到99%的期望率，按Clarke-Carbon公式計算需要170000個克隆。這個數(shù)字是目前實驗技術(shù)所能達(dá)到的。因為無論是用同聚物加尾法，還是雙銜接物法，每微克的雙鏈cDNA都可以產(chǎn)生出1×1056×105個的菌落。4稀少mRNA的cDNA克隆一些含量極低的稀少mRNA的cDNA克隆，是無法應(yīng)用菌落原位雜交技術(shù)檢測的。根據(jù)一些作者的計算，使用體外標(biāo)記的mRNA或c

30、DNA作探針，可以檢測出僅占總mRNA 0.05%0.1%低豐度的mRNA的cDNA克隆。然而在實際操作中，要檢測出含量不到總mRNA 0.5%的低豐度mRNA之cDNA克隆，仍有極大的困難。下面介紹一些解決稀少mRNA的cDNA克隆的方法。(1)分部分離法應(yīng)用按分子量大小分部分離技術(shù)富集克隆的mRNA，其常用的方法有：a. 蔗糖梯度離心法；b. 變性凝膠電泳法。(2)寡聚脫氧核苷酸純化法用化學(xué)合成的寡聚脫氧核苷酸純化特定的mRNA。在已知某種待分離mRNA轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)的局部或全部氨基酸序列的情況下，就可以據(jù)之合成該mRNA之寡核苷酸互補(bǔ)鏈。這些人工化學(xué)合成的寡核苷酸序列，如果長度足夠(144

31、0個核苷酸)經(jīng)體外標(biāo)記之后，便可直接作為探針，從cDNA文庫中篩選出含有目的基因序列的克隆。(3)差別雜交篩選法應(yīng)用差別雜交法篩選特異mRNA之cDNA克隆，亦是有效分離特異mRNA的cDNA克隆的方法之一。如果在兩種mRNA制劑中，有多種mRNA序列是兩者共有的，但也有少數(shù)我們感興趣的mRNA序列僅為其中某一種mRNA制劑所特有。在這種情況下，便可以使用“差別雜交”技術(shù)，從熱休克或是用藥物、激素處理前后的細(xì)胞中分別提取mRNA制劑中，鑒定出特異的mRNA之cDNA克隆。5全長cDNA的合成為了克服自我引導(dǎo)法合成雙鏈cDNA的缺點，目前已發(fā)展出若干種不使用S1核酸酶(切割發(fā)夾結(jié)構(gòu))的全長雙鏈c

32、DNA的合成技術(shù)。(1)oligo(dG)引導(dǎo)合成法此法的核心技術(shù)是，在第一鏈cDNA尚未與mRNA模板分離之前，先在其3¢-末端加上一段oligo(dC)序列，然后通過堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA模板分子發(fā)生水解，回收全長cDNA。繼之以互補(bǔ)的oligo(dG)序列作引物引導(dǎo)第二鏈cDNA合成，形成全長的雙鏈cDNA。具體過程如下：以mRNA為模板合成第一鏈cDNA在mRNA模板未解離前，在其3¢端加上一段oligo(dC)序列堿性蔗糖梯度水解(alkaline sucrose gradient)mRNA模板回收全長第一鏈cDNA(其3¢-端具有一段poly

33、(dC)以互補(bǔ)的olig(dG)序列作引物合成第二鏈cDNA同聚物加尾或加銜接物，并與載體連接圖9-6 寡聚脫氧胸苷酸oligo(dG)引導(dǎo)法合成全長雙鏈cDNA在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，于第一鏈cDNA分子的3¢-末端加上一段oligo(dC)序列，于是便可以由oligo(dG)引導(dǎo)第二鏈cDNA合成。形成的無發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的全長雙鏈cDNA分子，經(jīng)過同聚物加尾或是連接上銜接物之后，直接克隆到載體分子上。(2)載體引導(dǎo)合成法載體引導(dǎo)的cDNA合成(vector-primed cDNA synthesis)具體步驟如下：利用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶，使載體分子線性化；在線性化的載體分子的3

34、62;-端加上一段oligo(dT)尾巴；通過mRNA之poly(A)與線性化質(zhì)粒oligo(dT)間的互補(bǔ)作用，mRNA便可退火連接到線性質(zhì)粒載體分子上；以oligo(dT)為引物合成第一鏈cDNA分子，形成cDNA-質(zhì)粒DNA重組體分子在其cDNA末端加上一段oligo(dG)尾巴，再作堿性蔗糖梯度離心，水解mRNA模板由于在堿性環(huán)境條件下，質(zhì)粒DNA雙鏈解離，因此原先與質(zhì)粒DNA連接的兩條cDNA-1和cDNA-2也就彼此分開加入超量變性的oligo(dC)加尾的質(zhì)粒DNA分子，與具oligo(dG)尾巴的cDNA分子連接形成雙鏈質(zhì)粒DNA-cDNA重組體分子具游離3¢-OH羥

35、基的oligo(dC)尾巴作引物，合成第二鏈cDNA，產(chǎn)生出雙鏈的重組的質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，獲得具不同插入取向的cDNA克隆圖9-7 載體引導(dǎo)法合成全長雙鏈cDNA(3)置換合成法這是一種十分有效的全長cDNA合成法，它分三步進(jìn)行：第一步：質(zhì)粒引物的制備即具有一段oligo(dT)尾巴的質(zhì)粒載體分子；第二步：具有oligo(dG)尾巴的接頭DNA的制備；第三步：構(gòu)建質(zhì)粒-cDNA重組體分子。質(zhì)粒引物通過其oligo(dT)與mRNA分子上的poly(A)配對，mRNA分子便可連接到質(zhì)粒分子上，作為模板合成第一鏈cDNA；此后在此cDNA鏈的自由端加上一段oligo(dC)尾巴，以便與具有

36、oligo(dG)的接頭分子退火連接；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌寄主細(xì)胞，經(jīng)DNA連接酶的封閉作用，形成質(zhì)粒DNA-cDNA重組體分子。6cDNA克隆的優(yōu)越性第一， 特別適用于RNA病毒的基因克隆cDNA克隆以mRNA為出發(fā)材料，因此對于其增殖不經(jīng)過DNA中間體的RNA病毒特別適用。例如流感病毒、呼腸孤病毒等。圖9-8 置換法合成全長cDNA(a)質(zhì)粒引物的制備；(b)具有oligo(dG)尾巴的接頭DNA的制備；(c)質(zhì)粒cDNA重組體的構(gòu)建第二，cDNA基因文庫篩選比較簡單，工作量小。典型的真核生物在特定的發(fā)育階段僅具有1000030000個不同種的mRNA分子；而標(biāo)準(zhǔn)的真核基因組DNA則可以形成10

37、0,000個到1,000,000個適于克隆的DNA片段；兩者相差10100倍！第三， 現(xiàn)假陽性的幾率比較低。由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，因此陽性雜交信號一般都可認(rèn)為是有意義的，其陽性克隆將會含有目的基因序列。第四， 具有特殊的用途?？寺≡谠松锶鏓.coli中表達(dá)的真核基因，應(yīng)用cDNA克隆技術(shù)分離；另一個特殊用途是基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)測定；cDNA克隆的第三個特殊用途是，關(guān)于在發(fā)育過程中時間調(diào)節(jié)基因(temporally regulated genes)的表達(dá)特征的分析；組織特異基因的表達(dá)特性的分析，亦要用cDNA克隆。四、基因組DNA克隆1CDNA克隆的局限性*1.cD

38、NA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，而沒有包括基因組DNA的間隔序列；*2.cDNA基因文庫中，克隆的分布狀態(tài)反映著mRNA的分布狀態(tài)，相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆難以分離；*3.不能夠克隆基因組DNA中非轉(zhuǎn)錄區(qū)段的序列，因此無法滿足研究基因編碼區(qū)外側(cè)的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能的要求；*4.cDNA基因文庫所函蓋的基因類型與數(shù)量直接受不同的組織和不同發(fā)育階段的制約，也就是說由不同組織或不同發(fā)育階段構(gòu)建的cDNA文庫是互不相同的。2基因組DNA克隆的優(yōu)越性*1.基因種類的全面性在一個完全的基因組文庫中，生物有機(jī)體的每一個基因都會有一個克隆。*2.基因結(jié)構(gòu)的完整性所克隆的基因可包括表達(dá)子、間隔

39、子、啟動區(qū)以及終止區(qū)等全部的基因結(jié)構(gòu)部分；*3.克隆基因的恒定性所函蓋的克隆基因的數(shù)量及種類不受組織及發(fā)育階段的影響。*4.基因的功能性適用于研究基因的表達(dá)與調(diào)控。3構(gòu)建基因組文庫的載體類型(1)應(yīng)用l噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫*1.過程(步驟)：制備出發(fā)材料之基因組DNA限制酶消化產(chǎn)生適于克隆的DNA片段克隆片段與l噬菌體載體重組轉(zhuǎn)化到大腸桿菌寄主細(xì)胞含有目的基因克隆的篩選*2.庫容大小計算：以人基因組為例，其分子量大小為3×109bp，經(jīng)EcoRI酶切消化產(chǎn)生的DNA限制片段平均大小為4kb左右。因此至少得篩選7×105以上的獨立的重組體，才有可能分離到一個含有目的基因序

40、列的克隆。但實際構(gòu)建的基因組文庫之庫容大小應(yīng)比這大310倍，所以實際庫容應(yīng)達(dá)106以上才有效(見Clarte-Carbon公式)。*3.可能產(chǎn)生的問題：平均酶切DNA片段為4kb之EcoRI限制片段，如此基因組DNA中的目的基因序列有可能被EcoRI切割一次甚至多次；這樣就不可能以單一片段形式獲得一個完整的基因序列。目的基因有可能被包容在克隆載體無法承載的大分子量的DNA片段之中。也就是說如此構(gòu)建的是不完全的基因組文庫，目的基因可能被遺漏掉。*4.解決辦法：通過基因組DNA隨機(jī)片段化，使之形成大小20kb的克隆片段，這些問題便可得到較為滿意的解決：a. 通過機(jī)械切割法，使基因組DNA發(fā)生隨機(jī)斷

41、裂；b. 采用兩種限制酶混合消化基因組DNA；把酶切作用控制在局部消化的程度，可得到平均大小為1030kb的DNA片段，然后再經(jīng)過蔗糖梯度離心或制備凝膠電泳，從中分離出20kb左右的DNA片段群體。c. Hae-AluI雙酶消化法這是兩種識別序列毫不相干的、形成平末端的核酸內(nèi)切限制酶。經(jīng)其對真核基因組DNA作局部酶切消化后，電泳分部收集20kb左右的隨機(jī)的DNA片段群體。但由于這兩種酶切割的結(jié)果是形成平末端，因此需加上適當(dāng)?shù)慕宇^，例如EcoRI接頭等等。為了防止克隆DNA片段中可能存在的EcoRI位點被切割，需對DNA作甲基化處理。Hae識別序列：5¢GGCC3¢AluI識

42、別序列：5¢AGCT3¢圖9-9 通過銜接物連接法在l噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫(a)加入Hae-AluI對真核基因組DNA作局部雙酶切割后，按大小分部分離收集20kb左右的片段；(b)用EcoRI甲基化酶處理破壞EcoRI位點后，再與EcoRI銜接物連接；(c)加入EcoRI核酸內(nèi)切限制酶消化產(chǎn)生粘性末端；(d)同樣用EcoRI核酸內(nèi)切限制酶消化Charon4A載體DNA；(e)按大小分部，除去中間區(qū)段；(f)插入片段與載體分子退火，并加DNA連接酶連接；(g)體外包裝；(h)感染大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成基因組文庫。(2)應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫l噬菌體載體克隆能力有

43、限，真正有效的范圍僅為15kb左右，而柯斯質(zhì)粒載體可克隆長約45kb的外源DNA片段(Gene)，而且還可以在體外被有效地包裝。因此柯斯質(zhì)粒載體十分適合于構(gòu)建真核基因組文庫。*1.建庫過程：應(yīng)用Sau3A酶局部消化真核基因組DNA收集MW=3545kb的DNA片段群體同業(yè)已用Sau3A同尾酶(如BglII)作了線性化處理的柯斯質(zhì)粒載體DNA連接體外包裝后感染大腸桿菌寄主細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，形成基因組文庫。*2.缺點：a.用菌落雜交法篩選柯斯質(zhì)粒載體之基因組文庫，其敏感性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于l噬菌體載體基因文庫的噬菌斑雜交法。(噬菌斑雜交的敏感性高于菌落雜交)；圖9-10 應(yīng)用Sau3A限制酶和l噬菌體載

44、體構(gòu)建真核基因組文庫(a)載體DNA片段的制備；(b)真核基因組DNA片段的制備；(c)體外重組構(gòu)建多連體分子；(d)體外包裝；(e)感染大腸桿菌細(xì)胞；B=BamHI末端；S=Sau3A末端。b.柯斯質(zhì)粒載體的基因組文庫不像l噬菌體載體基因文庫易于保藏。l噬菌體之基因文庫幾乎可無限期保藏，而柯斯質(zhì)粒載體則不行；c.一般說來，由噬菌斑雜交產(chǎn)生的本底，總要比由菌落雜交形成的本底低得多。五、基因定位克隆1基因定位克隆概述基因定位克隆(map-based cloning)，是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。從理論上講，任何一種可鑒定出有一個突變的基因，都可以通過基因定位克隆予以分

45、離。(1)基因定位克隆程序：將目的基因(即目的基因的突變)定位到染色體上在目的基因的兩側(cè)確定一對緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記利用最緊密連鎖的一對兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)，將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定基因組片段克隆并分離出來；根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力，從此克隆中鑒定出目的基因。(2)成功應(yīng)用基因定位克隆分離目的基因的必要條件：a. 以酵母人工染色體YAC(yeast artificial chromosome)為載體構(gòu)建含有大片段DNA的YAC庫；b. 要有可用的同目的基因緊密連鎖的DNA探針，理想的情況是兩者之間的遺傳圖距在數(shù)百kb之間。2RFLP分

46、子標(biāo)記用于染色體步移(chromosome walking)的分子標(biāo)記通常是RFLP。所謂RFLP(Restriction fragment length polymorphism)，即DNA限制片段長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。從不同生態(tài)型(ecotype)或不同的地理隔離群(geographical isolate)植株分離的總DNA中，同源的DNA分子之間通常會表現(xiàn)出序列的趨異性(divergence)，形成RFLP。也就是說它們中間已經(jīng)發(fā)生了堿基對的取代、缺失、插入或重排等變化，其中有些變化導(dǎo)致了限制酶切割位點

47、的更動。圖9-11 同一物種不同生態(tài)型之間DNA的趨異性產(chǎn)生的RFLP由于AT-GC堿基取代的結(jié)果，使生態(tài)型A之基因A序列失去了中間的一個EcoRI限制位點。(a)在生態(tài)型A的個體DNA中，兩個EcoRI限制片段都含有基因A的序列；(b)在生態(tài)型B的個體DNA中，基因A的全部序列都集中在一個大分子量的EcoRI限制片段中。放射自顯影照片中呈現(xiàn)的是與放射性標(biāo)記的基因A同源的DNA限制片段。在這類變化當(dāng)中，有不少都是屬于“沉默突變”(silent mutations)，但由于它們是發(fā)生在基因間隔區(qū)、間隔子以及表達(dá)子序列中的密碼子3¢堿基處(即“簡拼”或“搖擺”部位)，所以不會影響到表型特

48、征的變化。然而這些“沉默突變”偶爾也會移走或增加某些限制酶的切割位點，從而產(chǎn)生出RFLP。毫無疑問來自同一物種的不同地理隔離群、不同的生態(tài)型或是不同的近交系的DNA，往往也具有RFLP。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，經(jīng)EB染色后置UV下觀察，這些RFLP更轉(zhuǎn)變?yōu)槿庋劭梢姷碾娪咀V帶模式。因為這些RFLP是由于DNA分子中特定變化(突變)引起的，因此它們也能夠像其它遺傳標(biāo)記一樣進(jìn)行定位，成為一種十分有用的分子標(biāo)記。3RFLP的作圖原理與步驟在實際的RFLP作圖中，通?？傄婕霸S多種不同的生態(tài)型，并使用眾多的核酸內(nèi)切限制酶及大量的雜交探針，而且還需要通過計算機(jī)進(jìn)行結(jié)果分析。因此是一項相當(dāng)艱巨而煩

49、瑣的工作。(1)簡單例子：a.兩個不同的擬南芥生態(tài)型：Columbia生態(tài)型Niederzenz生態(tài)型b.兩個雜交探針：基因A基因Bc.一種限制酶：EcoRI圖9-12 擬南芥菜RFLP作用技術(shù)示意圖全部基因組DNA均用EcoRI切割；(a) Columbia生態(tài)型；(b) Niederzenz生態(tài)型；C=Columbia生態(tài)型；N=Niederzenz生態(tài)型；H=雜交生態(tài)型。(2)作圖步驟：從這兩個不同生態(tài)型的擬南芥菜提取的兩份總DNA各自經(jīng)EcoRI酶切后，分別作瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移分別同放射性標(biāo)記探針A和B雜交兩種生態(tài)形DNA同兩種探針雜交結(jié)果均呈現(xiàn)多態(tài)性現(xiàn)象。這說明：在

50、這兩個生態(tài)型的不同大小DNA限制片段上，都存在著A基因和B基因序列。4染色體步移(1)染色體步移實驗過程在染色體步移的起點克隆中，具有一個與待分離的目的基因盡可能靠近的已鑒定的分子標(biāo)記(在本例中是RFLP)構(gòu)建起點RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，并把其中最靠近目的基因的限制片段(B-H)亞克隆出來。將此B-H片段經(jīng)放射性標(biāo)記后用作分子雜交探針，從基因組文庫中篩選與起點克隆具有重疊序列的新克隆特稱一步克隆。重復(fù)上述各步：構(gòu)建一步克隆的限制圖亞克隆其中最靠近目的基因的H-E片段將此H-E片段用放射性標(biāo)記后用作分子雜交探針篩選基因組文庫從中得到與一步克隆具有重復(fù)序列的新克隆 特稱二步克隆重復(fù)上述步驟，周而

51、復(fù)始直至獲得目的基因。(2)應(yīng)用染色體步移法克隆目的基因的條件從原理上講，應(yīng)用染色體步移法克隆目的基因是比較簡單的過程，但它需要兩個已知的條件：第一， 需要知道起始克隆與目的基因的距離；第二， 起始克隆在連鎖圖上的取向，否則就需按雙向同時進(jìn)行染色體步移。圖9-13 應(yīng)用染色體步移法克隆目的基因(a)構(gòu)建起始克隆的限制圖；(b)亞克隆B-H限制片段；(c)用放射性標(biāo)記B-H片段作探針篩選一步克隆；(d)構(gòu)建一步克隆的限制圖；(e)亞克隆H-E片段；(f)放射性標(biāo)記H-E片段作探針篩選二步克隆。如此反復(fù)重復(fù)多次，直至獲得目的克隆。圖中B、E、H分別代表核酸內(nèi)切限制酶BamHI、EcoRI和Hind

52、。(3)影響因素影響染色體步移順利進(jìn)行的主要有如下兩個因素：第一， DNA重復(fù)序列的存在它會擾亂步移的順序性，使之“步入歧途”。例如在同一條染色體或另外染色體的其它位點拷貝重復(fù)序列。第二， 無法克隆序列的存在因為這樣的序列插入到使用的克隆載體上時，會發(fā)生致死效應(yīng)。5大尺度物理圖譜的構(gòu)建(1)問題的提出(a)不同的材料其1cM的圖距相當(dāng)于不同的kb，例如：人類1cM1000kb擬南芥1cM290kb番茄1cM750kb小麥1cM3500kb(b)克隆的DNA片段也不是越大越好。這是因為大多數(shù)高等植物基因組DNA中，都存在著相當(dāng)大量的散在的重復(fù)序列，所以克隆的DNA越長，出現(xiàn)重復(fù)序列的可能性也就越高，易使染色體步測出現(xiàn)困難；(c)克隆的DNA片段太短也不好，因為這樣會影響探針標(biāo)記強(qiáng)度，影響檢測的靈敏性；*現(xiàn)在有關(guān)農(nóng)作物RFLP研究中，普遍選用400-2000kb的DNA片段構(gòu)建隨機(jī)的基因組文庫。顯而易見，常規(guī)的克隆技術(shù)是無法承接如此大分子量的DNA片段的。(2)解決問題的