槲皮素醫(yī)治口腔潰瘍的愈合研究

1、槲皮素醫(yī)治口腔潰瘍的愈合研究     本文作者：趙志宇 郭蘭 韓淑英 單位：河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院口腔科 河北聯(lián)合大學復發(fā)性口腔潰瘍(recurrentoralulcer，ROU)是口腔黏膜病中最常見的疾病之一，發(fā)病時疼痛劇烈，且復發(fā)率高，很難根治。因疾病原因及機制不清，故治療多以對癥為主。全身藥物治療繁瑣，副作用多，不易為患者所接受。物理及心理療法療效還不確切，故多以局部治療為主。局部治療的劑型有糊劑、霜劑、軟膏等，以上劑型由于在口腔內維持時間短，局部藥物有效濃度降低，易受唾液影響等原因療效欠佳。近年來發(fā)展起來的新劑型膜劑克服了上述劑型的缺點，具有含藥量

2、準確，抵抗唾液清除，延長藥物作用時間，較好地發(fā)揮藥效，且攜帶方便，用藥方法簡單等優(yōu)點，逐漸成為治療復發(fā)性口腔潰瘍的主要劑型。槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于自然植物中，約有100種中草藥含有槲皮素。近年來對它的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)其有抗氧化清除自由基、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、增強免疫及保護心血管等多種藥理活性。由于槲皮素毒副作用小，越來越顯示出重要的臨床應用價值，但應用于口腔潰瘍的治療尚未見報道。本實驗擬用殼聚糖為成膜材料，加入槲皮素制備口腔潰瘍藥膜，應用于口輕潰瘍動物模型驗證其療效，為臨床應用提供實驗依據(jù)。1材料與方法11動物清潔級SD大鼠，雌、雄兼有，體重19

3、0230g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號SCXK(京)2009-0004。實驗動物在華北煤炭醫(yī)學院實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)和實驗。60Co照射大鼠普通飼料，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號SCXK(京)-2005-0007。12藥品槲皮素(querctin，中國藥品生物制品檢定所，批號0090-1006，純度99%);殼聚糖(chitosan，CS白色粉末，脫乙酰度821%，相對分子質量138000，青島生化廠);冰硼散(山東方健制藥有限公司，批號20100511)。13儀器TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、電子天平(上海第二天平儀器廠)、RB

4、-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)、自動雙重純水蒸餾器SZ-93(上海容亞生化儀器廠)、超低溫冰箱(三洋電機株式會社)、電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)、722型分光光度儀(北京市六一儀器廠)、日立7180全自動生化分析儀(日本日立公司)、GL-20G-型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、酶標儀(BIO-RADcompany)、石蠟切片機(德國LeicaRM2145)、MoticMed60數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學)、數(shù)碼照相機(日本日立公司)。14方法141動物模型的建立1清潔級SD大鼠60只，體重190230g，普通飼料(飼養(yǎng)條件:大鼠自由取食、飲水，分籠飼養(yǎng)，勤

5、換墊料，房間溫度22，濕度40%，12h明暗周期)適應性喂養(yǎng)1周后，在100g/L水合氯醛(09g/kg)麻醉下，用直徑03cm的NaOH晶體圓片在雙側下唇靠口角黏膜處燒灼6s，生理鹽水沖洗后形成潰瘍。142槲皮素殼聚糖貼膜的制備稱取一定量的CS，溶于1%(v/v)的冰醋酸水溶液中，得到4%(w/v)的CS醋酸溶液，3000r/min離心30min除去雜質即為CS液，密封備用。稱取一定量槲皮素于乳缽中，滴加少量無水乙醇攪拌，溶解后加入上述醋酸殼聚糖溶液，使其濃度為1%，充分攪拌即成復合膜液。用流涎法于玻璃板上制成膜，室溫自然干燥后，起膜。在紫外線燈下滅菌15min，用直徑04cm打孔器制成原型

6、膜片(其中槲皮素含量02mg/每片貼膜)，包裝密封，其中不加槲皮素為CS對照膜。143分組和給藥造模后第2天將所有口腔潰瘍大鼠隨機分為基質組(CS，不加槲皮素的膜，8mg/每片)、復合膜(QUCS，02mg/每片貼膜)組、冰硼散(BPS，每潰瘍面02mg)組和空白對照組(control)，并開始給藥，單籠飼養(yǎng)。對照組不采取任何處理措施;基質組動物在潰瘍處貼CS膜;槲皮素與殼聚糖復合膜組貼QUCS膜;冰硼散組在潰瘍處噴灑冰硼散。各藥均2次/d，即上午8:00和下午5:00各1次，直至潰瘍完全愈合為止。144QUCS對大鼠潰瘍局部充血水腫程度、感染情況影響拍照記錄潰瘍愈合情況，記錄每只鼠潰瘍完全愈

7、合時間，計算各組平均愈合時間。用透明膠片畫記創(chuàng)面大小，計算創(chuàng)面面積，以判斷愈合速度。平均愈合速度(mm2/d)=最大潰瘍面積(mm2)/治療時間(d)2。潰瘍周圍水腫，充血程度:度:充血直徑1mm;度:充血直徑12mm;度:充血直徑2+4mm;度:充血直徑4mm。145QUCS對大鼠潰瘍處組織病理學影響大鼠于給藥4d(造膜5d)各組隨機取5只脫頸處死，切取潰瘍處病變組織，4%中性甲醛液固定后，用乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后，再浸入已融化的石蠟中進行浸透、包埋。用切片機切成5m的薄片，貼于載玻片上，脫蠟，常規(guī)HE和馬松染色。于切片上滴加中性樹膠，并用蓋薄片進行封固，顯微鏡下觀察、拍照。組織學評價為記

8、錄炎細胞數(shù)、壞死及潰瘍等。療效判定分級標準:根據(jù)口腔黏膜損傷程度定出5個分級，鏡下按半定量評分法評分，每張片連續(xù)觀察10個視野(200倍)，求其平均值，其標準見下。0級:口腔黏膜無炎細胞、壞死及潰瘍等改變;1級:口腔黏膜有少數(shù)炎細胞，無壞死及潰瘍等改變;2級:口腔黏膜有較多炎細胞，無壞死及潰瘍等改變;3級:口腔黏膜有大量炎細胞，部分有壞死，但無潰瘍等;4級:口腔黏膜潰瘍形成，有壞死組織及肉芽組織。146數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS130統(tǒng)計軟件進行分析。結果以x珋±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P005為差異有統(tǒng)計學意義。2結果21QUCS對大鼠口腔潰瘍模型潰瘍愈合速度、水腫充血

9、程度及表面感染情況的影響造模24h(1d)大鼠雙側口角處黏膜可見直徑約4mm×35mm的潰瘍形成，略凹陷，表面灰白色，周緣充血水腫，觸痛陽性。2d(用藥后1d)，對照組潰瘍面積有擴大，充血水腫均較重;各給藥組也有不同程度擴大，但多不明顯，組織水腫輕于對照組，以QUCS組較輕。3d(用藥后2d)空白對照組潰瘍表面壞死，有假膜生成，覆蓋于潰瘍表面，并明顯嚴重于各給藥組。45d(用藥后34d)，潰瘍表面假膜開始有脫落，假膜下組織創(chuàng)面暴露，部分潰瘍面開始愈合，給藥組創(chuàng)面愈合明顯好于對照組，QUCS組潰瘍面積明顯小于對照組。67d(用藥后56d)，潰瘍明顯好轉，潰瘍面積明顯縮小，各給藥組愈合情

10、況明顯好于對照組;QUCS組用藥6d多數(shù)大鼠潰瘍完全愈合，BPS組潰瘍愈合快于CS組。治療10d后對照組多數(shù)大鼠潰瘍完全愈合。QUCS使?jié)冇蠒r間由10d縮短至6d。各組大鼠潰瘍愈合速度、水腫充血程度及表面感染情況見圖1和表12。22QUCS對大鼠口腔潰瘍模型組織形態(tài)影響大鼠于給藥4d(造膜5d)各組隨機取5只脫頸處死，切取潰瘍處病變組織，HE染色切片顯示:對照組炎癥反應較重，上皮壞死脫落，有出血灶，炎細胞浸潤明顯;QUCS組和BPS組見少量炎細胞浸潤，出血灶少，可見新生的成纖維細胞和許多新生的小血管;CS組介于QUCS組和BPS組之間(圖2)。按半定量評分法評分，每張片連續(xù)觀察10個視野(

11、200倍)，求其平均值，其分值見表3，分值最低者為QUCS組(與BPS組相近)，最高者為對照組。3討論目前，口腔潰瘍動物模型制作方法主要有輻射誘導3，免疫法誘導4，細菌感染誘導5，創(chuàng)傷性潰瘍模型6等，其中免疫法模型的病理及臨床表現(xiàn)最接近復發(fā)性口腔潰瘍，但該方法造成全身免疫系統(tǒng)紊亂，可能同時造成胃黏膜及其他組織潰瘍及損傷，影響進食及其他身體功能，且潰瘍部位不定，不便于觀察測量，因此本實驗采用創(chuàng)傷法，NaOH晶體圓片在大鼠雙側下唇靠口角黏膜處燒灼6s，生理鹽水沖洗后制備口腔潰瘍模型。該方法具有定位準確、大鼠潰瘍直徑大小一致、便于觀察及測量的優(yōu)點?？谇粷兪强谇火つぶ凶畛Ｒ姷奶弁葱约膊?，具有周期性及燒灼性疼痛的特點，且復發(fā)率高。目前，口腔潰瘍的治療主要以局部為主，但由于口腔環(huán)境復雜，藥物在口腔潰瘍表面常被唾液、食物等稀釋，使藥物的使用療效受限，而全身用藥治療效果也不理想。近年隨著對槲皮素的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)槲皮素有抗氧化清除自由基、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、增強免疫及保護心血