反向遺傳學(xué)策略及其在寄生蟲研究中的應(yīng)用

1、本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載反向遺傳學(xué)策略及其在寄生蟲研究中的應(yīng)用本文從網(wǎng)絡(luò)收集而來，上傳到平臺為了幫到更多的人，如果您需要使用本文檔， 請點擊下載按鈕下載本文檔（有償下載），另外祝您生活愉快，工作順利，萬事 如意！反向遺傳學(xué)（eversegenetics是從基因的結(jié)構(gòu)出 發(fā)，認(rèn)識基因的功能的學(xué)科。在遺傳學(xué)的雜交分析時 代，人們從生物體的性狀改變來認(rèn)識基因，稱為正向 遺傳學(xué)（orwa_dgenetics隨著人們對基因的研究和認(rèn) 識的深入， 如今更多情況下是運用物理和化學(xué)的原理 以及計算機

2、技術(shù)和實驗技術(shù)直接剖析基因的物質(zhì)結(jié) 構(gòu)，在分子水平上揭示基因的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)人類基 因組計劃（humangenomeprojectHGP完成，并進入后 基因組時代之后，大量已測序基因的功能有待進一步 闡明。因此，運用與發(fā)展分析基因功能的反向遺傳學(xué) 的方法和技術(shù)已日漸成為生物研究領(lǐng)域的熱點。1反向遺傳學(xué)策略正向遺傳學(xué)的思路是從表型開始，確定相關(guān)的基 因;而反向遺傳學(xué)正好相反，是從一個新基因開始，希 望確定相關(guān)的表型。一旦基因序列得到確定，接下來就是闡明其功能。 判定未知基因的功能可以通過計算機分析和實驗研 究。計算機分本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)

3、收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載析基因功能最有力的工具之一是同源性 檢索(homologysearch),同源性檢索可提供整個基因或 基因片段的功能信息。但同源性檢索并不能確定所有 新基因功能，需要用實驗方法來補充和擴展同源性檢 索的結(jié)果，這才是基因功能研究中最大的問題。傳統(tǒng)研究的基本原則是通過確定突變體中的失活 基因來確定對應(yīng)于表型的基因。如果從基因而不是表 型出發(fā)，那么相應(yīng)的策略就是進行基因突變，確定該 基因所導(dǎo)致的表型改變，這就是用于確定未知基因功 能的實驗技術(shù)基礎(chǔ)。下面是實驗室中常用的幾種反向 遺傳學(xué)方法。通過滅活基因確定未知基因功能采用實驗技術(shù)在分子水平上滅

4、活特定基因，然后 從整體上觀察表型改變，可以推測相應(yīng)基因的功能。 滅活特定基因的方法有以下幾種。基因敲除(geneknockout)早期，人們用基因敲除將一個結(jié)構(gòu)已知但功能未 知的基因剔除，或用其他順序相近基因取代，然后從 表型改變推測相應(yīng)基因的功能。比如Mota等通過基因敲除技術(shù)研究TRAP基因在伯氏與約氏瘧原蟲中的 功能及其差異。 傳統(tǒng)的基因敲除方法雖然可以確定一 些基因的功能，但存在技術(shù)要求高、操作過程煩瑣、 花費大等方面的弱點，本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載在一定程度上限制了它的廣

5、泛 應(yīng)用。反義RNA(antisenseRNA)反義RNA作為反向遺傳學(xué)的另一種方法，曾廣 泛應(yīng)用于研究基因功能， 至今在基因功能鑒定上仍發(fā) 揮著作用。Yao等利用反義RNA下調(diào)基因表達(dá)，分析 了利什曼原蟲表面蛋白水解酶的重要作用。但是用反 義RNA關(guān)閉基因表達(dá)具有作用較弱等缺點。干擾(RNAinteferenceRNAi)外源和內(nèi)源性雙鏈RNA(double-stra ndedRNA，dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)受到抑制 的現(xiàn)象稱為RNA干擾，是1998年由Fire首次發(fā)現(xiàn)并 命名的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默， 是 Sci-enee?和Nature) 評出的2002年度最重要的科技成

6、果之一， 以其簡單有效的特點正成為替代其他基因滅活方法的 重要的反向遺傳學(xué)研究工具。基因過表達(dá)(geneoverexpression)Simonet等利用此技術(shù)研究小鼠，用含有僅在肝 細(xì)胞中表達(dá)的高活性啟動子使小鼠過表達(dá)OPG(osteoprotegeii n基因，得到的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨密 度明顯高于正常小鼠，說明該基因參與骨質(zhì)合成。其 他研究基因功能的方法定點誘變(site-directedmutagenesis或體夕卜誘變(invitromutagenesis)可以用來探索基因的具體功能。使 用各種定點誘變或體外誘變可以缺失或改可合成蛋白 質(zhì)，并保留本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他

7、應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載主要活性。通過這種方法可以研究基因中 某些序列編碼的氨基酸在整個蛋白質(zhì)中所起的作用， 如可能是控制蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位或者負(fù)責(zé)蛋白質(zhì) 對化學(xué)信號的反應(yīng)等；利用定點誘變還可以產(chǎn)生基因 的突變體比較突變體與原基因的功能差異，可進一步 認(rèn)識基因的功能。如黃長暉等通過體外定點誘變生成 抑癌基因P16的P48L和D74N突變體來研究該基因的功能5此外，基因功能的線索可以通過研究基因表達(dá)的 時間和空間來獲得。如果基因的表達(dá)限制在多細(xì)胞生 物的特定器官或組織，或者器官或組織中的某類細(xì)胞， 那么這種定位信息就可以用來

8、推測基因產(chǎn)物的一般功 能。2以RNAi為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)在寄生蟲研究中 的應(yīng)用概述RNAi作為反向遺傳學(xué)的一種方法，為后基因組 時代的基因功能分析提供了一個可靠而又快速的應(yīng)用 平臺。RNAi克服了傳統(tǒng)的基因剔除、轉(zhuǎn)基因等方法的弱點，以其快速、可靠、經(jīng)濟的特點受到越來越多 生物學(xué)家的重視。RNAi正廣泛應(yīng)用于基因功能研究。Kiehl等將在秀麗隱桿線蟲(Cae norhabditisele-ga ns肌肉和神經(jīng)組織中高度表達(dá) 的未知功能的atx-2基因和fox-1基因的雙鏈RNA分 別導(dǎo)入本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他

9、應(yīng)用文檔，如需本文，請下載L4期幼蟲體內(nèi)觸發(fā)產(chǎn)生RNAi,發(fā)現(xiàn)atx-1基因 表達(dá)被干擾后，幼蟲的下一代胚胎發(fā)育受到抑制；當(dāng)fox-基因表達(dá)受到干擾時， 成蟲的產(chǎn)卵率明顯下降。 從而得知atx-1基因和fox-1基因的表達(dá)分別與胚胎發(fā) 育和成蟲生殖有關(guān)61。Fraser和Conczy等合成了大量 與開放讀框相對應(yīng)的特異性的dsRNA以及表達(dá)這些dsRNA的細(xì)菌克隆，結(jié)合子代分析和時間推移差異干 擾 比較 顯 微 分 析(time-lapsediffere ntiali nterfere ncec ontrastmicroscopyas say)的方法，成功地在基因組水平上大規(guī)模地篩選了 功能基

10、因，證明了秀麗隱桿線蟲一號、三號染色體上 與早期胚胎細(xì)胞分裂及細(xì)胞代謝等相關(guān)基因的功能。Vayssie等在溶組織內(nèi)阿米巴中通過RNAi證明了7-微管蛋白對于微管成核作用(microtubule nu cleati on)的重要性。Levashina等用dsRNA敲除蚊蟲的一種補 體樣蛋白基因，證明了它在昆蟲與脊椎動物免疫吞噬 作用中的功能具有保守性。Blandin等用除蚊蟲的防御素基因（祝細(xì)本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載gene證明了它的功能。Bettencourt等通過注射dsRNA到c

11、ecropiapupae來沉默其Hemolin基因揭示了它對下 一代的胚胎正常生長具重要作用。分子機制Fiie等將dsRNA導(dǎo)入線蟲體內(nèi)觀察到RNA干擾 現(xiàn)象。然而將dsRNA(長-bp)導(dǎo)入到較高級的哺乳動物 培養(yǎng)細(xì)胞，出現(xiàn)的不是特異的RNA干擾，而是細(xì)胞 的基因表達(dá)全面受抑制和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象；Zamoie等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾時dsRNA被切成2125個堿基的RNA片段這種小片段的RNA也存在其他生物的RNA干擾模型中，被稱為小干擾RNA(smalli nteferi ngRNA,siRNA),RNA干擾可能正是 由siRNA誘導(dǎo)。研究表明，RNA干擾可能的機制和 過程是:外源dsRNA進入細(xì)

12、胞后， 與一些蛋白質(zhì)RNA依 賴 的RNA聚 合 酶(RNA-depe ndentRNApolymerase,RdRP等結(jié)合，在螺 旋酶等的協(xié)同下，dsRNA被大量復(fù)制；然后在一種類 似核酸酶II的RNA內(nèi)切酶Dicer作用下，dsRNA被 降解成2125nt大小的小片段dsRNA,即卩siRNA;siRNA和某些尚不確定的蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物-RNA誘導(dǎo) 沉默復(fù)合物(RNA-inducingsilencecomplex,RISC)在RISC形成過程中，已知起作用的酶蛋白有Dicer酶和AGO(argonaute蛋白家族中的AG02Dicer與AG02通 過本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、

13、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載二者都具有的PAZ結(jié)構(gòu)域(Piwi，Argo naute,Zwille/pineheadPAZ)相互作用，從而促進了RISC形成。RISC特異性地識別、結(jié)合mRNA,并且RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA,切割位點就是與siRNA中反義鏈互補的mRNA序列;被 切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而使蛋白質(zhì)合成失 去了所依賴的mRNA模板，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(post?transcriptiongenesilencingPTGS。研究 顯示，RNAi具有放大效應(yīng)，被降解的mRNA片

14、段及未被降 解的完整mRNA均可作為引物， 在RdRP作用下， 合 成更多的dsRNA,新合成的dsRNA再進入新一輪的RNAi循環(huán);在這種類似正反饋的作用方式下， 靶mRNA逐漸減少， 呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。特點與意義RNA干涉對基因功能的研究具有許多傳統(tǒng)方法 無法比擬的特點與優(yōu)勢，因此越來越受到研究者的關(guān) 注。首先，特異性地只抑制目的基因是RNAi最顯著的特征;其次，抑制基因表達(dá)的高效性與抑制效應(yīng)在細(xì) 胞之間的可傳播性也是RNAi的重要特點。當(dāng)進入后 基因組時代，人們需要大規(guī)模高通量地研究基因功能。 傳統(tǒng)的方法可能需要花費6個月的時間關(guān)閉某個基 因，RNAi技術(shù)卻可以在一周中關(guān)閉10個基因的表

15、達(dá)。 正是因為RNAi能高效特異地抑制基因表達(dá)，RNAi已逐漸成為替代其他基因功能研究方法本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載不可缺少的工 具。美國麻省理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的PhillipZamore預(yù)言：“RNAi將在哺乳動物細(xì)胞遺傳學(xué)上引起革命性的變 化。 ”3可遺傳的反向遺傳學(xué)在寄生蟲研究中的進展 最初的RNAi技術(shù)是通過注射或浸泡等方法直接 將dsRNA導(dǎo)入到線蟲的性腺或早期胚胎中，雖然觀察 到RNA干擾現(xiàn)象，產(chǎn)生表型變化，但這種變化卻不 能遺傳或遺傳效應(yīng)不強。在蠕蟲的小腸內(nèi)注入dsRNA,

16、能引起蠕蟲各部位的RNAi效應(yīng)，也能下傳一代至數(shù) 代，但只在第一代中比較穩(wěn)定。為解決RNAi效應(yīng)不可遺傳的問題，Tav-ema akis等對RNAi技術(shù)進行了改進，將目的基因靶序列以反 向重復(fù)方式插入熱激蛋白啟動子Hsp16-2的下游，然 后將其轉(zhuǎn)入宿主菌中，熱激處理后，反向重復(fù)序列(IR)在細(xì)胞內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA(hairpin-loopRNA),這種發(fā)夾樣的dsRNA進行RNA干擾，則能獲得穩(wěn)定的遺傳，即建立了可遺傳的RNAi技術(shù)f2021。改進后的RNAi技術(shù)運用了轉(zhuǎn)基因 技術(shù)，與傳統(tǒng)的RNAi相比具有明顯的優(yōu)點，除了可 以遺傳外，dsRNA可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生，使得RNA

17、i能夠 在發(fā)育特定階段出現(xiàn)，從而可以研究發(fā)育早期必需基 因在發(fā)育晚期的功能；此外，如果用細(xì)胞特異性啟動子 控制dsRNA的表達(dá)，就可以研究特定基因在不同器官 中的功能。這種可遺傳本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載和可誘導(dǎo)的基于轉(zhuǎn)基因的RNAi技術(shù)將進一步推動反向遺傳學(xué)向前發(fā)展。建立dsRNA可遺傳和可誘導(dǎo)的表達(dá)需要選擇合 適的可誘導(dǎo)啟動子。常用的啟動子如熱激蛋白啟動子(heatshockprotein,Hsp直接作用較弱且短暫，并且在生 物體生長過程可能產(chǎn)生不必要的作用。為避免此類問 題發(fā)生，

18、Kennerdell和Ca thew用GAL4/UAS二分系 統(tǒng)控制dsRNA在果蠅中的表達(dá)，實現(xiàn)了穩(wěn)定的誘導(dǎo)性 或細(xì)胞特異性控制RNAi的發(fā)生。他們的做法是將目 的基因與UAS相連轉(zhuǎn)入一果蠅體內(nèi)，熱激啟動子或其 他組織和階段特異性啟動子與GAL4連接轉(zhuǎn)入另外一 只果蠅，當(dāng)二者作為親本雜交后，產(chǎn)生的后代體內(nèi)可 以通過GAL4/UAS系統(tǒng)激活目的基因，出現(xiàn)相應(yīng)的表 型。在構(gòu)建dsRNA的反向重復(fù)序列中插入短的內(nèi)含子 序列就可以進一步提高RNA干擾作用的效率。同樣， 在GAL4/UAS系統(tǒng)的基礎(chǔ)上建立的可誘導(dǎo)可遺傳的dsRNA表達(dá)策略也可運用于蚊蟲及其他寄生蟲基因 功能的研宄。在蚊蟲的可遺傳RNA

19、i可選用Vg(vitel-Iogenin)啟 動子。Vg基因可以啟動蚊防御素(dfi-frnsins)的表達(dá)。Vg基因的上游包含3個調(diào)節(jié)區(qū)域：近側(cè)區(qū)(121/-619)負(fù)責(zé)低水平的組織和階段特異性的表達(dá)，中間區(qū) (619/-1071)負(fù)責(zé)Vg表達(dá)的階段特異性激素的增強， 遠(yuǎn)側(cè)區(qū)(-1071/-2015)對Vg高水平表本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載達(dá)是不可缺少的。布氏錐蟲的RNAi效應(yīng)持續(xù)時間較短，不能傳遞 到子代細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)主要因為dsRNA在布氏錐蟲易 被降解所致，降解dsRNA的酶對

20、轉(zhuǎn)基因寄生蟲保持穩(wěn) 定的RNAi效應(yīng)至關(guān)重要。對于布氏錐蟲的可遺傳的 反向遺傳學(xué)研究已經(jīng)構(gòu)建了兩種RNAi載體:一種是采 用四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子載體將反向重復(fù)的基因序列插 入到啟動子的下游，生成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA,需要三 步克隆構(gòu)建載體；另一種是利用四環(huán)素誘導(dǎo)的一對反 向的T7RNA聚合酶啟動子載體在兩啟動子中間插入 目的基因序列，然后在體內(nèi)產(chǎn)生dsRNA,僅需一步克隆。因此，雙T7啟動子系統(tǒng)適用于大規(guī)?；蚬δ?分析。4常用于反向遺傳學(xué)的模式生物通過了解較為簡單的模式生物(modelorga n-ism)的基因組，可為哺乳動物和人類的基因功能鑒定提供 線索；并且可以通過從簡單的基因組分析入

21、手建立技術(shù)、積累經(jīng)驗。秀麗隱桿線蟲1998年由Fire命名的RNAi正是在秀麗隱桿線蟲 中發(fā)現(xiàn)的。這種線蟲已成為生物學(xué)中一個非常重要的 模式生物。此線蟲所有的基因序列已知，適合于反向 遺傳學(xué)研究，許多實驗室選擇它作為研究和發(fā)展反向 遺傳學(xué)技術(shù)的材料。 目前，本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載用RNAi技術(shù)分析這種線 蟲全部19000個基因的研究正在進行中。此外，秀麗 隱桿線蟲基因組功能分析也弄清了許多保守的生物過 程和分子途徑。而且，從秀麗隱桿線蟲到人類的進化 保守性十分明顯，其許多已知基因都

22、與人類基因有明顯的配對，其中包括與人類疾病有關(guān)的基因。布氏錐蟲學(xué)實驗的寄生蟲。Ngo等用a彳微管蛋白dsRNA使 布氏錐蟲的細(xì)胞微管蛋白mRNA表達(dá)下調(diào)，從而使表 型發(fā)生改變。Bastin等構(gòu)建了一種可誘導(dǎo)反向表達(dá)副 鞭毛桿蛋白(paraflagellarrodproteinPFRA)的錐蟲細(xì)胞 系snl-2。通過誘導(dǎo)，PFRA基因的dsRNA表達(dá)，PFRA蛋白迅速消失，使副鞭毛的構(gòu)造也受到影響，導(dǎo)致細(xì) 胞不能運動。Wang等用RNAi研究布氏錐蟲的拓?fù)洚?構(gòu)酶II的功能，發(fā)現(xiàn)它在線粒體DNA的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié) 中起重要作用31。在錐蟲中已用RNAi抑制了許多mRNA的表達(dá)，然而大約一半的實驗研究中

23、，雖然下 調(diào)了表達(dá)，表型并沒有發(fā)生改變，可能因為有一些具 有抵抗性的細(xì)胞通過重組取消了插入的反向重復(fù)序列的作用，使細(xì)胞中總有剩余的mRNA,基因合成的產(chǎn)物 并未完全消失。盡管如此，RNAi已為布氏錐蟲的反 向遺傳學(xué)研究提供了一個新穎有力的工具，并將繼續(xù) 進行下去。弓形蟲弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。與其他多數(shù) 寄生蟲本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載相比，弓形蟲是一種在實驗室中易于操作加工 的生物，它具有高效轉(zhuǎn)化性，易繁殖，易觀察和可利 用的細(xì)胞標(biāo)記物多等特點；更重要的是，對弓形蟲的基 因組

24、研究顯示，它的部分基因與RNAi相關(guān)的重要酶 蛋白基因具有同源性，如AGOQicer和RdRp。弓形 蟲的速殖子可表達(dá)大量的AGO樣蛋白質(zhì)，這些AGO樣蛋白中也包含AGO具有的PAZ和Piwi兩個結(jié)構(gòu)域。 因此，弓形蟲可能是特別適用于RNAi的生物之一。 通過與其他原蟲生物比較發(fā)現(xiàn)，弓形蟲所具有的許多 特點決定了它是頂端復(fù)合物中一個非常好的進行反向遺傳學(xué)研究的模式生物。到目前為止，關(guān)于弓形蟲的 反向遺傳學(xué)的報道并不多，僅有Nakaar等用反義核酸 下調(diào)相應(yīng)基因；Malhotra等使用dsRNA使半胱氨酸蛋白水解酶(cysteineproteases沉默;AI-Anouti等利用RNAi抑制了尿

25、嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(uracilphos-phoribosyltransferaseUPRT的表達(dá)。有的 實驗室使用RNAi下調(diào)弓形蟲某些基因未能出現(xiàn)相應(yīng) 的表型變化，其原因是多方面的，如使用的dsRNA量 不夠大，選用的啟動子作用不夠強，等等，還有待進 一步的研究。蚊蟲蚊蟲是瘧原蟲最主要的媒介，是媒介與寄生蟲相 互作用研究的重要模式生物。近幾年來，對蚊蟲本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載本文為網(wǎng)絡(luò)收集精選范文、公文、論文、和其他應(yīng)用文檔，如需本文，請下載轉(zhuǎn)化的發(fā)展，可誘導(dǎo)的組織特異性啟動子的鑒定和蚊 基因組序列的獲得等。許多實驗室通過轉(zhuǎn)基因作用制 備各種轉(zhuǎn)基因蚊用于瘧原蟲及其他方面的研究。將蚊 蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)和傳統(tǒng)的RNAi結(jié)合起來已建立穩(wěn)定的