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1、【文章編號】1007-9424(201002-0165-05論著應(yīng)用分支DNA技術(shù)及SqR T2PCR方法檢測結(jié)直腸癌患者腹腔沖洗液中游離癌細胞王浩斌1,王崇樹1,張才全2,謝賢雍3【摘要】目的探討分支DNA(b2DNA及半定量R T2PCR(SqR T2PCR在結(jié)直腸癌術(shù)中腹腔沖洗液中游離癌細胞檢測中的應(yīng)用。方法分別采用基于b2DNA信號放大的基因表達定量檢測技術(shù)及SqR T2PCR方法檢測48例結(jié)直腸癌患者術(shù)中腹腔沖洗液中CEA mRNA的表達,同時行腹腔沖洗液細胞學(xué)檢查(peritoneal lavage cytolo2 gy,PL C,收集12例結(jié)直腸良性病變患者的腹腔沖洗液為陰性對照
2、,GA PD H mRNA為內(nèi)參對照。結(jié)果b2DNA技術(shù)和SqRT2PCR方法檢測游離癌細胞的陽性率(43.8%,31.3%較PL C的檢出率(4.2%高(P<0.01。結(jié)直腸癌患者腹腔沖洗液中CEA mRNA的相對表達量均與腫瘤分化程度、漿膜侵犯程度和Dukes分期有關(guān)(P<0.05,而與腫瘤大小、患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05。結(jié)論b2DNA技術(shù)和SqR T2PCR方法檢測游離癌細胞各有優(yōu)缺點;腹腔內(nèi)游離癌細胞的存在與結(jié)直腸癌臨床病理因素有關(guān)。【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤;腫瘤微轉(zhuǎn)移;分支DNA;半定量反轉(zhuǎn)錄2聚合酶鏈反應(yīng);癌胚抗原【中圖分類號】R735.34;R73237【文
3、獻標(biāo)識碼】ADetecting Free C ancer C ells in Peritoneal C avity of Colorectal C ancer P atients by B ranched2Chain DNA and SqRT2PCR W A N G H ao2bin1,W A N G C hong2shu1,Z HA N G C ai2quan2,X I E X ian2yong3. 1.T he Fi rst Department of General S urgery,T he A f f iliated Hos pital of N orth S ichuan Medi
4、cal College,N anchong637000,S ichuan Province, China; 2.T he T hi rd Department of General S urgery,T he Fi rst A f f iliated Hos pital,Chongqing Universit y ofMedical Sciences,Chongqing400016,China; 3.De partment of Pat hology,T he A f f iliated Hos pital of N orth S ichuan Medical College,N anchon
5、g637000,S ichuan Province,China【K ey w ords】Colorectal cancer;Tumor micrometastasis;Branched2chain DNA;semi2quantitative real time2 polymerase chain reaction;Carcinoembryonic antigen【Found ation item】Application Basic Research Program of Sichuan Science and Technology Agency(No.04J Y029201523【基金項目】四
6、川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(項目編號:04J Y029201523【作者單位】1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外一科(四川南充637000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科(重慶400016;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科(四川南充637000【作者簡介】王浩斌(1983年-,男,山西省太原市人,碩士研究生,住院醫(yī)師,主要從事胃腸道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究,E2mail:haohao2008. student。結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,臨床上約有50%患者根治術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中腹腔內(nèi)種植占20%1,而腹腔內(nèi)的游離癌細胞(free cancer cells,FCC則是發(fā)生腹腔種植轉(zhuǎn)移的先決條
7、件。因此,早期清除脫落于腹腔的FCC是防止腹腔內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。尋找特異、敏感的檢測FCC 的方法具有重要臨床意義,本研究選用癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA為腫瘤標(biāo)志物,采用基于分支DNA(b2DNA信號放大的基因表達定量檢測技術(shù)和半定量R T2PCR(SqR T2PCR方法間接檢測結(jié)直腸癌患者腹腔沖洗液中的FCC,并比較2種方法的優(yōu)缺點。1資料和方法1.1臨床資料收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年12月至2009年4月期間48例結(jié)直腸癌手術(shù)患者的腹水或腹腔沖洗液,其中男30例,女18例,年齡32 78歲,平均55歲。病理類型:管狀腺癌36例,乳頭狀腺癌2例
8、,印戒細胞癌2例,黏液腺癌8例。管狀腺癌癌細胞分化程度:高分化20例,中分化10例,低分化6例。Dukes分期:A期7例,B期14例, C期20例,D期7例。淋巴轉(zhuǎn)移27例,遠處轉(zhuǎn)移7例,肉眼腹膜播散3例。所有患者病灶均位于腹膜返折以上。收集同期12例經(jīng)手術(shù)治療結(jié)直腸良性腫瘤患者腹腔沖洗液作為陰性對照,其中結(jié)直腸息肉4例,管狀腺瘤3例,絨毛狀腺瘤5例。上述患者的診斷均經(jīng)病理學(xué)證實。人結(jié)腸癌細胞株SW480(引自美國,由重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室常規(guī)培養(yǎng)為陽性對照,管家基因GA PD H為內(nèi)參對照2,3。1.2腹水及腹腔沖洗液的收集和保存手術(shù)均用電刀開腹,剖腹后注意保護皮膚,用腹壁切口保護器防止皮
9、膚切口的上皮細胞及滲血進入腹腔,進腹后用大塊紗布遮蓋小腸,有腹水者即從盆腔抽取腹水。若無腹水,則向腹腔內(nèi)注入溫生理鹽水200ml沖洗腫瘤所在局部腹腔,并輕微攪動, 24min后抽出,腹水及腹腔沖洗液均需離心、PBS 液洗滌。將離心標(biāo)本分為3份:第1份做細胞涂片,H E染色后行細胞學(xué)檢查;第2份加入去RNA 酶緩沖液,-80存放,待作b2DNA基因定量檢測;第3份立刻用Trizol法提取RNA,經(jīng)凝膠電泳檢測RNA的完整性后放入-80冰箱保存以備R T2PCR檢測。1.3細胞學(xué)檢查(PLC將送檢的沖洗液或腹水進行離心(2800×g 5min后,取離心沉淀物涂片,H E染色,鏡檢,由2位
10、經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專家閱片,發(fā)現(xiàn)癌細胞即為陽性。1.4b2D NA技術(shù)檢測CEA mRNA表達使用Quanti Gene2.0樣本處理試劑盒(美國Panomics公司中的特定裂解液將樣本裂解后使總RNA釋放出來,步驟按照試劑盒說明進行。將總RNA分別加入96孔板的每個孔中,每孔加10l,捕獲板的每個孔中加入50l稀釋的CEA和GA PD H mRNA探針試劑(美國Panomics公司設(shè)計并合成,將96孔板放入恒溫箱中使RNA和探針進行過夜雜交(1620h從而捕獲mRNA,溫度須控制在(55±1。捕獲的mRNA與b2DNA進行雜交可使信號放大400倍,然后加入化學(xué)發(fā)光底物,在多功能酶標(biāo)儀
11、(美國Bio2Tek公司下檢測發(fā)光信號。根據(jù)Quanti Gene2.0試劑說明,首先計算出最低檢出量(limit of detection,LOD,LOD=背景控制孔的化學(xué)發(fā)光信號平均值(AV G RL U back2 ground-3×背景控制孔化學(xué)發(fā)光信號的標(biāo)準(zhǔn)差(3×SD background。通過多功能酶標(biāo)儀檢測目的基因測試孔的信號檢出值,若高于LOD則為表達陽性,低于LOD則為表達陰性。以GA PD H mRNA的標(biāo)準(zhǔn)化平均相對光單位值(AV G RL U作為校正基數(shù),即目的基因mRNA的相對表達量= (AV G RL U目的基因mRNA-AV G RL U b
12、ack2 ground/(AV G RL U看家基因-AV G RL U back2 ground。1.5SqRT2PCR檢測CEA mRNA表達將提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明(美國Promega公司進行,反應(yīng)條件: 3010min,5530min,995min,15個循環(huán)。提取細胞cDNA進行PCR擴增:引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成,CEA 上游引物:52TCT GGAACT TCTCC T GGTC TC2 TCA GCT GG23,下游引物:52T GTA GC T GT T G2 CAAA T GCT T TAA GGAA GAA GC23,擴增產(chǎn)
13、物長度為131bp。內(nèi)參照GA PD H上游引物:52 CCCA TCACCA TC T TCCA GG23,下游引物52 CA TCACGCCACA GT T TCCC23,擴增產(chǎn)物長度為379bp。擴增條件:9410min,9430s,5630s,7230s,40個循環(huán);72延伸2min,冷卻至4。取5l擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳45min,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio2Rad公司分析DNA條帶的密度,通過比較樣品間目的基因與內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物密度比值來評價不同樣品的基因表達差異,CEA mRNA相對表達量=CEA mRNA 吸光度值/GA PD H mRNA吸光度值。1.6統(tǒng)計學(xué)處理采
14、用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件,定量表達結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s表示,組間比較計量資料采用t 檢驗,計數(shù)資料采用2檢驗。檢驗水準(zhǔn)=0.05。2結(jié)果2.1SqRT2PCR檢測結(jié)果在紫外線燈下,CEA mRNA擴增呈陽性者可見長度為131bp的條帶,無此條帶者為陰性。對照組中檢出1例CEA mRNA陽性表達,其余均為陰性表達,見圖1。2.2細胞學(xué)檢查、b2D NA技術(shù)及SqRT2PCR檢測方法的比較結(jié)果b2DNA技術(shù)及SqR T2PCR方法檢測結(jié)直腸癌患者腹腔FCC的檢出陽性率43.8%(21/48, 31.3%(15/48均高于PLC法4.2%(2/48,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(
15、P<0.01。b2DNA技術(shù)與SqR T2 PCR的檢出陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,但應(yīng)用b2DNA技術(shù)多檢出6例陽性患者 。圖1SqR T2PCR檢測CEA mRNA在標(biāo)本中的表達情況。M: Marker;A:結(jié)腸癌細胞株SW480(陽性對照;B、C、D:結(jié)直腸癌腹腔沖洗液,其中B、C呈陽性;E、F、G:結(jié)直腸良性病變腹腔沖洗液(陰性對照,其中E、F呈陰性;H:空白對照Fig.1The result s of CEA mRNA expressions detected by SqR T2PCR.M:Marker;A:Colon cancer cell line SW48
16、0(positive control;B,C and D:Peritoneal flushing fluid of colorectal cancer, where B,C positive;E,F and G:Peritoneal flushing fluid of benign colorectal disease(negative control,where E and F negative;H: Blank control2.3b2D NA技術(shù)和SqRT2PCR檢測結(jié)果與臨床病理因素的關(guān)系采用b2DNA技術(shù)及SqR T2PCR方法定量檢測結(jié)直腸癌患者腹腔中癌細胞CEA mRNA的相對表
17、達量與腺癌分化程度、漿膜侵犯和Dukes分期有關(guān)(P<0.05,而與腫瘤大小、患者性別、年齡無關(guān)(P> 0.05,見表1。表1b2D NA技術(shù)及SqRT2PCR方法檢測CEA mRNA表達結(jié)果與臨床病理因素的關(guān)系T able1The relationship bet w een the expressions of CEA mRNA detected by b2D NA and SqRT2PCR and clinicop athological factors臨床病理因素Clinicopat hological factorb2DNA陽性數(shù)(例Positive case(case相
18、對值( x±sRelative value( x±st值t valueP值P valueSqR T2PCR陽性數(shù)(例Positive case(case相對值( x±sRelative value( x±st值t valueP值P value年齡(歲 Age(year60<6010110.727±0.1230.730±0.088780.558±0.0740.589±0.044腫瘤大小(cmTumor size(cm腺癌分化程度Differentiation degreeof adenocarcinoma高分化
19、Moderately or poorlydifferentiated漿膜侵犯Serosal invasionDukes分期Dukes staging3討論結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與否直接影響著患者5年生存率,識別游離在腹腔沖洗液中的微量癌細胞,其目的在于判斷患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的危險性,從而有針對性地對患者進行輔助治療4,提高5年生存率。雖然,通過常規(guī)的細胞學(xué)檢查在腹腔沖洗液中發(fā)現(xiàn)癌細胞預(yù)示著患者術(shù)后較低的生存率5,6,這已成為一個金標(biāo)準(zhǔn),但由于PL C易受腹腔內(nèi)間皮細胞的干擾,敏感性低、漏診率高,一些PL C 檢測陰性的患者術(shù)后仍出現(xiàn)腹膜播散。本研究中PL C的陽性檢出率僅為4.2%(2/48,
20、因此,我們認(rèn)為在臨床工作中不能單獨采用此法。本研究中采用b2DNA技術(shù)及SqR T2PCR方法均是通過測定患者腹水或腹腔沖洗液中最為公認(rèn)的消化道惡性腫瘤標(biāo)志物CEA mRNA的表達來檢測腹腔FCC的存在7,8。由于腹腔內(nèi)存在大量RNA酶,結(jié)直腸癌細胞溶解破壞所釋放的CEA mRNA立即被降解,因此所檢測到的腹腔沖洗液中CEA mRNA可視為來自腹腔內(nèi)播散的存活癌細胞,這些存活癌細胞具備種植轉(zhuǎn)移的能力。而細胞學(xué)僅能反映細胞的形態(tài),無法反映癌細胞的存活狀態(tài),更無法反映癌細胞的內(nèi)部特征9。本研究中采用b2DNA技術(shù)和SqR T2PCR方法不僅可靈敏檢測腹腔內(nèi)的微量FCC,其陽性檢出率遠高于PL C,
21、而且能用相對定量反映不同樣本癌細胞數(shù)量的差異。SqR T2PCR方法有如下優(yōu)點10:若選擇適當(dāng)?shù)陌蠷NA,則敏感性和特異性均較高;能反映標(biāo)本的整體情況,而細胞學(xué)和免疫組化僅能反映標(biāo)本的局部情況。其缺點11是:SqR T2PCR反應(yīng)受多個因素影響,如硫酸鎂的濃度、引物退火的溫度、擴增的循環(huán)數(shù)等,對技術(shù)要求高,且相對定量是在PCR反應(yīng)的終點檢測產(chǎn)物凝膠電泳條帶密度,不能正確反映擴增前的實際比值,故該法準(zhǔn)確性有限,只能用于粗略比較樣品間的基因表達水平。我們分析假陽性產(chǎn)生的可能原因:CEA在白細胞中有非特異性表達12,13,本研究中采用2種方法在陰性對照組中均檢出1例CEA mRNA表達陽性,考慮可能
22、為此原因;標(biāo)本采集時上皮細胞的污染;PCR擴增條件的不當(dāng);非特異性細胞低水平的非法轉(zhuǎn)錄。假陰性產(chǎn)生的原因可能為RNA易被腹腔內(nèi)廣泛存在的RNA酶降解。因此,SqR T2PCR在檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移存在一定的局限性。基于b2DNA信號放大的基因表達定量檢測技術(shù)可克服SqR T2PCR方法的種種不確定因素,無需抽提純化RNA,無需逆轉(zhuǎn)錄,無需PCR擴增,對樣本量下限無要求,靈敏度高(每孔有50個拷貝數(shù)即可得到陽性結(jié)果,只需將樣本用特定裂解液裂解后,經(jīng)探針雜交和信號放大(可放大400倍即可迅速得到精確的定量結(jié)果14217。本研究中采用b2DNA技術(shù)檢測48例結(jié)直腸癌患者腹腔沖洗液中CEA mRNA的表達陽
23、性率為43.8%(21/48, SqR T2PCR的表達陽性率為31.3(15/48,比SqR T2PCR多檢出6例。但b2DNA技術(shù)檢測費用較高,有待進一步改進。綜上所述,基于b2DNA信號放大的基因定量檢測技術(shù)和SqR T2PCR方法檢測腹腔沖洗液中CEA mRNA的表達來間接檢測結(jié)直腸癌患者腹腔內(nèi)的FCC是可行的,且2種方法各有優(yōu)缺點,但b2 DNA技術(shù)較SqR T2PCR操作更為簡單,且影響因素少,其相對定量結(jié)果更為可靠、精確。但本研究為小樣本量研究,今后還需擴大樣本量來更進一步證實其研究結(jié)果。4參考文獻1Akasu T,Sugihara K.Solitary peritoneal m
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