bFGF對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞中FAK表達(dá)的影響

1、bFGF對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞中FAK表達(dá)的影響 作者：王欣玲于韜張國剛閻啟昌張勁松 【摘要】 目的：觀察不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）引起體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞遷移和黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化。方法：體外培養(yǎng)的第3代人晶狀體上皮細(xì)胞，建立細(xì)胞劃痕損傷模型，經(jīng)0，5，10，15g/L bFGF作用8 16h后，電腦圖像法測定細(xì)胞遷移距離，RT-PCR法檢測0，1，4，8， 16h FAK mRNA水平，免疫熒光法檢測整合素1和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)陽性率的變化。結(jié)果

2、：與對(duì)照組比，5g/L組細(xì)胞遷移距離和FAK mRNA表達(dá)顯著增加（P 0.05）；10g/L組細(xì)胞整合素1表達(dá)陽性率顯著增加（P 0.05）；15g/L細(xì)胞遷移距離和FAK mRNA顯著降低（P 0.05）。結(jié)論：bFGF引起人晶狀體上皮細(xì)胞遷移距離和FAK mRNA表達(dá)的變化。 【關(guān)鍵詞】 堿性成纖維細(xì)胞生長因子上皮細(xì)胞晶狀體黏著斑激酶遷移Effect of bFGF on expression focal adhesion kinase in human lens epithelial cells Abstract AIM: To observe the effects of diffe

3、rent concentration basic fibroblast growth factor (bFGF) on human lens epithelial cells migration and the dynamic changes in focal adhesion kinase (FAK) mRNA level.METHODS: The scratch wound model of the third passage human lens epithelial cells was established and treated with bFGF of different con

4、centrations (0, 5, 10 and 15g/L) for 8-16 hour. The images of cell migration were quantitatively measured using a computer-assisted videomicroscopic system. The mRNA level of FAK was measured with reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay at 0, 1, 4, 8 and 16 hour. The positive

5、expression of integrin 1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were studied by immunofluorescent staining.RESULTS: The cell migration and FAK mRNA level were significantly stimulated when treated with bFGF at the concentrations of 5g/L compared with the control group (P 0.05). The integrin 1

6、 positive expression rate was significantly increased when treated with 10g/L bFGF (P 0.05). The cell migration and FAK mRNA level was significantly inhibited when treated with 15g/L bFGF (P 0.05). CONCLUSION: The cell migration distance and FAK mRNA expression varies when the cells are treated with

7、 different concentration of bFGF. FAK plays an important role in human lens epithelial cells migration. KEYWORDS: basic fibroblast growth factor; epithelial cell; lens; focal adhesion kinase; migration0引言 黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是細(xì)胞黏著依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(adhesion-dependent signal transduction )中的酪氨酸蛋白激酶，

8、屬于非受體蛋白酪氨酸激酶，在大多組織細(xì)胞中皆有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、生長、存活、凋亡、黏附、骨架重組等過程，是生長因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號(hào)分子1,2。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF) 是強(qiáng)效促細(xì)胞增殖因子，對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移也有作用 3,4。我們探討不同濃度bFGF引起體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷后遷移距離與FAK的動(dòng)態(tài)變化，以揭示其對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞遷移與增殖的影響。 1材料和方法 1.1材料 DMEM和胎牛血清購自美國Hyclone公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF和RT-PCR相關(guān)試劑購自美國Gibco 公司，

9、抗整合素1 pAb，抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mAb，四甲基異硫氰基若丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate， TRITC）標(biāo)記的山羊抗家兔IgG和異硫氰基熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。使用的儀器包括Olympus BX51型熒光顯微鏡、Olympus CK40型倒置顯微鏡及數(shù)碼攝影系統(tǒng)，Perkin Elmer PCR擴(kuò)增儀，島津UV-240紫外-可見分光光度計(jì)和Amersham pha

10、rmacia凝膠成像系統(tǒng)等。 1.2方法 人晶狀體組織來自中國醫(yī)科大學(xué)眼科中心。取人晶狀體前囊膜，組織塊法細(xì)胞培養(yǎng)。取第3次傳代細(xì)胞，建立細(xì)胞劃痕損傷模型1。在培養(yǎng)的細(xì)胞中每瓶加入含10ml/L胎牛血清的培養(yǎng)液抑制細(xì)胞分裂增殖，排除細(xì)胞增殖對(duì)細(xì)胞遷移的影響。細(xì)胞遷移圖像經(jīng)電腦圖像處理系統(tǒng)定量。細(xì)胞遷移速度用劃痕兩側(cè)遷移的距離表示。加入不同濃度的bFGF，使培養(yǎng)液中bFGF的終濃度依次為0，5，10和15g/L，在37 ，50ml/L CO2中培養(yǎng)8和16h，分別記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。RT-PCR引物：FAK（5-TGACAGGGAGGATGGAAGTC-3，5- TACTCTTGCTGGAGGCTGG

11、T-3），GAPDH（5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ，5- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ）。分別在1，4，8，16h抽提細(xì)胞總RNA后作逆轉(zhuǎn)錄。然后用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。94 5min，94 1min，68 1min，72 1min，30個(gè)循環(huán)；最后72延伸10min，4 結(jié)束反應(yīng)。10g/L 瓊脂糖電泳，電泳結(jié)束后凝膠置凝膠成像系統(tǒng)中掃描圖像入計(jì)算機(jī)中保存處理。第3代人晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)16h后，PBS漂洗3次，每次5min，40g/L多聚甲醛固定30min后，PBS再漂洗3次，每次5min，5mL/L TritonX-100漂洗3次，每次 5min，100g/L BSA于4下封閉過夜。分別加1100(體積比)稀釋一抗（整合素1 或 PCNA抗體），37恒溫孵育1h，5ml/L TritonX-100漂洗3次，每次5min，加入1100(體積比)稀釋二抗（山羊抗家兔IgG