實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA表達水平

1、實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA表達水平【摘要】 目的 探討實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA表達的方法。方法 以BB270femA基因表達為標(biāo)準(zhǔn)，建立實時熒光定量PCR方法，對實驗菌株femA表達進行相對定量。結(jié)果 建立的實時熒光定量PCR方法所得結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，熔解峰單一。隨MIC變化，金黃色葡萄球菌femA表達水平也隨之變化。結(jié)論 用實時熒光定量PCR方法研究金黃色葡萄球菌femA表達量結(jié)果可靠、敏感、重復(fù)性好。 【關(guān)鍵詞】 金黃色葡萄球菌；femA基因；實時熒光定量PCR Abstract： Objective To establish the appro

2、ach of real-time fluorescent quantitative PCR to detect femA gene in Staphylococcus aureus strains. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to quantify the expression of femA gene of 15 clinical stains, as compared with BB270. Results The standard curve by real-time fluorescent

3、quantitative PCR showed good linearity between the amount of femA RNA and cycle threshold and the melting curve had a single peak. The variation of expression level of femA was in accordance with MIC of strains. Conclusions The real-time fluorescent quantitative PCR in the detection of femA expressi

4、on is accurate, sensitive and repeatable. Key words: Staphylococcus aureus; femA gene; real-time fluorescent quantitative PCR 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time Q-PCR）由于其具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域中，其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面：DNA或RNA的絕對/相對定量分析，基因表達

5、差異分析，基因分型。 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是全球感染性疾病領(lǐng)域研究熱點之一。已知femA是MRSA耐藥表達的重要輔助基因，與MRSA高水平耐藥成正相關(guān)1-3，但還未見研究報道兩者確切關(guān)系。本實驗利用近年來興起的實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌femA基因表達水平，進一步明確femA在MRSA耐藥表達中的意義。同時建立實時熒光定量PCR用于金黃色葡萄球菌RNA定量檢測的具體方法和穩(wěn)定體系。 1 材料和方法 1.1 菌株和生長條件 我院微生物室從臨床送檢標(biāo)本中分離鑒定所得金黃色葡萄球菌，選

6、取MSSA 4株，低耐MRSA 4株，高耐MRSA 7株。1株瑞士捐贈株：BB2701。 上述金黃色葡萄球菌在M-H培養(yǎng)基復(fù)蘇16 h，挑取菌落置于M-H肉湯中在37震蕩培養(yǎng)，測量D600nm，10倍稀釋10個濃度，取50 l菌液過夜孵育，選取菌落數(shù)在100300之間的稀釋倍數(shù)計算活菌數(shù)。 1.2 最低抑菌濃度（MIC）測定 以瓊脂平皿對倍稀釋法測定苯唑西林對16株菌的MIC值，以ATCC 25923為質(zhì)控株，結(jié)果判定參照CLSI2006常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。 1.3 RNA提取、純化、逆轉(zhuǎn)錄 采用RNA提取純化試劑盒（上海華舜生物工程有限公司），操作按說明書進行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16 U/

7、ml，上海生工生物工程有限公司）。測D260nm以及D260/D280，取D260/D280比值>1.8者繼續(xù)下一步試驗。采用RT-PCR試劑盒（TaKaRa生物工程大連有限公司），操作按照說明書進行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42，15 min，95，2 min。 1.4 real time Q-PCR引物及方案 內(nèi)參參考文獻4-10選用組成型表達基因gyrB，目的、內(nèi)參基因引物用OLIGO 3.0設(shè)計，用BLAST檢驗引物的特異性，由TaKaRa生物工程（大連）有限公司合成，具體見表1。采用real-time Q-PCR試劑盒SYBR PrimeScript PCR kit for per

8、fect real time，TaKaRa生物工程（大連）有限公司，按說明書進行操作。步驟1預(yù)變性95 10 s；步驟2兩步法擴增95 5 s，60 20 s，40個循環(huán)；步驟3熔解曲線95 0 s，65 15 s，95 0 s。每個反應(yīng)管均設(shè)置復(fù)管，重復(fù)試驗2次。表1 熒光定量PCR引物 1.5 PCR產(chǎn)物電泳分析 配制1.5%瓊脂糖凝膠，40 V電泳120 min，觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像。 1.6 數(shù)據(jù)分析 對于每一個樣品，其濃度和熒光信號增長高于背景或達到閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct值）一一對應(yīng)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，Lightcycler配套軟件可計算出待測樣品的初始模板量。通過這些數(shù)值，我們

9、可以計算出每個樣品femA基因相對拷貝數(shù)。 2 結(jié) 果 2.1 實時熒光定量PCR檢測方法的評估 以BB270提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA10倍稀釋分別制作目的基因和內(nèi)參基因擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，2。同時得出目的基因擴增方程Y1=-3.167X1+14.92、內(nèi)參基因擴增方程Y2=-3.286X2+14.81（Y：每個PCR反應(yīng)測得的Ct值；X：原始基因拷貝數(shù)的對數(shù)值）。目的基因熔解曲線見圖3。通過設(shè)計金黃色葡萄球菌femA、gyrB基因?qū)?yīng)的特異引物，熔解曲線顯示出很清晰的熔解峰，而沒有其他的非特異產(chǎn)物，以BB270為參照，每組樣本都呈現(xiàn)出良好的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2.2 femA基因在所檢測

10、菌株中的存在情況 在所有選取的16株菌中均檢測到femA基因的表達。 2.3 femA表達水平 以BB270 femA表達水平為標(biāo)準(zhǔn)，定為100%，其他菌株femA表達水平均與之相比。金黃色葡萄球菌MIC與femA表達水平關(guān)系見表2?？梢钥闯鰂emA表達水平隨MIC水平的變化而變化。 表2 16株金黃色葡萄球菌femA表達水平 3 討 論 實時熒光定量PCR是近年來定量核酸較為準(zhǔn)確的方法，可根據(jù)樣品的循環(huán)閾值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計算機處理后可準(zhǔn)確計算出標(biāo)本內(nèi)核酸的起始濃度。SYBR Green 是一種只與雙鏈DNA結(jié)合的染料，當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合時，發(fā)出熒光，隨著PCR產(chǎn)物的增加，產(chǎn)物與SYBR

11、Green 結(jié)合的量也增大，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，整個過程要求高質(zhì)量的RNA、內(nèi)參和目的基因引物特異性、PCR擴增效率一致、重復(fù)試驗平衡差異等來保證結(jié)果的可靠性。本實驗基于SYBR Green 的實時熒光定量PCR方法用于本實驗所得結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，熔解峰單一，復(fù)管及重復(fù)試驗結(jié)果一致，證明特異性好、可信度高。 femA是MRSA耐藥表達的重要輔助基因，參與細胞壁肽聚糖五肽交聯(lián)橋2，3位甘氨酸的加入，缺失時能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對苯唑西林耐藥水平的下降2。本文檢測到所有菌株中均有femA表達，與femA涉及到金黃色葡萄球菌細胞壁肽聚

12、糖合成的功能有關(guān)。本文主要為比較不同菌株之間femA表達水平有無差異，故并未構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品，而僅以高耐菌株BB270的femA表達量為基準(zhǔn)，用實時熒光定量PCR相對定量比較了不同菌株femA表達水平高低，結(jié)果提示高耐株femA表達水平明顯高于低耐和敏感株，與預(yù)期結(jié)果一致，但檢測菌株數(shù)量較少尚不能得出統(tǒng)計學(xué)結(jié)論，有待于進一步擴大樣本量后明確。 綜上，采用熒光定量PCR方法檢測金黃色葡萄球菌femA并進行相對定量，是一種穩(wěn)定性、精確度、特異性較好的檢測方法?！緟⒖嘉墨I】 1 Berger-Bchi B, Barberis-Maino L, Strssle A, et al. femA，

13、a host-mediated factor essential for methicillin resistance in Staphylococcus aureus: molecular cloning and characterization J. Mol Gen Genet，1989，219（1-2）:263-269.2 Maidhof H, Reinicke B, Blümel P, et al. femA, which encodes a factor essential for expression of methicillin resistance, affects

14、glycine content of peptidoglycan in methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains J. J Bacteriol,1991,173(11):3507-3513.3 Hegde SS, Shrader TE. femABX family members are novel nonribosomal peptidyl transferases and important pathogen-specific drug targets J. J Biol

15、Chem,2001,276(10):6998-7003.4 Christiane G, Silvia C, Manfred G, et al. Direct quantitative transcript analysis of the agr regulation of Staphylococcus aureus during human infection in comparison to the expression pro vitro J. Infect Immunity,2000,68(3):1304-1311.5 Vandecasteele SJ, Peetermans WE, M

16、erckx R, et al. Quantification of expression of Staphylococcus epidermidis housekeeping genes with Taqman quantitative PCR during in vitro growth and under different conditions J. J Bacteriol,2001,183(24):7094-7101.6 Goerke C, Bayer MG, Wolz C. Quantification of bacterial transcripts during infectio

17、n using competitive reverse transcription-PCR (RT-PCR) and LightCycler RT-PCR J. Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(2):279-282.7 Rosato AE, Craig WA, Archer GL. Quantitation of mecA transcription in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates J. J Bacteriol,2003,185(11):3446-3452.8 Fey A, Eichler S, Flavier S, et al. Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantifi