同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原海綿修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究

1、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原海綿修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究                      作者：楊柏林，潘勇，云雄，鄒重文，曹國永【摘要】  目的：了解兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMscs)同種異體移植的存活分布情況及同種異體兔BMscs復(fù)合膠原海綿(CS)情況，觀察其對兔橈骨1.5 cm缺損的修復(fù)效果，為將來的進一步應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。方法：采集、培養(yǎng)、純化擴增新西蘭大

2、白兔BMscs，用eGFP熒光標(biāo)記BMscs，與膠原海綿聯(lián)合培養(yǎng)，植于同種異體動物臀大肌，觀察存活及分布情況。建立兔橈骨缺損(1.5 cm)模型，45只新西蘭大白兔隨機分為3組：同種異體BMscs/CS組(A組)，單純膠原海綿組(B組 )，空白對照組(C組)。術(shù)后分階段行X線、組織學(xué)檢查及生物力學(xué)檢查，評價其修復(fù)效果。結(jié)果：eGFP標(biāo)記的BMscs異體移植存活時間超過3周。X線示12周A組大白兔5只中有4只達(dá)到骨性連接。新生骨量呈A組C組遞減，至12周無一愈合。隨著時間推移，A組編織骨髓腔和骨小梁增多，修復(fù)過程優(yōu)于B、C組。A組生物力學(xué)指標(biāo)均低于健側(cè)正常對照組，但各指標(biāo)能達(dá)到正常組的80%90

3、%。結(jié)論：同種異體MSCs復(fù)合CS可以修復(fù)1.5 cm兔橈骨缺損。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;組織工程;移植;骨缺損             ABSTRACT Objective:To study the survival and distribution of allogenic mesenchymal stem cells (BMscs) after implantation into other rabbits, evaluate osteog

4、enetic effectiveness of collagensponge mixed with allogenic BMscs of rabbit in repairing of radial shaft defects, and lay the foundation for further application.Methods: The BMscs of New Zealand white rabbits were collected，cultured，purified and amplified，they were marked with eGFP, cultured with co

5、llagensponge and planted into ectogluteus of other rabbits in order to observe the survival and distribution of BMscs. Model of radial bone defects (15 mm )of rabbits was established. 45 rabbits were divided into 3 groups, group A (BMscs/CS group), group B (CS group) and group C (untreated group). R

6、oentgenographic, histologic, biomechanics indexed of the animals were examined at certain time after surgery to evaluate osteogenetic effectiveness.Results: The BMscs marked with eGFP could survive for 3 weeks. On the 12th week, 4 of 5 radial bone defects healed in group A.The quantity of callus dec

7、reased from group A to C. In group B and C, no one rabbits healed on the 12th week. Biomechanics result showed the indexes of group A were lower than the opposite side normal control groups.Conclusion: BMscs mixed with CS can repair radial defect shorter than 1.5 cm in rabbit.KEY WORDS Bone marrow m

8、esenchymal stem cells; Tissue engineering; Transplant; Bone defects利用組織工程的方法骨缺損，是目前骨科基礎(chǔ)研究的熱點之一。目的基因、種子細(xì)胞、支架材料是組織工程三大要素，種子細(xì)胞作為其中一項要素引起了廣泛的研究1，2，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells， BMscs )是研究較多的種子細(xì)胞之一。傳統(tǒng)的自體細(xì)胞移植在實驗室研究階段存在著大量細(xì)胞取材困難，宿主存活時間難以保證，不同宿主細(xì)胞容易混雜污染等缺點。研究發(fā)現(xiàn)BMscs可有效繞過機體的免疫排斥進行異體移植，基于此本文將

9、異體BMscs復(fù)合膠原海綿，對兔1.5 cm橈骨缺損修復(fù)進行了實驗研究。1 材料與方法1.1 材料優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青公司);DMSO(上海生化試劑二廠);MTT(美國Sigma公司);Percoll分離液(密度1.073 g/mL，天津TDB公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Amesco公司);注射用肝素鈉、注射用鏈霉素、速眠新(華北制藥股份有限公司);膠原海綿(北京益而康公司)新西蘭大白兔(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪動物中心);eGFPAd由重慶武警總隊醫(yī)院曹國永博士提供。1.2 方法將上述方法獲得的eGFPAdBMscsCS復(fù)合材料取出，PBS清洗，2.5%戊

10、二醛固定，乙醇和丙酮梯度脫水，和CS一起臨界點干燥后噴金，掃描電鏡觀察。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：新生骨面積百分比1%24%計1分;25%49%計2分;50%74%計3分;75%99%計4分;100%計5分。2 結(jié)果2.1 原代BMscs 顯微鏡觀察結(jié)果BMSC形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似，呈紡錘形，有少量細(xì)胞突起。隨著換液的進行，出現(xiàn)集落狀細(xì)胞群，由1020個細(xì)胞組成，此后細(xì)胞集落迅速增多，融合成片，呈旋渦狀排列， 912 d細(xì)胞鋪滿瓶底成單層，見圖1。圖1 倒置顯微鏡下原代BMscs圖象(×100)2.2 膠原海綿及eGFPAdBMscsCS復(fù)合體掃描電鏡觀察結(jié)果膠原海綿疏松多孔，大小不均。復(fù)合材料

11、掃描觀察見BMscs在CS支架材料上伸展良好，細(xì)胞融合成片狀，細(xì)胞與周圍材料緊密相連，少數(shù)成球形(圖2)。2.3 eGFP標(biāo)記的BMscs體內(nèi)示蹤觀察結(jié)果術(shù)后3 d，冰凍切片在熒光顯微鏡下可見移植區(qū)大量eGFP陽性細(xì)胞。術(shù)后7 d可見少許減弱，在膠原海綿外周邊組織亦發(fā)現(xiàn)有少許eGFP陽性細(xì)胞。3周后熒光明顯減弱，5周后消失。2.4 X線觀察結(jié)果A組：4周時缺損處少許骨痂生長，8周時大量骨痂形成。12周時，5例中有4例有連續(xù)骨痂通過，新生骨塑形改建。B、C組：4周時缺損處空虛，至12周仍無1例愈合，形成骨不連。但B組骨痂多于C組。見圖3。圖2 膠原海綿及EgfpAdBMscsCs復(fù)合體掃描隧道顯

12、微鏡圖像(×700)1         圖3 A、C組X線圖像X線骨形成評分結(jié)果顯示，4周時A、B、C組評分值分別為(3.8±0.5)、(0.8±0.4)和(0.7±0.4);8周時各組評分值分別為(4.7±0.9)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0);12周時分別為(4.3±0.4)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0)，在各時間點A組評分均高于B、C組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);B、C組間評

13、分值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2.5 組織學(xué)觀察結(jié)果A組修復(fù)過程4周時以纖維骨痂和軟骨組織為主，含大量軟骨細(xì)胞;8周時編織骨開始增多，出現(xiàn)骨小梁，部分標(biāo)本出現(xiàn)髓腔;12周時髓腔和骨小梁進一步增多，但髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞少見。B、C兩組修復(fù)過程類似，可見纖維組織增生,12周時缺損區(qū)填充纖維組織，僅有少量骨組織形成，最后缺損處形成纖維連接(見圖4)。圖4 A、C組組織修復(fù)圖像2.6 生物力學(xué)測定A組的最大載荷、抗壓強度和彈性模量分別為(87.8±9.8)N、(8.4±0.9)Mpa及(187.5±8.2)Gpa，均低于健側(cè)組(112.3±11.2)N

14、、(9.5±0.2)Mpa及(210.5±15.9)Gpa，且結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3 討論BMscs最初是由Friedenstein5提出，1987年Friedenstein發(fā)現(xiàn)一類易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，具有多向分化潛能,特定條件下可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞分化6。骨髓中MSC的數(shù)量有限,含量極低,通常105106個骨髓有核細(xì)胞中僅有1個MSC7。故如何從體外獲取、純化MSC并使其高效快速增殖成為組織工程技術(shù)應(yīng)用和推廣的熱點問題。密度梯度離心法利用MSC與其他細(xì)胞的密度不同，用特定密度的淋巴細(xì)胞分離液將MSC

15、分離出來,該法所獲得的細(xì)胞種類單一,細(xì)胞純度高,可以滿足組織工程研究的要求。本實驗采用密度梯度離心法得到MSC后采用貼壁培養(yǎng)法，通過傳代將MSC純化,其原理如下：首先利用MSC與其他有形成分的密度不同，通過密度梯度離心法有效地將絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板除去,獲得純度較高的單個核細(xì)胞。再通過貼壁培養(yǎng)和換液可除去懸浮生長的血細(xì)胞。通過傳代3次，本實驗所看見細(xì)胞形態(tài)一致，雜質(zhì)細(xì)胞少見，從而達(dá)到了有效的分離和純化。目前,關(guān)于MSC的鑒定也無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。BMscs表面標(biāo)志物具有非單一性的特性，它不表達(dá)造血譜系標(biāo)志物 CD11，CD45,CD34,而表達(dá)CD44,CD71,CD9069。由

16、于其表面標(biāo)志的非專一特性,目前還沒有篩選到MSC特異的分子標(biāo)記，其鑒別主要是綜合判斷10。本實驗獲得的細(xì)胞從形態(tài)看,MSC呈均一的成纖維細(xì)胞形態(tài),貼壁生長為梭形、三角形,各代之間形態(tài)單一，結(jié)合其分離方法分析，符合BMscs的特征。研究還發(fā)現(xiàn)BMscs可有效繞過機體的免疫排斥進行異體移植，從而極大的方便了BMscs的應(yīng)用。在鼠、兔等多種動物體內(nèi)進行的同種異體移植試驗中，均未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)。在人的體外實驗研究中，將取自與hBMscs供者無關(guān)的淋巴細(xì)胞與hBMscs共存培養(yǎng)，hBMscs并不激發(fā)T細(xì)胞增殖，反而抑制混合細(xì)胞群淋巴細(xì)胞性的反應(yīng)。Lieehty11等將人BMscs體外培養(yǎng)后，移植

17、入妊娠早期羊胚胎囊腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)人BMscs可分化出多種細(xì)胞，并且在胎羊內(nèi)存活超過13個月。關(guān)于BMscs逃避宿主免疫排斥的機制可能為：(1)BMscs的低免疫原性。BMscs主要表達(dá)MHCI型分子，不表達(dá)或極少表達(dá)MHCII型分子，而MHCI型分子可以保護BMscs免受NK細(xì)胞對其造成殺傷12。(2)BMscs抑制T細(xì)胞的增殖13，或調(diào)整其表型來抑制正常的免疫排斥反應(yīng)14。(3)BMscs分泌多種可溶性因子15如IL6、IL7、IL8、IL11、IL12、IL14、IL15、IL27、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor)、干細(xì)胞因子( stem cell fa

18、ctor)、肝細(xì)胞生長因子(Hcpatocytc growth factor)等。這些因子可能促進了局部免疫抑制微環(huán)境的形成。同時，本實驗采取深低溫凍存可能改變了其表面的抗原結(jié)構(gòu)，使受者對其免疫反應(yīng)性下降，出現(xiàn)免疫耐受。實驗觀測示植入的BMscs可在宿主內(nèi)存活3周，證實了以上觀點。實驗還發(fā)現(xiàn)植入的細(xì)胞在局部聚集，周圍組織含有少量細(xì)胞，也說明了支架材料與種子細(xì)胞粘附良好，同時BMscs有一定的遷移能力，具有活躍的細(xì)胞功能。體內(nèi)實驗從病和影像學(xué)指標(biāo)上顯示了無論是在骨缺損修復(fù)速度還是新生骨成骨數(shù)量A組處理對象均超過其它組，驗證了BMscs具有一定的修復(fù)骨缺損能力，而B、C組無顯著性差異，這證明單純膠

19、原海綿支架材料植入并不能修復(fù)1.5 cm兔橈骨干缺損。在A組的生物力學(xué)實驗結(jié)果上，雖然力學(xué)性能實驗組低于健側(cè)正常組，但是在最大載荷、彈性模量和抗壓強度上仍達(dá)正常值的78.2%，88.4%和89.3%，說明同種異體BMscs移植是一種有效的方法。但是針對具體移植后BMscs的轉(zhuǎn)歸和免疫學(xué)變化還有待于進一步研究。【】  1 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC. et al.Muhilineage potential of adult human mesenchymal stem cells J. Science, 1999,284:143147.2 Jian

20、g Y, Jahagirdar B, ReinhaMt RL, et al.Pluripotent nature of adult marrow derived mesenchymal stem cells J. Nature, 2002,418: 4149.3 李冬梅,金連弘, 張宇, 等. 密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性J. 臨床康復(fù), 2006, 10(17):1820.4 Tsuchida H, Hashimoto J, Crawford E, et al.Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in ratsJ. Orthop Res, 2003, 21:4453.5 Friedenstein AJ, Chailakhyan PK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in di