生物化學第9章酶促反應動力學

1、第9章 酶促反應動力學一、一、化學動力學基礎化學動力學基礎二、底物濃度對酶反應速率的影響二、底物濃度對酶反應速率的影響三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用四、溫度對酶反應的影響四、溫度對酶反應的影響五、五、pH對酶反應的影響對酶反應的影響六、激活劑對酶反應的影響六、激活劑對酶反應的影響(kinetics of enzyme-catalyzed reaction) 研究酶促反應動力學的意義 酶促反應動力學是研究酶促反應的速率以及影酶促反應動力學是研究酶促反應的速率以及影響此速率的各種因素的科學。在研究酶的結構與功響此速率的各種因素的科學。在研究酶的結構與功能的關系以及酶的作用機制時，需要動力學提供實

2、能的關系以及酶的作用機制時，需要動力學提供實驗證據；為發(fā)揮酶催化反應的高效率，尋找最有利驗證據；為發(fā)揮酶催化反應的高效率，尋找最有利的反應條件；為了解酶在代謝中的作用和某些藥物的反應條件；為了解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機制等，都需要掌握酶促反應速率的規(guī)律。的作用機制等，都需要掌握酶促反應速率的規(guī)律。 二、底物濃度對酶反應速率的影響酶反應速率對底物濃度作圖中間復合物學說 為了解釋這個現象，為了解釋這個現象，Henri和和Wurtz提出了提出了酶底物復合物學說。該學說認為，當酶催化酶底物復合物學說。該學說認為，當酶催化反應時，酶首先與底物結合，生成酶底物復反應時，酶首先與底物結合，生成酶底

3、物復合物，然后生成產物，并釋放出酶。反應用下合物，然后生成產物，并釋放出酶。反應用下式表示：式表示： S + E ES P + E 酶底物中間復合物存在的證據電子顯微鏡和電子顯微鏡和X光衍射直接觀察到酶與底物的復光衍射直接觀察到酶與底物的復合物。合物。酶與底物結合后光譜發(fā)生變化。酶與底物結合后光譜發(fā)生變化。溶解度或熱穩(wěn)定性在加入底物后發(fā)生變化。溶解度或熱穩(wěn)定性在加入底物后發(fā)生變化。分離到了酶底物復合物。分離到了酶底物復合物。超離心沉降過程中，可觀察到酶和底物共沉降的超離心沉降過程中，可觀察到酶和底物共沉降的現象?，F象。平衡透析時，觀察到底物在半透膜兩側濃度不相平衡透析時，觀察到底物在半透膜兩側

4、濃度不相同同( (半透膜的一側有酶，另一側無酶，有酶一側底半透膜的一側有酶，另一側無酶，有酶一側底物濃度高于無酶一側物濃度高于無酶一側) )。 （1）平衡學說（Henri，Michaelis和和Menten方程）方程） 1902年年Henri和和Brown提出了酶催化的反應提出了酶催化的反應機理機理 1913年年Michaelis和和Menten完善了這個理論，完善了這個理論，他們認為酶反應的第一步是快速可逆的平衡，他們認為酶反應的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，為限速反應。第二步慢，為限速反應。平衡學說推導反應速度方程的假設前提 在推導動力學方程時，有幾點假設：在推導動力學方程時，有幾點假

5、設： 第一步迅速平衡，第二步慢，即第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以酶以E和和ES兩種狀態(tài)存在。兩種狀態(tài)存在。 根據平衡學說推導速度方程設設Vf 為為E與與S結合的速度，結合的速度，Vr 為為ES解離的速度，解離的速度，則則Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡時平衡時VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES又又 S ES SESS根據平衡學說推導速度方程 k1 ( E0ES ) S k 2 ES 解出解出 ES 得得 ) (012ESSESEkk120SkkSEES 令令 ， 則則 12kkKs0SKSEESS根據平衡學

6、說推導速度方程 由于由于V = k 3 ES，代入前式，代入前式得得 因為當所有的因為當所有的E都成為都成為ES時，可達最大反應時，可達最大反應速度，即速度，即Vm = k 3 E0 ，所以，所以 這就是米氏方程。這就是米氏方程。 03SKSEkVSSKSVVSm0SKSEESS米氏方程SKSVVsm 米氏方程是一個雙曲線方程，若以米氏方程是一個雙曲線方程，若以SS為自變?yōu)樽宰兞?，量，V V為因變量，可以作出雙曲線，與實驗測得的為因變量，可以作出雙曲線，與實驗測得的結果相符。結果相符。 （2）穩(wěn)態(tài)理論 1925年，年，Briggs和和Haldane提出了穩(wěn)態(tài)（提出了穩(wěn)態(tài)（steady stat

7、e）理論，對米氏方程做了一項很重要的修正：）理論，對米氏方程做了一項很重要的修正： 在在 反應式中，反應式中，k3值值不小，后一步驟不是限速步驟。不小，后一步驟不是限速步驟。 所謂穩(wěn)態(tài)是指反應進行一段時間后，系統(tǒng)中的所謂穩(wěn)態(tài)是指反應進行一段時間后，系統(tǒng)中的酶底物復合物濃度由零逐漸增加到一定數值，然酶底物復合物濃度由零逐漸增加到一定數值，然后保持不變，即處于穩(wěn)態(tài)水平，后保持不變，即處于穩(wěn)態(tài)水平，此時此時ES的解離和分的解離和分解速率之和等于解速率之和等于ES的形成速率的形成速率，根據穩(wěn)態(tài)學說推導速度方程產生產生ES的速率的速率消耗消耗ES的速率的速率 穩(wěn)態(tài)時穩(wěn)態(tài)時所以所以32ESkESkdtES

8、d0dtESd)(01SESEkdtESd)(3201ESkESkSESEk根據穩(wěn)態(tài)學說推導速度方程 移項得移項得1320)(kkkESSESE)(3201ESkESkSESEk令令 ，代入上式得，代入上式得 132kkkKmmKESSESE)(0將上式中的將上式中的ES解出得解出得 0SKSEESm此此ES即為穩(wěn)態(tài)時的復合物濃度。即為穩(wěn)態(tài)時的復合物濃度。 根據穩(wěn)態(tài)學說推導速度方程因為酶反應速率與因為酶反應速率與ES成正比，即成正比，即 所以所以 3ESkV 03SKSEkVm0SKSEESm又因為當所有的酶都與底物結合形成復合物時，又因為當所有的酶都與底物結合形成復合物時，反應速率達到最大，

9、即反應速率達到最大，即 ，代入上式得，代入上式得 03EkVmSKSVVmmSKSVVsm（穩(wěn)態(tài)法）（穩(wěn)態(tài)法）（快速平衡法）（快速平衡法）兩個米氏方程的區(qū)別 這兩個方程的區(qū)別就在于快速平衡法推導這兩個方程的區(qū)別就在于快速平衡法推導的方程中米氏常數是的方程中米氏常數是Ks，而穩(wěn)態(tài)法推導的米氏，而穩(wěn)態(tài)法推導的米氏方程中米氏常數是方程中米氏常數是Km。 12kkKs 132kkkKmKs是是 ES 的解離平衡常數的解離平衡常數米氏方程的幾個特點從米氏方程中可以看出：從米氏方程中可以看出：當當S Km時，時， ，反應速率達到，反應速率達到最大，并與底物濃度無關，屬零級反應；最大，并與底物濃度無關，屬零

10、級反應；當當S = Km時，時， ，所以，所以，Km的意的意義是使反應速率達到最大反應速率一半時的底義是使反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度。物濃度。mmKSVVmmVSSVV2 2mmVSSVV米氏方程曲線米氏常數的意義 Km是酶的特征性常數，其單位是濃度單位。在一是酶的特征性常數，其單位是濃度單位。在一定的反應條件下，對于一定的底物，定的反應條件下，對于一定的底物，Km是定值。是定值。 Km可以判斷酶的天然底物。有些酶可以作用于幾可以判斷酶的天然底物。有些酶可以作用于幾個底物，其中個底物，其中Km最小的底物是天然底物。最小的底物是天然底物。 當當k3 Km時，時，V = Vm = k

11、3E0，此時對底物來，此時對底物來說是零級反應，對酶來說是一級反應，說是零級反應，對酶來說是一級反應，k3是一級是一級反應速率常數，反應速率常數，k3表示當酶被底物飽和時每秒鐘表示當酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數（又稱為轉換數），每個酶分子轉換底物的分子數（又稱為轉換數），這時的這時的k3又可以寫成又可以寫成 kcat，kcat 越大，說明酶越大，說明酶的的催化效率越高。催化效率越高。 kcat /Km的意義 Kcat /Km表示酶的催化效率，表示酶的催化效率，Kcat /Km越大，越大，催化效率越高。催化效率越高。 ，其最大值極限是，其最大值極限是k k1，而，而k k1是酶

12、與底物結合的速率常數，此常數受是酶與底物結合的速率常數，此常數受到底物在溶液中擴散速度的影響。到底物在溶液中擴散速度的影響。 32313kkkkKkm作圖法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk雙倒數作圖法）雙倒數作圖法） 將米氏方程兩邊取倒數得將米氏方程兩邊取倒數得 在一系列在一系列S下測出相應的反應速率下測出相應的反應速率v，以，以 對對 作圖，可得出作圖，可得出Km和和Vm值。值。 mmmVSVKV1111SV1米氏方程的雙倒數圖多底物的酶促反應動力學 （酶促反應按底物分子數的分類酶促反應按底物分子數的分類）底物數酶分類催化反應酶種類占總酶百分數單底物單底物單向單底物單向單底物

13、假單底物假單底物異構酶異構酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%雙底物雙底物氧化還氧化還原酶原酶轉移酶轉移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + BX AX + B27%24%三底物三底物連接酶連接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B + ATP AB + AMP + PPi6%多底物反應按動力學機制分類（序列反應序列反應） 底物的結合和產物的釋放有一定的順序：底物的結合和產物的釋放有一定的順序：E+A+BEABEPQE+P+Q 產物不能在兩種底物都結合之前釋放。這產物不能

14、在兩種底物都結合之前釋放。這類反應又可以分為兩種類型。類反應又可以分為兩種類型。有序反應（ordered reaction） 其中其中P是是B轉變的產物，轉變的產物，Q是是A轉變的產物。轉變的產物。如脫氫酶的輔酶如脫氫酶的輔酶NAD(P)+相當于相當于A，NAD(P)H相相當于當于Q。 隨機反應（random reaction） 如肌酸激酶催化肌酸與如肌酸激酶催化肌酸與ATP反應生成反應生成磷酸肌酸和磷酸肌酸和ADP。乒乓反應乒乓反應（ping pong reaction） 如轉氨酶催化轉氨反應：如轉氨酶催化轉氨反應：氨基酸氨基酸1 酮酸酮酸2 酮酸酮酸1 氨基酸氨基酸2 A B P Q三、酶

15、的抑制作用 因酶蛋白變性而酶活力喪失稱為酶的失活作用，因酶蛋白變性而酶活力喪失稱為酶的失活作用，而因為某種物質與酶結合使酶活力喪失稱為酶的抑而因為某種物質與酶結合使酶活力喪失稱為酶的抑制作用，酶受抑制喪失活力時酶蛋白并沒有變性。制作用，酶受抑制喪失活力時酶蛋白并沒有變性。能抑制酶活力的物質稱為酶的抑制劑（能抑制酶活力的物質稱為酶的抑制劑（inhibitor）。）。 研究酶的抑制作用是研究酶的結構和功能、酶研究酶的抑制作用是研究酶的結構和功能、酶的催化機制，以及闡明代謝途徑的基本手段，也可的催化機制，以及闡明代謝途徑的基本手段，也可以為醫(yī)藥設計新藥物和為新農藥的研制提供理論依以為醫(yī)藥設計新藥物和

16、為新農藥的研制提供理論依據。據。抑制程度的表示方法 %100)1 (%100)1 (%0VVaii（1 1）相對活力分數（殘余活力分數）相對活力分數（殘余活力分數）（2 2）相對活力百分數（殘余活力百分數）相對活力百分數（殘余活力百分數）（3 3）抑制分數（被抑制而失去活力的分數）抑制分數（被抑制而失去活力的分數）（4 4）抑制百分數）抑制百分數0VVai%100%0VVai011VVaii抑制作用的類型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制劑與酶活性中心的基團以共價鍵結合，抑制劑與酶活性中心的基團以共價鍵結合，不能用透析、超濾、凝膠過濾等物理

17、方法去除。不能用透析、超濾、凝膠過濾等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制劑與酶活性中心的基團以非共價鍵結抑制劑與酶活性中心的基團以非共價鍵結合，可以用透析、超濾、凝膠過濾等物理方法合，可以用透析、超濾、凝膠過濾等物理方法去除而使酶恢復活力。去除而使酶恢復活力?？赡嬉种谱饔玫?種類型 （1 1）競爭性抑制（）競爭性抑制（competitive inhibition） I 和和 S 競爭與酶的活性中心結合，二者只能競爭與酶的活性中心結合，二者只能結合一個。競爭性抑制劑通常是底物類似物，結合一個。競爭性抑制劑通常是底物類似物，它可以與酶結合

18、，但不能被酶催化發(fā)生反應。它可以與酶結合，但不能被酶催化發(fā)生反應。競爭性抑制劑舉例可逆抑制作用的3種類型（2 2）非競爭性抑制（）非競爭性抑制（noncompetitive inhibition） I 與與 S 可以分別與酶結合，誰先結合都可以，可以分別與酶結合，誰先結合都可以，形成形成 ESI 三元復合物，但三元復合物，但 ESI 中的中的 S 不能轉變成不能轉變成產物。這類產物。這類抑制劑是與酶活性中心之外的某個部抑制劑是與酶活性中心之外的某個部位結合。位結合。競爭性和非競爭性抑制劑的抑制機理可逆抑制作用的3種類型（3）反競爭性抑制劑（）反競爭性抑制劑（uncompetitive inhi

19、bition） I 只與只與 ES 結合，只有結合，只有 ES 能分解出產物，能分解出產物，ESI 中中的的 S 不能轉變成產物。由于不能轉變成產物。由于 I 的存在促進了的存在促進了 E 和和S 的的結合，所以稱為反競爭性抑制。結合，所以稱為反競爭性抑制。 ES + I ESI P + E + I可逆抑制作用和不可逆抑制作用的動力學鑒別 在反應系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，以及在反應系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，以及不同量的酶，測定反應速率與酶量的關系。斜不同量的酶，測定反應速率與酶量的關系。斜率較小的直線是可逆抑制劑，不通過原點但斜率較小的直線是可逆抑制劑，不通過原點但斜率與對照相同的是不可逆抑制

20、劑。率與對照相同的是不可逆抑制劑。1. control2. irreversible inhibitor3. reversible inhibitor可逆抑制作用和不可逆抑制作用的動力學鑒別 在反應系統(tǒng)中加入不同量的酶及抑制劑，作不在反應系統(tǒng)中加入不同量的酶及抑制劑，作不同抑制劑濃度下反應速率對酶量的直線?？赡嬉种仆种苿舛认路磻俾蕦γ噶康闹本€?？赡嬉种苿┑玫降氖且唤M通過原點但斜率不同的直線，不可劑得到的是一組通過原點但斜率不同的直線，不可逆抑制劑得到的是一組不通過原點但斜率與對照相逆抑制劑得到的是一組不通過原點但斜率與對照相同的平行線。同的平行線。一些重要的不可逆抑制劑 （1 1）非專一

21、性不可逆抑制劑）非專一性不可逆抑制劑 有機磷化合物有機磷化合物 有機汞、有機砷化合物有機汞、有機砷化合物 重金屬鹽重金屬鹽 烷化試劑烷化試劑 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和CO 青霉素青霉素（2 2）專一性不可逆抑制劑）專一性不可逆抑制劑 Ks型不可逆抑制劑型不可逆抑制劑 Kcat型不可逆抑制劑型不可逆抑制劑 有機磷化合物 很多農藥是有機磷化合物，它們能抑制某些蛋白很多農藥是有機磷化合物，它們能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，與酶分子活性部位的絲氨酸羥基共酶及酯酶的活力，與酶分子活性部位的絲氨酸羥基共價結合而使酶失活。這類化合物強烈地抑制膽堿酯酶價結合而使酶失活。這類化合物強烈地抑制膽堿酯酶活力

22、，使乙酰膽堿不能水解成乙酸和膽堿，導致乙?；盍Γ挂阴Ｄ憠A不能水解成乙酸和膽堿，導致乙酰膽堿積累，引起神經中毒癥狀。所以這類化合物又稱膽堿積累，引起神經中毒癥狀。所以這類化合物又稱為神經毒劑。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷為神經毒劑。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒劑奪取下來，定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒劑奪取下來，使酶恢復活力，達到解毒的作用。使酶恢復活力，達到解毒的作用。 有機磷化合物解磷定的解毒機理有機汞化合物 有機汞化合物能與酶的巰基結合而使酶失活。有機汞化合物能與酶的巰基結合而使酶失活。過量的半胱氨酸或還原型谷胱甘肽過量的半胱氨酸或還原型

23、谷胱甘肽能解毒。能解毒。 有機砷化合物 有機砷化合物能與酶的巰基結合而使酶失活。有機砷化合物能與酶的巰基結合而使酶失活。BAL（二巰基丙醇）能解毒。（二巰基丙醇）能解毒。 路易斯毒氣路易斯毒氣為了六十一個階級兄弟重金屬鹽 Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高濃度時能使在高濃度時能使酶蛋白變性，低濃度時抑制某些酶的活力?？捎媒鹈傅鞍鬃冃裕蜐舛葧r抑制某些酶的活力。可用金屬螯合劑屬螯合劑EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金屬離子。、半胱氨酸等螯合除去重金屬離子。 烷化試劑含有一個活潑的鹵素離子，能夠修飾烷化試劑含有一個活潑的鹵素離子，能夠修飾酶分子中的許多基團，如巰基、氨基、羧基、咪唑酶

24、分子中的許多基團，如巰基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等?；傲蛎鸦?。烷化試劑氰化物、硫化物和CO 氰化物能與細胞色素氧化酶中的氰化物能與細胞色素氧化酶中的Fe2+結合，使結合，使酶失活不能呼吸。酶失活不能呼吸。CO與血紅蛋白結合阻止氧運輸。與血紅蛋白結合阻止氧運輸。硫化物能與多種含金屬的酶形成硫化物能與多種含金屬的酶形成較為穩(wěn)定的絡合物，較為穩(wěn)定的絡合物，使酶失活。使酶失活。 糖肽轉肽酶在細菌細胞壁合成中使肽聚糖鏈交糖肽轉肽酶在細菌細胞壁合成中使肽聚糖鏈交聯。青霉素與糖肽轉肽酶的絲氨酸羥基結合，使細聯。青霉素與糖肽轉肽酶的絲氨酸羥基結合，使細菌細胞壁不能合成。菌細胞壁不能合成。 青霉素 青霉

25、素的抗菌機理Ks型不可逆抑制劑 此類抑制劑結構與底物類似，并帶有高反應性基此類抑制劑結構與底物類似，并帶有高反應性基團，與酶活性部位結合后，修飾活性部位的基團使酶團，與酶活性部位結合后，修飾活性部位的基團使酶失活。主要修飾活性部位，其它部位也可能修飾。失活。主要修飾活性部位，其它部位也可能修飾。 胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的胰蛋白酶的Ks型抑制劑型抑制劑Kcat型不可逆抑制劑 此類抑制劑不但結構與底物類似，而且需要經酶此類抑制劑不但結構與底物類似，而且需要經酶催化反應后才產生高反應性基團，比催化反應后才產生高反應性基團，比Ks型不可逆抑制型不可逆抑制劑專一性更強。劑專一性更強

26、。 -鹵代鹵代-D-D-丙氨酸丙氨酸 磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶丙氨酸消旋酶可逆抑制劑（底物的類似物底物的類似物）合成葉酸的組分合成葉酸的組分磺胺藥物競爭抑制二氫磺胺藥物競爭抑制二氫葉酸合成酶的活性葉酸合成酶的活性 蝶呤蝶呤 對氨基苯甲酸對氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸 葉酸葉酸（磺胺藥物）（磺胺藥物）可逆抑制劑 （過渡態(tài)底物類似物過渡態(tài)底物類似物） 過渡態(tài)底物類似物抑制力更強，因為酶過渡態(tài)底物類似物抑制力更強，因為酶對過渡態(tài)底物的親和力比對底物的親和力強對過渡態(tài)底物的親和力比對底物的親和力強得多。得多。多種酶催化反應多種酶催化反應時的過渡態(tài)底物時的過渡態(tài)底物過渡態(tài)底物類似物過渡態(tài)底物類似物可

27、逆抑制劑 （過渡態(tài)底物類似物過渡態(tài)底物類似物）可逆抑制劑 （過渡態(tài)底物類似物過渡態(tài)底物類似物）四、溫度對酶反應的影響 在較低溫度范圍內，酶反應速率隨著溫度的在較低溫度范圍內，酶反應速率隨著溫度的升高而增加，當溫度高到一定程度時，酶開始變升高而增加，當溫度高到一定程度時，酶開始變性失活，反應速率反而下降。所以對于酶反應來性失活，反應速率反而下降。所以對于酶反應來說，有一個最適反應溫度。一般來說，動物細胞說，有一個最適反應溫度。一般來說，動物細胞內酶的最適反應溫度在內酶的最適反應溫度在3540，植物細胞中的，植物細胞中的酶可達酶可達4050，也有一些生長在堆肥、溫泉中，也有一些生長在堆肥、溫泉中的微生物酶的最適溫度更高，如的微生物酶的最適溫度更高，如Taq DNA聚合酶聚合酶的最適溫度可高達的最適溫度可高達70。 需要注意的是，最適溫度需要注意的是，最適溫度值不是酶的特征性值不是酶的特征性常數，此值隨著反應時間的延長而有所下降。常數，此值隨著反應時間的延長而有所下降。溫度對酶反應速率的影響五、pH對酶反應的影響 酶的活力受環(huán)境酶的活力受環(huán)境pH的影響，存在一個最適的影響，存在一個最適反應反應pH。酶的最適