動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)知識(shí)大全

1、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程。轉(zhuǎn)染方法的分類(lèi)對(duì)外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括:轉(zhuǎn)移效率高,不影響細(xì)胞正常生理活動(dòng),低毒性,容易使用,重復(fù)性好,易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子.根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可劃分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理轉(zhuǎn)染法兩大類(lèi).一、化學(xué)轉(zhuǎn)染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE葡聚是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一, DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚物,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取,用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時(shí)表達(dá)的研究,但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。2.磷酸鈣法磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法,因?yàn)樵噭┮兹〉?價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)

2、定轉(zhuǎn)染的研究,先將DNA 和氯化鈣混合,然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀,最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上,通過(guò)細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過(guò)抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA 免受降解.3.人工脂質(zhì)體法人工脂質(zhì)體法采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體,具有較高的轉(zhuǎn)染效率,不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長(zhǎng)度的DNA,以及RNA和蛋白質(zhì)。此外,脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá),與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA 和RNA 轉(zhuǎn)入動(dòng)物和人的體內(nèi)用于基因治療。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物

3、,當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),隨后DNA 復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),至于DNA 是如何穿過(guò)核膜的,其機(jī)理目前還不十分清楚。二、物理方法1.顯微注射顯微注射雖然費(fèi)力,但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。2.電穿孔這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來(lái)轉(zhuǎn)染如植物園生智體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)系。3.基因槍法基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體內(nèi)的細(xì)胞。如何提高轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功率【組織培養(yǎng)試劑】一般

4、提示:優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如,RPMI 1640和DMEM。培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,葡萄糖,維生素,無(wú)機(jī)鹽和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,因此如果不在使用時(shí)新鮮加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì),如HEPES,當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。酚紅試劑可保護(hù)細(xì)胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生的毒性效應(yīng),但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用場(chǎng)合下,如熒光素酶的測(cè)定,細(xì)胞毒性則仍然是一個(gè)問(wèn)題。胎牛血清血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)

5、抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學(xué)變異的影響。添加劑某些細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于一些對(duì)生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)(如,生長(zhǎng)因子,微量元素,必需代謝物和蛋白等。CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞生長(zhǎng)所需環(huán)境為37、相對(duì)濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細(xì)胞生理對(duì)pH的變化非常敏感,因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2濃度為5%來(lái)有效控制pH 值,而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對(duì)一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2

6、則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異性。來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì),或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理?！炯?xì)胞】一般提示:密切觀察您的細(xì)胞;確保它們狀態(tài)良好。在開(kāi)始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前,先制定一個(gè)適當(dāng)?shù)姆N板方案,使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開(kāi)始到結(jié)束都保持最佳狀態(tài)。增加成功幾率細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵元素,它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于生長(zhǎng)過(guò)度的狀態(tài)。由于FuGENE® 6和HD轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于細(xì)胞作用溫和,可同時(shí)進(jìn)行

7、貼壁細(xì)胞的種板和轉(zhuǎn)染。此外,還常用促有絲分裂刺激物(如,病毒轉(zhuǎn)化,生長(zhǎng)因子,條件培養(yǎng)基,以及滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細(xì)胞(如HL 60,Jurkat非常難以轉(zhuǎn)染;相反,天生為貼壁的細(xì)胞(如HEK,CHO則可適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)的條件。那些天然懸浮的和那些適應(yīng)懸浮的細(xì)胞的漿膜是不一樣的。據(jù)推測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一個(gè)限制步驟就是通過(guò)內(nèi)吞作用攝取轉(zhuǎn)染分子(DNA 或RNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物;然而,目前對(duì)此尚未有分子水平上的合理機(jī)制的解釋。細(xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異可能是某些細(xì)胞類(lèi)型天生難以轉(zhuǎn)染的部分原因。所以,尋找更有效轉(zhuǎn)染試劑的工作

8、目前還主要是經(jīng)驗(yàn)性的,尤其對(duì)于那些天生為懸浮的細(xì)胞而言更是如此。這常常是在不含血清而含有抑制轉(zhuǎn)染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后,這些細(xì)胞可適應(yīng)于在沒(méi)有添加劑的環(huán)境中懸浮生長(zhǎng)。如果這些適應(yīng)于懸浮生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞在沒(méi)有這些添加劑的環(huán)境中生長(zhǎng),那么它們就可以被轉(zhuǎn)染。分批方案在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分批傳代培養(yǎng)之前,必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同(如,胰蛋白酶消化時(shí)間的延長(zhǎng),胰蛋白酶的失活,以及消化后直到轉(zhuǎn)染開(kāi)始的時(shí)間都可能對(duì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)有所影響。如果在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞過(guò)于密集,那么種到培養(yǎng)板上的就會(huì)是細(xì)胞團(tuán)塊而非單個(gè)細(xì)胞。對(duì)于某些細(xì)

9、胞/試劑組合而言,漿膜狀態(tài)被改變后有可能會(huì)影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。傳代次數(shù)傳代次數(shù)是指對(duì)一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)。在某些情況下,自建立細(xì)胞系起的確切傳代次數(shù)無(wú)法得知。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定,可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而改變,視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。培養(yǎng)條件的不同可引起克隆選擇。因此名稱(chēng)相同的同一細(xì)胞系有關(guān)其生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力性質(zhì)可能會(huì)有很大的差異。一般而言,細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。在不同細(xì)胞系之間轉(zhuǎn)染效率的變化很大。某些細(xì)胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率,而其他一些則傳代很

10、少次數(shù)就表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率的差異。細(xì)胞數(shù)量(匯聚度只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿尚有空間,細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對(duì)于正常細(xì)胞而言,細(xì)胞生長(zhǎng)的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(接觸抑制,但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)并可互相疊加。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞會(huì)因受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及它們隨后直到細(xì)胞溶解之前的生長(zhǎng)情況相關(guān)。培養(yǎng)物污染培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類(lèi)所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。支原體污染支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%,它可改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性,酶的作用途

11、徑,細(xì)胞膜的組成,染色體結(jié)構(gòu),以及轉(zhuǎn)染效率。特別是,支原體對(duì)采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾,其結(jié)果致使轉(zhuǎn)染效率偏低或非典型。這些效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同,支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺(jué)檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數(shù)的無(wú)菌濾膜;它們還對(duì)常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。交叉污染如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類(lèi)的細(xì)胞,那就有可能發(fā)生交叉污染,即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種,幾個(gè)月過(guò)后它們

12、就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的;而您可能甚至還未發(fā)現(xiàn)。建立細(xì)胞系鑒定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。例如,對(duì)于人類(lèi)細(xì)胞系而言,STR (短串聯(lián)重復(fù)序列圖譜就是一種可靠的鑒定方法。或者更簡(jiǎn)單的解決方案就是,當(dāng)懷疑有交叉污染時(shí),如果有可能,就換用新鮮的,傳代次數(shù)少的細(xì)胞源。【載體DNA】一般提示:對(duì)您純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在對(duì)您細(xì)胞體系的參數(shù)進(jìn)行測(cè)定時(shí),一定要選用一種您已知具有功能的對(duì)照載體。載體的完整性種載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解,以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程

13、中的物理壓力的影響。載體制備物-各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl,內(nèi)毒素可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如,RSV,CMV,和SV40的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而,病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如,在某些細(xì)胞系中,由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增,SV40體系可高效表達(dá)large T抗原(如,COS;而在其他許多細(xì)胞系中,則是CMV啟動(dòng)子更為有效。除此之外,各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異,這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的?！巨D(zhuǎn)染方案】一

14、般提示:建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開(kāi)始,然后通過(guò)改變?cè)噭?DNA的配比和形成復(fù)合物的數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比,離子強(qiáng)度,緩沖液pH值,以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)粒既可在無(wú)菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑,就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。需要對(duì)試劑提供方給予一定的信賴(lài);除非您有很好的理由支持您做出改變,否則就應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照他們所推薦的轉(zhuǎn)染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清,它就會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié),

15、對(duì)于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)最為有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳配比往往會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間和金錢(qián)。除了配比的重要性之外,所加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的多少也非常關(guān)鍵。形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑對(duì)于多數(shù)試劑而言,很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。復(fù)合物數(shù)量對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用的轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物的量也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行優(yōu)化。如果用量太少,那么轉(zhuǎn)染DNA的表達(dá)就太弱;如果用量太多,則可能由于細(xì)胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達(dá)。最佳用量

16、通常都必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。所需要的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量與所用細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞越少,所需復(fù)合物就越少。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入有兩種替換方法可用來(lái)漿轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞:1. 將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基,或者 2. 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋,然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡(jiǎn)便,而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性,所以會(huì)使結(jié)果的一致性更好。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染過(guò)程中所使用的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)有正面或負(fù)面的影響。甚至對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方而言也是如此,尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會(huì)使多種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率降低。某些公司還提供可與轉(zhuǎn)染試劑配合使用的優(yōu)化無(wú)血清轉(zhuǎn)染培

17、養(yǎng)基。而由羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑則無(wú)論是否存在血清都能有效轉(zhuǎn)染。FuGENE® H D是獨(dú)一無(wú)二的能夠轉(zhuǎn)染保存在100%血清中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。如果有抗生素(如,青霉素、鏈霉素、或兩性霉素B存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞,則轉(zhuǎn)染有效性會(huì)降低至25%。因此,對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基。【時(shí)間進(jìn)度】一般提示:要確保最終結(jié)果的成功;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目標(biāo)蛋白能得到最佳表達(dá)。轉(zhuǎn)染的開(kāi)始在轉(zhuǎn)染前12小時(shí),將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染開(kāi)始時(shí),培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)有約50-80%匯聚,這樣就可以使它們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100%的匯聚。如果在轉(zhuǎn)染中去掉血清,

18、細(xì)胞可能會(huì)暫時(shí)停止生長(zhǎng)。細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后,就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長(zhǎng)。培養(yǎng)基更換某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒(méi)有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行,那么這一步驟就必不可少。至于可在血清存在的情況下使用的無(wú)毒性轉(zhuǎn)染試劑(如,FuGENE® 6 轉(zhuǎn)染試劑或FuGENE®HD 轉(zhuǎn)染試劑時(shí),如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段,就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在細(xì)胞中直到進(jìn)行檢測(cè),那么對(duì)有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高,而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開(kāi)始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/

19、DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除,但在此后的長(zhǎng)期生長(zhǎng)階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長(zhǎng)3-7天,換培養(yǎng)基就尤其重要,這樣一來(lái)就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量?！居醒鍟r(shí)的轉(zhuǎn)染】血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,但只要在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清,在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染過(guò)程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液:在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物準(zhǔn)備過(guò)程以及復(fù)合物同細(xì)胞接觸過(guò)程。在開(kāi)始準(zhǔn)備DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無(wú)血清的培養(yǎng)基,因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。但在復(fù)合物形成后,在加入細(xì)胞中前可以加入血清。陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)

20、有所不同,因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用OPTI-MEM培養(yǎng)基,一種營(yíng)養(yǎng)豐富的無(wú)血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用LIPOFECTAMINE 2000?！九囵B(yǎng)基中的抗生素】抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。

21、這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外,為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量?！炯?xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變】可以通過(guò)常規(guī)的次培養(yǎng)步驟保持轉(zhuǎn)染鋪板前的細(xì)胞健康。每周傳代一到兩次,稀釋程度使得下次傳代前細(xì)胞幾乎融合。不要使細(xì)胞保持融合超過(guò)24小時(shí)。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種

22、變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒(méi)有降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果?；蛘?幾種來(lái)源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。【細(xì)胞鋪板密度】用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿(mǎn)或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板

23、細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的,CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說(shuō)明,對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的最佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。【啟動(dòng)子的選擇】獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴(lài)于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒相比,在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系,如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurka

24、t細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7時(shí)會(huì)提高,因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。【DNA量】高質(zhì)量的DNA對(duì)于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染,但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。其他的質(zhì)粒純化技術(shù)如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用獨(dú)特的陰離子交換樹(shù)脂純化DNA,可以得到用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量DNA。另外, Marligen的純化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟很簡(jiǎn)單,可以在2小時(shí)內(nèi)完成。【瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)

25、】DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測(cè)到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi),大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋;一周后就檢測(cè)不到其存在了。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。因此,表達(dá)水平與位置無(wú)關(guān),不會(huì)受到周?chē)旧w元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少,但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大,實(shí)驗(yàn)必須很小心。為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá),轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時(shí)就會(huì)如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,加入的DNA通過(guò)重組整合到基因組上。包含

26、整合DNA的細(xì)胞很少,必須通過(guò)對(duì)藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過(guò)表型變化進(jìn)行鑒定。穩(wěn)定基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)需要數(shù)周,如果需要驗(yàn)證蛋白產(chǎn)量,所需的時(shí)間更長(zhǎng)。但得到的細(xì)胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來(lái)源或用于得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?！舅矔r(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測(cè)】基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠?bào)告基因來(lái)確定優(yōu)化條件,其表達(dá)蛋白易檢測(cè),在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT,綠色熒光蛋白(GFP,熒光素酶(Lux或Luc以及b- 半乳糖苷酶(b-gal?？梢允褂煤?jiǎn)單的非同位素方法檢測(cè)b-gal的表達(dá)以測(cè)定轉(zhuǎn)染

27、效率和活性。pCMV-SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ 基因,轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步驟,可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法?！痉€(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選】連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH或neor可以合成APH酶,通過(guò)磷酸化使藥物失活,從而提供對(duì)GENETCIN選擇性抗生素(G418 Sulfate的抗性。抗生素抗性基因可以與目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上,也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染,兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對(duì)于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染,

28、帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會(huì)提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如,使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細(xì)胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨(dú)使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析,在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞,低密度鋪板,給予生長(zhǎng)空間,在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后,在開(kāi)始篩選前等待48-72小時(shí),使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,保證在開(kāi)始篩選時(shí)可

29、以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基,加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基,抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定,足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度,包括細(xì)胞類(lèi)型,培養(yǎng)基和血清濃度等,所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線,確定最佳濃度(參見(jiàn)第7章實(shí)驗(yàn)步驟。篩選最多可能需要一周時(shí)間,因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN抗生素存在條件下,細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的抗生素,一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?可以分別純化(克隆,收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)?！镜鞍妆磉_(dá)和培養(yǎng)基的

30、選擇】哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的,翻譯后修飾的蛋白,比細(xì)菌,真菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白,而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá),迅速地合成小量蛋白。常用的細(xì)胞系包括CHO,293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F,293-H, COS-7和CHO-S細(xì)胞,來(lái)源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無(wú)血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長(zhǎng)到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但

31、更傾向于使用無(wú)血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白,因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無(wú)血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)化并有幾類(lèi)無(wú)血清培養(yǎng)基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養(yǎng)基低得多。無(wú)蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適合您應(yīng)用的一種。在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基,無(wú)蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S,對(duì)于已適應(yīng)無(wú)血清或無(wú)蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞,可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無(wú)血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)

32、染的成分。在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEM等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體N-1-2,3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物1:1(w/w。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找

33、出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等,對(duì)每批LR都要做:第一,先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間,DNA可從15g和孵育時(shí)間6小時(shí)開(kāi)始,按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者最佳的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(2 24小時(shí)。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過(guò)24小時(shí)為宜。細(xì)胞種類(lèi):COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat 等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。1、操作步驟方法一:(1:取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿,向每孔中加入2mL 含12×105個(gè)液,37CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時(shí)(匯合過(guò)分,轉(zhuǎn)染后不

34、利篩選細(xì)胞。(2轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10g DNA,終量100L,B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50gLR,終量100L,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過(guò)高所致,應(yīng)酌情減量。(3轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入1mL 不含血清培養(yǎng)液。(4轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37溫箱置624小時(shí),吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(5其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。注意:轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清,血清對(duì)轉(zhuǎn)

35、染效率有很大影響。2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下方法二:(1以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24小時(shí),使其達(dá)到5060%板底面積。(2在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下:在1mL無(wú)血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn)。室溫下放置510分鐘,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。(3棄去細(xì)胞中的舊液,用1mL無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物,37培養(yǎng)35小時(shí)。(4再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)1424小時(shí),(5吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%

36、FCS的DMEM,2mL/孔,再培養(yǎng)2448小時(shí)。(6用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,以備分析鑒定。穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下:(1接種細(xì)胞同前,細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。(2DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2、(3步驟。(3在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37培養(yǎng)48小時(shí)。(4吸出DMEM,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間,篩選轉(zhuǎn)染克隆,方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要注意的一些事項(xiàng)DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測(cè)到僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi),大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降

37、解或隨細(xì)胞分裂而稀釋;一周后就檢測(cè)不到其存在了。因此轉(zhuǎn)染也可以分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient transfection指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上,結(jié)果是短暫的高水平表達(dá),可在2496小時(shí)內(nèi)檢測(cè)表達(dá)效果,表達(dá)水平與位置無(wú)關(guān),不會(huì)受到周?chē)旧w元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少,但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大,不長(zhǎng)久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)適合研究啟動(dòng)子等調(diào)控元件不過(guò),誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子除外。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上,或者相當(dāng)于附加子(episome可持續(xù)存在,使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可長(zhǎng)期表達(dá)。外源

38、基因整合的幾率很小,要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,通常需要有篩選標(biāo)記(比如抗性基因共同轉(zhuǎn)染,通過(guò)選擇壓力維持表達(dá)的穩(wěn)定不行的統(tǒng)統(tǒng)槍斃了。質(zhì)粒整合到染色體上本來(lái)就是件稀罕事兒,平均萬(wàn)分之一的幾率,如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染,那整合的幾率就高多了。不過(guò)怎么整合也就是一個(gè)或者有限的幾個(gè)拷貝,所以表達(dá)量往往比較不高的。但是,“壓倒一切的是'穩(wěn)定'”,很多時(shí)候,轉(zhuǎn)染后往往要進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的篩選。成功轉(zhuǎn)染第一步:細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)細(xì)胞系的選擇通常不是我們說(shuō)了算的。有時(shí)是實(shí)驗(yàn)的需要,有時(shí)是實(shí)驗(yàn)室條件的限制。如果有選擇的余地當(dāng)然挑個(gè)容易做的。越是接近體內(nèi)的真實(shí)情況的原代細(xì)胞,通常越是難于伺候。反之亦然。此外

39、細(xì)胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時(shí)需要根據(jù)細(xì)胞系來(lái)選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時(shí)一些啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮的因素,姑且不論。不過(guò)因?yàn)槭芟抻谔囟ǖ募?xì)胞,如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因?yàn)椴煌募?xì)胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了全套方法,照做可也。如果是個(gè)新來(lái)的細(xì)胞株,最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),看看其中是否有你的新對(duì)手這個(gè)FuGENE 6 比較有優(yōu)勢(shì),已有750多種細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到轉(zhuǎn)染這一步時(shí)需要注意的因素有哪些呢?一、健康而茁壯成長(zhǎng)的細(xì)

40、胞轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過(guò)12次傳代,以保證細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,容易轉(zhuǎn)染。注意,貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到幾乎匯片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一次傳代,千萬(wàn)不要使細(xì)胞保持融合超過(guò)24小時(shí)。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代不會(huì)馬上降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。二、恰到好處的鋪板密度轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)

41、染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑,要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同,即使同一種試劑,也會(huì)因不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法,包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為40%-80%,但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù),有的要求細(xì)胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%80%之間,總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染,以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不同的

42、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度,比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因,就需要較低的鋪板密度,所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。三、溫暖舒適的培養(yǎng)基健康的細(xì)胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞類(lèi)型有不同的特性,需要特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充添加劑等等。血清血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染,對(duì)于某些對(duì)血清要求敏感的細(xì)胞來(lái)說(shuō)是個(gè)難題。不過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天,對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō),血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,比如FuGENE6、Effectene和GeneJu

43、ice等。對(duì)于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō),血清的存在會(huì)影響DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了,在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的Lipofectamine2000, FuGENE 6,GeneJuice,Effectene,Polyfect等等。最厲害的是Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品,Polyfect和Effectene,全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來(lái)操作,包括稀釋步驟,不用擔(dān)心培養(yǎng)基的變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有什么不良影響了。這樣,就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細(xì)胞,

44、也就減少操作的復(fù)雜程度,更重要的是不必再讓細(xì)胞處于無(wú)血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染,不必?fù)?dān)心對(duì)血清缺乏很敏感的細(xì)胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細(xì)胞們,你們有福了。不過(guò)要特別注意:對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助?？股刂гw、細(xì)菌、真菌污染,無(wú)論對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都可能會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果,細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)添加抗生素來(lái)防止污染。但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素,就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可

45、能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡,造成轉(zhuǎn)染效率低。所以,對(duì)于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)驗(yàn),要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外,為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。這里又要表?yè)P(yáng)Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品,Polyfect 和Effectene,因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來(lái)操作,很方便的。對(duì)于篩選穩(wěn)定表達(dá)株,要預(yù)留足夠的時(shí)間讓

46、抗性基因表達(dá)后再添加篩選壓力。其他添加物如抗生素,EDTA,檸檬酸鹽,磷酸鹽,RPMI,硫酸軟骨素,透明質(zhì)酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會(huì)干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物的過(guò)程,要盡量避免。一、質(zhì)粒的構(gòu)建:啟動(dòng)子的選擇啟動(dòng)子的選擇對(duì)于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對(duì)于轉(zhuǎn)染過(guò)程本身雖然無(wú)甚影響,但是對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。啟動(dòng)子可分為2大類(lèi):誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是比較精明的,平時(shí)歇著,一旦接到誘導(dǎo)信號(hào)指示就馬上開(kāi)工干活兒。而組成型啟動(dòng)子比較老實(shí)的,就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種比如我們很熟悉的CMV啟動(dòng)子,SV40,pMC1,PGK 啟動(dòng)子等等。獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子

47、依賴(lài)于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中可以獲得高表達(dá)活性。在BHK-21中,CMV啟動(dòng)子活性比其他啟動(dòng)子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動(dòng)子在T 細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系,如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有T抗原(存在于COS-1和COS-7時(shí)會(huì)提高,因?yàn)門(mén)抗原可以刺激染色體外的合成。一個(gè)強(qiáng)悍的高表達(dá)組成型啟動(dòng)子是我們做表達(dá)所求之不得的,但是對(duì)于轉(zhuǎn)染本身來(lái)說(shuō)卻不一定好因?yàn)槿魏纬掷m(xù)過(guò)高表達(dá)外源基因都

48、可能帶來(lái)某種程度的細(xì)胞毒性,影響細(xì)胞生長(zhǎng)如果外源基因本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒,那更完蛋了,你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株,更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了因?yàn)檫^(guò)量表達(dá)本身可能已經(jīng)害死了那個(gè)轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞,沒(méi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又死于篩選壓力。這種時(shí)候一個(gè)不那么“能干”的啟動(dòng)子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例,會(huì)不會(huì)是這個(gè)原因呢?過(guò)猶不及就是這個(gè)道理咯。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō),特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達(dá)可以受到我們的調(diào)控轉(zhuǎn)染的時(shí)候不表達(dá),篩選穩(wěn)定表達(dá)株后再誘導(dǎo)表達(dá),使得表達(dá)有毒性的基因或者精確分析表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在接受某種信號(hào)后“打開(kāi)開(kāi)關(guān)”開(kāi)始工作,也有的相反,在缺失某種信號(hào)后打開(kāi)開(kāi)關(guān)。Clontech還有個(gè)誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴(lài)的”,就是說(shuō)不單表達(dá)開(kāi)關(guān)可控,表達(dá)量多少也可以通過(guò)誘導(dǎo)劑的量來(lái)調(diào)控。還有一種特殊的啟動(dòng)子很好玩具有時(shí)序性或者組織特異性(空間特異性,會(huì)受到特定的元件調(diào)控,在一定的時(shí)間或者特定組織細(xì)胞中表達(dá)的,比如那個(gè)轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子有人說(shuō)這是組成型的,我覺(jué)得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,只不過(guò)誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了,這類(lèi)啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞中會(huì)有不同的表現(xiàn),需要注意。誘導(dǎo)系