快速石蠟包埋組織切片的制備

1、快速石蠟包埋組織切片的制備煮沸固定切片法1.固定：切取大小適宜（厚度<2mm的組織塊，盡快置入裝有58ml 10刈 性4%甲醛的試管中煮沸1min,然后已入冷水中。2脫水（1）將已經(jīng)煮沸固定的組織塊取出，用刀片將其厚度修切至<1.5mni隨即置入盛有 58 ml 丙酮的試管中，煮沸 2 min ，然后將丙酮傾棄。（2）再向該試管中重新加入58 ml丙酮并煮沸2min。如此重復(fù)34次。3浸蠟：將已經(jīng)丙酮脫水的組織塊由試管中取出，用吸水紙去除其表面液體， 隨即置入7580熔化的石蠟中，待組織塊下沉、 不再出現(xiàn)氣泡時(shí) （約需30s） ，即可包埋。4包埋、切片和染色。（ 1）用熱鑷子將預(yù)制

2、的蠟塊表面熔化，埋入已經(jīng)浸蠟的組織塊。（ 2）待埋入組織塊的蠟塊表面凝固后，即用載玻片輕壓蠟塊表面片刻，使蠟塊表面平整。（ 3）將蠟塊置入冰水中，使其變硬。（ 4）迅速切片，裱片后用吸水紙去除載玻片上的水分。（ 5）將載玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。（6）迅速進(jìn)行HE染色。5注意事項(xiàng)（ 1） 為了盡量縮短制片時(shí)間， 必須預(yù)先作好有關(guān)準(zhǔn)備工作， 備齊取材用具、試管、固定液、丙酮、酒精燈、火柴（或其他引火器） 、包埋用蠟塊、載玻片和染色試劑等，放在固定部位待用。（ 2）全部制片過(guò)程一般在2025min 內(nèi)完成。（ 3）制片后剩余組織塊應(yīng)作常規(guī)石蠟包埋切片染色，進(jìn)一步診斷。（ 4）含脂肪較多的組織

3、，須經(jīng)多次丙酮處理。（ 5） 用于組織固定、 脫水、 透明的試劑和浸蠟用的石蠟應(yīng)及時(shí)過(guò)濾、 更換。（ 6）丙酮、乙醇、二甲苯等為易燃物，進(jìn)行上述各項(xiàng)流程時(shí)，2m距離內(nèi)不得存在明火。加溫脫水和浸蠟過(guò)程必須應(yīng)用隔水溫箱，不得使用干烤箱操作。超聲波快速處理儀石蠟切片法（參照有關(guān)廠商的說(shuō)明書(shū)操作）。四、冷凍組織切片的制備應(yīng)用恒冷箱切片機(jī)制備切片： 是目前最適用方法。 恒冷箱切片機(jī)種類(lèi)較多，應(yīng)嚴(yán)格按有關(guān)廠商的說(shuō)明書(shū)操作。用于切片的標(biāo)本必須未曾固定。應(yīng)用開(kāi)放式冷凍切片機(jī)制備切片1二氧化碳制冷切片（ 1）將組織塊放在冷凍臺(tái)上，滴加OCTE羥甲基纖維素液于組織塊周?chē)▽?組織塊包埋） ，使固定在切片機(jī)上的切片

4、刀接近組織塊表面。（ 2）間斷開(kāi)放液態(tài)二氧化碳桶的開(kāi)關(guān)，噴凍組織塊和切片刀，使組織塊凍結(jié)和切片刀制冷。（ 3）迅速移動(dòng)切片刀進(jìn)行切片：先將組織塊修平，然后調(diào)節(jié)厚度至812小m處進(jìn)行切片。（ 4）用毛筆將切片展開(kāi)，貼附于載玻片上，稍干后，置于冷凍切片固定液中固定1min,隨即進(jìn)行HE染色。也可用毛筆將切片托入水中，再用玻璃彎針將 切片移至染色皿中進(jìn)行染色。（ 5）組織塊也可先在4%H生甲醛中煮沸固定1min,水洗后再行冷凍切片。2半導(dǎo)體致冷切片（ 1）切片刀與持刀器之間要間隔一層云母片或硬紙片。將冷刀致冷器粘在刀面上。（ 2）將組織冷凍臺(tái)安裝在半導(dǎo)體切片機(jī)上。（ 3）將冷凍臺(tái)和切片刀致冷器上的導(dǎo)

5、線連接在控制臺(tái)直流電源上（注意：正負(fù)電極不可接反） 。（ 4）連接致冷器的冷卻水管并開(kāi)始放水，然后開(kāi)啟電源；冷卻水管中的水流量不宜過(guò)大，在使用過(guò)程不得斷水。（ 5）調(diào)整冷凍溫度調(diào)節(jié)器，至切片刀和冷凍臺(tái)呈現(xiàn)霜凍。（ 6） 將新鮮組織塊或已固定的組織放在冷凍臺(tái)中央， 滴加水或OCT， 或用水調(diào)成糊狀的甲基纖維素于組織塊周?chē)▽⒔M織塊包埋） 。（ 7）待組織塊冷凍適當(dāng)后，進(jìn)行切片。（ 8）對(duì)于未經(jīng)固定的新鮮組織，用毛筆將制作滿意的切片展平，立即裱貼于蓋玻片或載玻片上， 待冷凍的切片剛要融化時(shí)， 立即將其置于冷凍切片固定液中固定1min。 對(duì)于已經(jīng)固定的組織塊， 可用毛筆將制作滿意的切片托入水中， 再

6、用玻璃彎針將切片移至染色皿中進(jìn)行染色。（ 9）切片完畢后，先關(guān)閉電源，再關(guān)閉冷卻水，待冰霜融化后擦干機(jī)器，加罩。3甲醇致冷切片（按有關(guān)廠商的儀器說(shuō)明書(shū)操作） 。4氯乙烷致冷切片（ 1）將新鮮的或已經(jīng)固定的組織塊置于支持器中央，加少許水或OCT。（ 2）連續(xù)噴射氯乙烷于組織塊上，待組織塊凍結(jié)后，改為間歇噴射，使凍結(jié)適度，立即切片。使用氯乙烷時(shí)應(yīng)注意防火、防爆。（ 3）進(jìn)行組織切片的裱貼、固定和染色（與上述方法相同） 。注意事項(xiàng)1制作冷凍切片所需的試劑和設(shè)備等應(yīng)處于隨時(shí)可供使用狀態(tài)。2 切取的組織塊大小適宜 （厚度<2mm） ， 并盡快置于冷凍組織切片機(jī)上制備切片。3調(diào)節(jié)冷凍程度，試切合適時(shí)

7、便迅速切片。冷凍不足無(wú)法切片，冷凍過(guò)度切片易碎。4冷凍切片固定液（ 1）乙醚 - 乙醇液無(wú)水乙醚 1 份95%乙醇1 份（ 2）乙醇 - 冰醋酸液95%乙醇100ml冰醋酸35滴五、脫鈣方法骨和其他鈣化組織， 通常需要脫去鈣鹽后進(jìn)行切片。 骨組織脫鈣前需先行固定。常規(guī)脫鈣法：1 .將骨組織鋸成薄片（約1x1x0.3cm）。2 . 在AF中或4%中性甲醛中固定 612h。3 將骨片置于5%硝酸（急需時(shí)可置于37溫箱）中脫鈣，至用針輕刺可入時(shí)為止，約需1224h （小塊骨組織脫鈣僅需23h）,其間可更新脫鈣液23 次。4 流水沖洗12h。5 移入5%甲明礬液，24h。6 流水沖洗23h。7 按常規(guī)

8、脫水。8石蠟包埋。電解脫鈣法：將骨片置于裝有8%硝酸和10%甲酸混合液的電泳槽（有蓋的方形玻璃標(biāo)本缸或燒杯）內(nèi)的陽(yáng)極處，6V直流電源下持續(xù)電解30min3h,至用針輕刺可入時(shí) 為止。骨髓組織脫鈣：可浸泡于苦味酸乙醇飽和液（占 85%、甲醛（占10%和冰醋酸（占5%）的混合液中（同時(shí)進(jìn)行固定和脫鈣）。注意事項(xiàng)1骨片等脫鈣組織的厚度適宜。2脫鈣組織與脫鈣液的體積比>1:30 。3脫鈣過(guò)程中應(yīng)不時(shí)搖動(dòng)，多次更換脫鈣液。4脫鈣時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)。5微波處理可加速脫鈣過(guò)程。6脫鈣后的組織必須用流水充分沖洗。7用于包埋的石蠟硬度適中（不要過(guò)軟或過(guò)硬）。六、蘇木素伊紅（HB染色HE染色是應(yīng)用最廣泛的組織病理

9、學(xué)常規(guī)染色技術(shù)。染色程序1.石蠟切片HE染色（常規(guī)HE染色）（1）二甲苯 I 5 10min（2）二甲苯H 5 10min(3)無(wú)水乙醇I 13min(4)無(wú)水乙醇H 13min(5) 95%醇 I 1 3min(6) 95%>H 1 3min(7) 7) 80%乙醇1min(8) 8)蒸餾水 1min(9) 蘇木素液染色510min(10) 10)流水洗去蘇木素液1min(11) 1%fc酸-乙醇13s(12)稍水洗12s(13)返藍(lán)(用溫水或1%t水等)510s(14)流水沖洗12min(15)蒸儲(chǔ)水洗12min(16) 0.5%R紅液染色13min(17)蒸儲(chǔ)水稍洗12s(18)

10、80%醇 1 2s(19) 95%>1 2 3min(20) 95%>H 2 3min(21)無(wú)水乙醇I 35min(22)無(wú)水乙醇H 35min(23)石炭酸-二甲苯35min(24)二甲苯 I 3 5min(25)二甲苯 H 3 5min(26)二甲苯田35min( 27)中性樹(shù)膠封固注：(12)和(13)項(xiàng)可省去，但(14)的沖水時(shí)間需延長(zhǎng)至1015min。(23)項(xiàng)可用無(wú)水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。2.冰凍切片HE染色(1)冰凍切片固定1030s(2)稍水洗12s(3)蘇木素液染色(60 C) 3060s(4)流水洗去蘇木素液510s(5) 1%鹽酸-乙醇13s(6)稍水洗

11、12min(7)返藍(lán)(用溫水或19氮水等)510s(8)流水沖洗1530s(9) 0.5%紅液染色12min(10)蒸儲(chǔ)水稍洗12min(11) 80%醇 1 2min(12) 95%醇 1 2min(13)無(wú)水乙醇I 12min(14)無(wú)水乙醇H 12min(15)石炭酸-二甲苯23min(16)二甲苯 I 2 3min(17)二甲苯 H 2 3min( 18)中性樹(shù)膠封固注：(7)和(8)項(xiàng)可省去，但(9)的沖水時(shí)間需延長(zhǎng)至1015min (細(xì) 胞核顯示更清晰)。(15)項(xiàng)可用無(wú)水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細(xì)菌

12、可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。染色注意事項(xiàng)1切片染色前，應(yīng)徹底脫蠟。2用含有升汞液體固定的組織，其切片染色前應(yīng)先脫去汞鹽：( 1)石蠟切片脫蠟至水洗( 2) Lugol 液 20min( 3)流水沖洗5min( 4) 95%乙醇10min（ 5）水洗 1min（ 6） 5%次亞硫酸鈉水溶液5min（ 7）流水沖洗5min（ 8）顯微鏡觀察除汞滿意后，轉(zhuǎn)入 HE染色3脫除福爾馬林色素（必要時(shí)）：（ 1）石蠟切片脫蠟至水洗（ 2） 1%NaOH（1m歸 80%J亨（99ml）混合液 10min（ 3）流水沖洗5min（ 4）轉(zhuǎn)入HE染色4.嚴(yán)格執(zhí)行HE染色流程，用顯微鏡控制細(xì)胞核的蘇木素染色質(zhì)量。HE染片應(yīng)著色鮮艷，紅、藍(lán)分明，對(duì)比清晰。5載玻片自二甲苯中取出后，應(yīng)立即用潔凈、光亮的蓋玻片和稠度適宜的中性樹(shù)膠濕封載玻片。 封蓋處內(nèi)無(wú)氣泡， 外無(wú)溢膠。 封片時(shí)必須進(jìn)行操作人員和 局部環(huán)境的二甲苯污染防護(hù)。不應(yīng)將組織切片烤干或風(fēng)干后再行封片。6必須在載玻片的一端牢貼標(biāo)簽。標(biāo)簽上應(yīng)印有病理科所在的醫(yī)院名稱(chēng)。標(biāo)簽上應(yīng)清楚顯示有關(guān)的病理號(hào)及其亞號(hào)； 標(biāo)簽上的病理號(hào)應(yīng)準(zhǔn)確無(wú)誤， 無(wú)涂改。7制片完成后，技術(shù)人員應(yīng)對(duì)切片與其相應(yīng)的病理學(xué)檢查記錄單或取材工作記錄單認(rèn)真進(jìn)行核對(duì)；確認(rèn)無(wú)誤后，將制備好的