熒光定量PCR的原理及使用1

1、熒光定量PCR的原理及使用熒光定量PCR(FQ-PCR)是新近出現(xiàn)的一種定量PCR檢測方法。其基本特點是：1、用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量。2、熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。3、動態(tài)實時連續(xù)熒光檢測，免除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程，高效、快速。下面介紹常用的幾種檢測方法：1、 雙鏈DNA內(nèi)插染料某些染料如SYBR Green 能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，同時產(chǎn)生強烈熒光。在PCR過程中SYBR Green 可與新合成的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生的熒光信號與雙鏈DNA

2、成正比。SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。SYBR Green I熒

3、光染料與DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對PCR引物設(shè)計的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。2、 TaqMan探針技術(shù)原理TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物

4、之間。探針的5端標記有報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其53外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。5，TaqMan探針的熒光信號產(chǎn)生機制根據(jù)其3端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和T

5、aqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高10C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqMan MGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。 TaqMan MGB探針探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件：1、探針

6、長度應(yīng)在2040個堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。2、G、C堿基含量在40-60，避免單核苷酸序列的重復(fù)。3、避免與引物發(fā)生雜交或重疊。4、探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。3、 分子信標技術(shù)分子信標技術(shù)（molecular beacon）也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和淬滅分子，與TaqMan探針不同的是該探針5和3末端自身可形成一個8個堿基左右的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產(chǎn)生熒光。當溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即FRET消失，于是溶液便產(chǎn)生熒光，熒光的強度與溶液中模

7、板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。 Ct 值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明 ,每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系 ,起始拷貝數(shù)越多 ,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線 ,因此只要獲得未知樣品的 Ct 值 ,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1、雙鏈DNA內(nèi)插染料 常用的是SYBR Green I熒光染料，其技術(shù)原理：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DN

8、A分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。熒光染料檢測法一般主要是利用熒光染料(如SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點是：無需另外設(shè)計熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀。熒光染料法實質(zhì)上是常規(guī)的PCR反應(yīng)中添加

9、了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結(jié)合所發(fā)出的熒光實時監(jiān)控反應(yīng)的進程。由于不需要設(shè)計序列特異性探針和優(yōu)化反應(yīng)條件，價格低廉，通用性強，而且熒光染料法可用于任何一種型號的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號顯著增強；當DNA變性時SYBR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，經(jīng)檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光染料可以在反應(yīng)末尾對擴增產(chǎn)物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值?；诋a(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應(yīng)中擴增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線數(shù)據(jù)就可以進行定量檢測了。將強毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀釋后，用紫外分光光度計測定其濃度，然后按下面的公式轉(zhuǎn)換成模板的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=NDV模板濃度阿氏常數(shù)(一個堿基的平均分子量NDV模板