WB原理步驟及總結(jié)(雜項(xiàng))

1、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上， 然后利用抗原抗體反應(yīng)來檢測(cè)特異性的蛋白分 子的技術(shù)，包括三個(gè)部分：聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量， 是陰離子去污劑， 能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和 分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)。與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為，由于帶有大量的負(fù)電荷， 與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的負(fù)電荷，形似 長(zhǎng)橢圓棒，蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此，利用相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白所 作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得未知蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。電泳后蛋

2、白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中， 探針分子很難通過凝膠孔， 將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可 以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測(cè)分析。方法有兩種：水平半干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩 沖液浸濕的濾紙中間，通電可完成垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移裝置的 緩沖液中，通電或過夜可完成。固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龍膜。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后， 通過蛋白質(zhì)染料如麗春紅檢測(cè)膜上的總蛋白， 或用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)凝 膠上的蛋白剩余量，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)移是否成功。用抗體作為探針進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)檢測(cè)抗原蛋白，分為 步：用非特異性、非反應(yīng)活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)，

3、以防止作為探針的抗體 結(jié)合到膜上，出現(xiàn)檢測(cè)時(shí)的高背景固定化膜用專一性的一抗溫育，使一抗與膜上的抗原蛋白分子特異 性結(jié)合酶標(biāo)二抗與一抗特異結(jié)合加入酶底物，適當(dāng)保溫，膜上便可見到顏色反應(yīng)，檢測(cè)出抗原蛋白 區(qū)帶。主要溶液分離膠水 、 丙烯酰胺混合液 、（）、 、過硫酸銨、濃縮膠水、丙烯酰胺混合液、 、過硫酸銨、X -甘氨酸電泳緩沖液堿、甘氨酸、 ，用去離子水定容至X凝膠加樣緩沖液（），B巰基乙醇，甘油，溴酚藍(lán)，轉(zhuǎn)移緩沖液，甘氨酸，甲醇，加去離子水至， ，加去離子水至（）,，唧巰基乙醇，用水定容到 實(shí)驗(yàn)步驟聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置 分離膠的配置：將配置好的分離膠液混勻后迅速倒入膠槽中，至距離短玻璃板

4、頂端約處，停止灌膠。 檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在膠液界面上加蒸餾水進(jìn)行水封。后，凝膠和水封層界面清 晰，說明膠已經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。 （使蛋白樣品分離） 濃縮膠的配置：將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上，直至短玻璃板的頂端，然后插入樣品槽梳子。 室溫下濃縮膠聚合，約。 （使蛋白樣品濃縮）蛋白樣品的處理 將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中，輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加 熱時(shí)液體迸出），在C沸水浴中加熱，取出冷卻后備用，使用前需要將樣品離心除去顆粒物質(zhì)。暫時(shí)用不 到的話，可放在-C冰箱長(zhǎng)期保存，使用時(shí)沸水浴中加熱，以除去亞穩(wěn)聚

5、合態(tài)物質(zhì)。上樣前的樣品一定 要均勻以防電泳時(shí)出現(xiàn)縱向條帶。加樣 拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒過短板約以上，若樣品槽中有氣泡，用槍頭挑除。按順序向凝 膠樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白和未知蛋白樣品， 每孔的加樣量要相同，一般加樣體積為 卩，加樣時(shí)槍頭深入到 加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，記錄加樣順序。電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開直流穩(wěn)壓電源， 先過了濃縮膠后改為，待溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠下 沿時(shí)停止電泳。蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移水平半干式電轉(zhuǎn)移 戴乳膠手套剪濾紙張，濾紙長(zhǎng)與寬比一膠各大。 裁剪與膠長(zhǎng)寬相等的膜。 將張濾紙和膠浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中待用。 將另張濾紙和轉(zhuǎn)移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。 將浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中的濾

6、紙取出，盡量少帶液體，置于轉(zhuǎn)移槽負(fù)極上，然后在負(fù)極濾紙上依次鋪放膠、膜、張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾紙。注意排除氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)產(chǎn)生高阻抗點(diǎn)， 形成低效印跡區(qū)，即所謂“禿斑” 。 蓋上石墨陽極板，設(shè)定恒流，轉(zhuǎn)移一定時(shí)間。垂直濕式轉(zhuǎn)移 凝膠片的平衡：把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的大培養(yǎng)皿中，浸泡，以除去膠中的，使其及離子強(qiáng)度和印跡緩沖液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮。 將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至C 準(zhǔn)備膜和濾紙： 戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的膜和張濾紙， 用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤(rùn)膜和濾紙， 直到 沒有氣泡， 將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕 打開蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾，依次放入：浸濕的海綿，兩張用轉(zhuǎn)移

7、緩沖液飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩 沖液浸過的膠，膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。 轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負(fù)極膜靠近正極將轉(zhuǎn)移槽放到C冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流，。免疫印跡分析膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的膜取出，置于培養(yǎng)皿中。麗春紅染色后，用鉛筆輕輕 標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶的位置以備計(jì)算特異性蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅脫色液輕輕漂洗數(shù)次 至紅色消失。特異性抗體檢測(cè) 脫色后的膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖，室溫下封閉以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合） 倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖

8、，洗膜次，每次。（除去封閉液） 漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，C搖床過夜或室溫放搖（一抗與目的抗原蛋 白特異性結(jié)合） 利用水平搖床，用洗膜次，每次。（洗去未結(jié)合的一抗） 將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標(biāo)二抗中，在室溫下孵育 傾去二抗，用洗膜，室溫?fù)u洗三次，每次，蛋白面朝上，置于保鮮膜中，將的液和液以體積混合， 于暗室中，按cm的量滴加于膜表面，孵育，濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內(nèi)曝光數(shù)秒。在暗室中，將 X顯影液和定影液分別到入塑料盤中。在紅燈下取出一光片，剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大 ）。打開 光片夾，把 光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上光片夾，開始計(jì) 時(shí)。根據(jù)信號(hào)

9、的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 或 ，曝光完成后，打開光片夾，取出 光片，迅速浸 入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為 （C），溫度過低時(shí)（低于C）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間。顯影結(jié)束后，馬上把光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 ，以膠片透明為止。用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項(xiàng) 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。 不同濃度的凝膠用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵、二硫鍵。對(duì)于 多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，一只能測(cè)定它們的亞基或單條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量。 盡量除去核酸、多糖、

10、脂類等干擾分子。 蛋白質(zhì)樣品在處理過程中應(yīng)低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶對(duì)其進(jìn)行修飾 盡量使用新鮮的，樣品要與 混合均勻， 不可將蛋白質(zhì)反復(fù)凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性， 一定要漫過梳子孔，否則可能會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動(dòng)。 電泳時(shí)先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，特別是對(duì)于高分子量的目的蛋白， 硝酸纖維素（）膜：與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小。非特異性本底顯色淺。價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失。韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯（）膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容 易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。但

11、價(jià)格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，然后浸入的甲醇，待 完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用于膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用X麗春紅染液染（于脫色搖 床上搖），然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。高背 景可能的原因：膜未均勻浸泡。膜或緩沖液污染。封閉不充分?？贵w與封閉液出現(xiàn)交叉反應(yīng)。抗體濃度 過高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用甲醇將膜完全浸泡。雜交前檢測(cè)一抗、二抗。檢測(cè)一抗、二抗與封閉液是 否有交叉反應(yīng)。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的

12、條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。 轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染 色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。作用定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，分析目的蛋白表達(dá)的特異性。 蛋白樣品的制備（） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培 養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。、 每瓶細(xì)胞加 C預(yù)冷的（）。平放輕輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩 次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。、按裂解液加 卩（），搖勻置于冰上。

13、（要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）、每瓶細(xì)胞加 卩含的裂解液，于冰上裂解，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和 裂解液移至離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）、于C下離心。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于-C保存。（） 組織中總蛋白的提?。?、 將少量組織塊置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。、加 卩單去污劑裂解液裂（含）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。、幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。、裂解 后，即可用移液器將裂解液移至離心管中，然后在

14、C下離心，取上清分裝于離心管 中并置于一C保存。（） 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來，除了按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng) 液中細(xì)胞總蛋白的提?。?、將培養(yǎng)液倒至離心管中，于離心。、棄上清，加入 并用槍輕輕吹打洗滌，然后離心。棄上清后用重復(fù)洗滌一次。、用槍洗干上清后，加卩裂解液（含）冰上裂解，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起C、離心，取上清分裝于離心管中并置于-C保存。（三）蛋白含量的測(cè)定（）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、 從一C取出，室溫融化后，備用。、取個(gè)離心管，個(gè)一組，分別標(biāo)記為，。、按下表在各管中加入各種試劑?？捡R

15、斯亮藍(lán)溶液、 混勻后，室溫放置。在生物分光光度計(jì)上比色分析。（） 檢測(cè)樣品蛋白含量、取若干離心管，每管加入C儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液。室溫放置后即可用于測(cè)蛋白。、取一管考馬斯亮藍(lán)加 溶液，混勻放置分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好 標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按測(cè)空白樣品。、棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯次（每次），再用無菌水洗一次。、取一管考馬斯亮藍(lán)加溶液和待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置，倒入扣干的比色杯中按鍵測(cè)樣品。注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再 一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是樣品含的蛋白量。主要參考生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程劉

16、箭主編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)魏群主編還有百度上搜的關(guān)于的方法步驟及試驗(yàn)中出現(xiàn)的問題熱致相分離法的英文縮寫，是的簡(jiǎn)稱原理是在聚合物的熔點(diǎn)以上，將聚合物溶于高沸點(diǎn), 低揮發(fā)性的溶劑（又稱稀釋劑）中，形成均相溶液。然后降溫冷卻。在冷卻過程中，體系會(huì)發(fā)生相 分離。這個(gè)過程分兩類，一類是固-液相分離（簡(jiǎn)稱相分離），一類是液-液相分離（相分離）。 控制適當(dāng)?shù)墓に嚄l件，在分相之后，體系形成以聚合物為連續(xù)相，溶劑為分散相的兩相結(jié)構(gòu)。這時(shí) 再選擇適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性試劑（即萃取劑）把溶劑萃取出來，從而獲得一定結(jié)構(gòu)形狀的聚合物微孔膜。 與法相比，有許多優(yōu)點(diǎn)：它通過較為迅速的熱交換促使高分子溶液分相，而不是緩慢的溶劑一非溶 劑交換。法避免了法（非溶劑致相分離法）由于存在溶劑一非溶劑交換，導(dǎo)致成膜液中部分溶劑參 與了聚合物的凝膠化，所以孔隙率低