人凝血酶原復合物在制備過程中凝血因子活性的檢測和分析.docx

1、.論著.人凝血酶原復合物在制備過程中凝血因子活性的檢測和分析張璘，劉曉，李青，張廷芬，張安山，張金，何彥林蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的對人凝血酶原復合物在制備工藝中凝血因子效價進行檢測和分析。方法對PCC制備過程中的血漿、S/D病毒滅活、凍干工藝、干熱病毒滅活前和后分別取樣，檢測分析凝血因子U、W、IX和X效價，分別分析S/D病毒滅活、凍干工藝、干熱病毒滅活前和后凝血因子效價的變化情況。分析PCC干熱病毒滅活后的樣品中四種凝血因子的效價比例。結果三批血漿中凝血因子1I、VD、IX和X的活性在0.8l2IU/mL之間。S/D病毒滅活前后

2、PCC凍干工藝前后PCC中四種凝血因子活性無明顯變化，而干熱病毒滅活后PCC中四種凝血因子活性均有明顯下降。三批PCC中四種凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子W效價較低，凝血因子II效價偏高。結論通過PCC制備工藝中凝血因子效價的檢測和分析可實現(xiàn)良好的質(zhì)量控制。關鍵詞：凝血因子活性;人凝血酶原復合物;質(zhì)量控制中圖分類號：R378文獻標志碼：A文章編號：1005.5673(2015)06.0022.(協(xié)DOI：10.13309/ki.pmi.2015.06.006Detectionandanalysisofcoagulationfactoractivityinpreparationofhuma

3、nprothrombincomplexconcentrateZHANGLin,LIUXiao,LIQing,ZHANGTing-fen,ZHANGAn-shan,ZHANGJin,HEYan-linLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:HEYan-lin,E-mail:HylinlzAbstract:ObjectiveTodetectan

4、danalyzethecoagulationfactorsinpreparationofhumanprothrombincomplexconcentrate(PCC)MethodsTheactivityofcoagulationfactorsII,VII,IX,Xwasmeasuredinthreebatchesofplasma.ThedifferencesinactivityofcoagulationfactorsII,VII,IXwasdeterminedbeforeandaftersteps,suchassolvent/detergent(S/D)inactivation,freeze-

5、dryingprocess,dry-heatingviralinactivation.TheproportionofcoagulationfactorinthePCCsamplewasalsoassayed.ResultsCoagulationfactorsII,VII,IX,Xactivityare0.8-1.2lU/mLinthethreebatchesofplasma.Thedifferenceinfourcoagulationfactoractivitywasnotsignificantbeforeandafterfreeze-dryingandS/Dtreatment,thuscoa

6、gulationfactoractivitywassignificantlydecreasedafterthedry-heatingviralinactivation.ThepropotionoffourfactorswasbasicallysameinthethreebatchesofPCC;thetiterofcoagulationfactorVIIwasrelativelow,butthatofcoagulationfactorIIwasrelativehigh.ConclusionAgoodqualitycontrolappproachcouldbeachievedbyusingdet

7、ectionandanalysisofthecoagulationfactorsinpreparationofhumanprothrombincomplexconcentrate.Keywords:Coagulationfactorsactivity;Humanprothrombincomplexconcentrate(PCC)；Qualitycontrol人凝血酶原復合物是一種供靜脈輸注、促進血液凝固的止血制劑，主要含有人凝血因子U、VK、IX和X。臨床上PCC廣泛應用于治療乙型血友病、外科手術的止血和由肝臟疾患維生素K缺乏而繼發(fā)作者簡介:張璘，醫(yī)學生物學工程師，主要從事血液制品生產(chǎn)質(zhì)量控制

8、工作。通訊作者:何彥林，E-mail:Hylin-lz的凝血因子u、vn、ix和x低下或先天性缺乏凝血因子所造成的出血，以及因長期使用人凝血因子vm使機體產(chǎn)生了抗-人凝血因子郴因子的甲型血友病患者的出血3成。近年來，臨床PCC應用量的逐年增加，而中國禁止進口血源性凝血因子產(chǎn)品，因此PCC的研制成功不僅能緩解國內(nèi)臨床用量的緊張局面，而旦提高了血漿的綜合利用率。在PCC的制備過程中，凝血因子n、vn、ix和x的效價檢測和分析對pcc的質(zhì)量控制具有重要的意義。由于ACL7000全自動凝血儀具有功能強、準確度高、重復性好、智能程度高等優(yōu)點，實驗中采用了ACL7000全自動凝血儀對PCC生產(chǎn)過程中的關鍵

9、環(huán)節(jié)進行檢測分析,為實現(xiàn)PCC良好的質(zhì)量控制起到了可靠的保障作用。1材料和方法1.1試劑和設備缺乏凝血因子口、vn、ix和x血漿、APTT、PT等檢測試劑均購自PacificHemostasis公司；PCC國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院;硫酸魚精蛋白購自Sigma公司；ACL7000全自動凝血儀.0.025mol/L氯化鈣、凝血因子稀釋液、樣品杯和樣品盤均購自Instrumentationlaboratory公司。1.2 凝血因子效價檢測方法按照文獻4人凝血因子II、VD、IX和X效價檢測方法（一期法）和ACL7000全自動凝血儀說明書進行檢測。1.3 PCC制備工藝和批次采用DEAES

10、ephadexA.50吸附、S/D和干熱（8072h）病毒滅活的制備工藝，分別制備201403001、201403002和201303003三批PCC,規(guī)格為200IU/瓶。1.4 PCC制備過程凝血因子效價檢測采取血漿、S/D病毒滅活前和后、凍干前和后、干熱病毒滅活前和后樣本，用一期法檢測各樣品中四種凝血因子的效價。1.5 分析PCC制備過程中凝血因子效價的變化分析三批PCC生產(chǎn)過程中血漿、S/D病毒滅活前后、凍干過程中前后和干熱病毒滅活前后四種凝血因子效價。1.6 分析PCC中四種凝血因子效價的比例按照1.5項中檢測的PCC干熱病毒滅活后樣品中四種凝血因子效價的檢測結果，分析PCC中四種凝

11、血因子效價的比例。1.7統(tǒng)計學方法檢測結果采用SPSS19.0方差分析軟件進行配對t檢驗。2結果2.1三批血漿中四種凝血因子活性三批血漿中凝血因子口、訓、IX和X活性均在0.81.2IU/mL,見表1O表1三批血漿中凝血因子ii、vh、ix和x活性檢測結果Tab.1Thedetectedresultofcoagulationfactors11,VII,IX,Xactivityfromthreebatchesofplasma批號凝血因子效價（岫L）n圳IXX2014030010.961.050.770.892014030010.981.200.820.942014030011.061.200.8

12、80.982.2S/D病毒滅活前后凝血因子效價變化三批均0.05,表明S/D病毒滅活前后四種凝血因子的PCCS/D病毒滅活前后四種凝血因子效價的P值效價無統(tǒng)計學意義。表2S/D病毒滅活前后凝血因子效價檢測結果Tab.2ThedifferenceofcoagulationfactortiterbeforeandafterS/Dinactivation凝血因亍201403001201403002201403003S/D前S/D后S/D前S/D后S/D前S/D后II效價(IU/mL)51.250.538.1VII效價(IU/mL)29.830.122.020.129.028.

13、1IX效價(IU/mL)31.328.921.319.924.021.2X效價(IU/mL)42.842.732.532.738.539.72.3凍干工藝過程前后凝血因子效價變化三批0.05,表明凍干前后四種凝血因子的效價無統(tǒng)計學PCC凍干工藝前后四種凝血因子效價的P值均意義。表3凍干工藝前后凝血因子效價檢測結果Tab.3Thedifferenceoftiterforcoagulationfactorbeforeandafterfreeze-dryingprocess凝血因子201403001201403002201403003凍干前凍干后凍干前凍干后凍干前凍干后II效價（IU/瓶）35035

14、2387377330321vn效價（iu/瓶）204202230200214201IX效價（IU/瓶）284266293278279261X效價（IU/瓶）2892853073102572632.4干熱病毒滅活前后凝血因子效價變化PCC中四種凝血因子活性在干熱后的P值均0.01,表明干熱前后四種凝血因子效價有顯著性統(tǒng)計學意義,盡管干熱后凝血因子效價有所下降，但是干熱后凝血因子效價仍然符合中國藥典三部2010版的要求。表4干熱病毒滅活前后凝血因子效價檢測結果Tab.4Thedifferenceoftilerforcoagulationfactorbeforeandafterdry-heating

15、viralinactivation凝血因子201403001201403002201403003干熱前干熱后干熱前干熱后干熱前干熱后II效價（IU/瓶）352264377275321244vn效價（iu/瓶）202131200138201147IX效價（1U/瓶）266194278220261198X效價（IU/瓶）2851973102422631972.5PCC中四種凝血因子比例分析三批PCC中四種凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子vn效價較低，凝血因子n效價偏高。三批pcc中四種凝血因子的比例分析見圖1。圖1三批PCC中四種凝血因子比例分析圖Fig.1Analysisofpropotio

16、nforfourcoagulationfactorfromthreebatchesPCC3討論PCC的效價測定早期采用限量法，其測定結果只能表示PCC中所含凝血因子的總效價。近年來，隨著檢測方法的不斷完善,PCC的效價測定可以準確測定出其中四種凝血因子的效價。凝血因子效價的測定方法經(jīng)歷了從最初的手動秒表計時法到現(xiàn)在的半自動凝血儀測定法和全自動凝血儀測定法的發(fā)展，全自動凝血儀測定法是全自動樣品的稀釋計時和計算，結果準確可靠，為PCC的質(zhì)量控制提供了方便。田倩等'采用CA-500全自動血凝儀對人凝血酶原復合物凝血因子活性測定的影響因素進行了研究,PCC前處理條件、測定稀釋劑、制品所含的鹽離

17、子濃度、測定標準品及不同廠家的試劑均影響其凝血因子的活性，在檢測過程中應予重視。李青等對ACL7000全自動凝血儀檢測人凝血因子IX效價的影響因素進行了研究，結果顯示最優(yōu)Ca：離子濃度為0.0125mol/L,硫酸魚精蛋白中和肝素后，凝血因子效價受稀釋倍數(shù)影響較小。對于凝血因子類產(chǎn)品的制備，原料血漿的質(zhì)量控制極為重要，原料血漿采集、儲運和融漿過程等均會影響血漿中凝血因子的活性。因此，實驗中首先分析了三批血漿中凝血因子u、vn、ix和x的活性在0.8l.2IU/mL之間。為進一步考察工藝過程對PCC中凝血因子活性的影響，實驗中還檢測分析了凍干工藝過程和干熱病毒滅活過程前后PCC中凝血因子活性的變

18、化，結果顯示PCC凍干工藝前后PCC中四種凝血因子活性無明顯變化，而干熱病毒滅活后PCC中四種凝血因子活性均有明顯下降，因此在PCC半成品制備時要把工藝過程中凝血因子效價的損失考慮在內(nèi)。PCC中的凝血因子的配比關系到制品的致血栓性，如FVD較高時可導致FVDa更多，被認為是導致引發(fā)血栓的一個重要原因。尤其FII和FX較高時，其致血栓性增強。有資料顯示,PCC中四種凝血因子的比例為1：1：1：1時，其致血栓性應最低。因此，實驗中分析了PCC干熱病毒滅活后樣品中四種凝血因子的比例,結果顯示，三批PCC中四種凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子vn效價較低，凝血因子n效價偏高，今后還有待進一步優(yōu)化該

19、制備工藝,使四種凝血因子的比例趨于一致。參考文獻1包正琦，何彥林.人凝血酶原復合物制備工藝研究現(xiàn)狀門.微生物學免疫學進展,2013,41(4)：79-84.2 鄭志華，菅K勇，張翠萍，等.人凝血酶原復合物臨床應用研究進展J.臨床血液學雜志,2014,27(4)：352-355.3 FranchiniM,LippiG.Prothrombincomplexconcentrates:anupdateJ.BloodTransfus,2010,8(3):149-154.4 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)S.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄75-76.5 田倩,曹海軍，曹雅，等.人凝血酶原復合物中凝血因子活性測定的影響因素研究J.中國生化藥物雜志,2014,34(2):17-19.6 李青，劉曉，張璘，等.人凝血酶原復合物中凝血因子IX效價檢測中影響因素的探討J.中國輸血雜志,2014,27(11)：1249-1251.7PeterH.Productionandcompositionofprothrombinco