反相高效液相色譜法測定重組大腸桿菌發(fā)酵液中降血壓肽的含量

1、反相高效液相色譜法測定重組大腸桿菌發(fā)酵液中降血壓肽的含量                作者：廖曉慧 孫海燕 劉冬 彭光華 張聲華【摘要】  目的建立反相高效液相色譜（RPHPLC）測定重組大腸桿菌發(fā)酵液中降血壓肽的方法，為其深入研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。方法采用Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm,5 m），Aydac保護(hù)柱，柱溫30 ，以乙腈水(2278) ，0.05%TFA為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長21

2、5 nm，參考波長350 nm，進(jìn)樣量20 l。結(jié)果該方法使降血壓肽與其它相似產(chǎn)物得到較好分離，在5250 g/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 8，最低檢測限達(dá)8 ng，低、中、高濃度下的加樣回收率、日內(nèi)、日間精密度均符合方法學(xué)要求。結(jié)論 該方法穩(wěn)定、靈敏度高、操作簡便、適用于重組降血壓肽的含量測定。 【關(guān)鍵詞】  重組大腸桿菌； 降血壓肽； 反相高效液相色譜Abstract：ObjectiveA simple and rapid reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed

3、 for the AHP in Recombinant E.coli fermentation broth.MethodsThe separation conditions were: Aydac C18 reversed phase column, Aydac guard column. Mobile phase was acetonitrilewater(2278),0.05%TFA,flow rate 1ml/min.The detection wavelength was 215nm,reference wavelength was 350 nm.Column temperature

4、was 30.Injection volume：20 l. ResultsAHP has good separation from other components in fermentation broth. And there was perfect linear correlation between 5250 g/ml, r=0.999 8. The limit of detection was 8ng. The intra-and inter-assay precisions, recovery met the methodology requirements.ConclusionT

5、his method had high precision,high accuracy and was easy-manipulated. This method proved to be suitable for AHP.Key words：Recombinant E.coli;   Antihypertensive peptide;   RP-HPLC   降血壓肽（antihypertensive peptide，AHP）是一類能夠降低人體血壓的小分子多肽。它通過抑制RAS系統(tǒng)的ACE活性而降低血壓。降血壓肽來源于天然動、植物及

6、微生物，具有降血壓效果明顯、無毒副作用等優(yōu)點。因此，已成為目前抗高血壓藥物研究的熱點之一13。   利用基因工程生產(chǎn)降血壓肽，克服了直接從動植物、微生物原料中分離提取降血壓肽篩選水解酶類的盲目性（特異性蛋白水解酶事先選定），以及純化工藝的復(fù)雜繁瑣性，而且不受原料來源的限制，生產(chǎn)周期短，下游分離純化工藝簡單，除具有高效表達(dá)外源蛋白的能力、完善的翻譯后加工機(jī)制外,還能在常規(guī)條件下進(jìn)行高密度培養(yǎng),有利于工業(yè)化生產(chǎn)。   RPHPLC的一個主要應(yīng)用領(lǐng)域就是多肽和蛋白質(zhì)的制備和分析。對于分子結(jié)構(gòu)比較簡單的多肽和某些蛋白質(zhì),在不影響產(chǎn)物的活性或產(chǎn)物在RPHPLC后很

7、容易重新折疊復(fù)性的前提下,用RPHPLC進(jìn)行純化制備是一項高效的手段。同時,RPHPLC分辨率高和重復(fù)性好的特點,使它在蛋白質(zhì)及多肽分析領(lǐng)域占據(jù)核心地位。1  器材1.1  儀器高效液相色譜儀Agilent 1100，自動進(jìn)樣器Agilent 1100，二極管陣列式檢測器Agilent 1100，系統(tǒng)控制器Agilent 1100，色譜工作站Agilent1100，均為美國Agilent公司出品；分析柱Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 m），美國Aydac公司；保護(hù)柱（guard column），美國Aydac公司；高速離心機(jī)Centrif

8、uge 5810R，德國eppendorf公司；一次性針頭式過濾器0.45 m，美國millipore公司。1.2   試劑降血壓肽標(biāo)準(zhǔn)品由上海華大天源生物科技有限公司按LysValLeuProValPro氨基酸序列合成，純度95%；發(fā)酵樣品由深圳市發(fā)酵精制重點實驗室制備；乙腈HPLC級，天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司；三氟乙酸（TFA）HPLC級，美國sigma公司。實驗用水均為18.2超純水。2  方法2.1  標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制精密稱取0.020 0 g標(biāo)準(zhǔn)品，溶于超純水中，定容至10 ml容量瓶中，即得2 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液。2.2  發(fā)

9、酵樣品的處理發(fā)酵液經(jīng)離心，收集菌體細(xì)胞，破碎，親和層析，酶切等分離、純化過程而得，經(jīng)0.45 m濾膜過濾，HPLC進(jìn)樣。2.3  色譜條件色譜柱：Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 m），Aydac保護(hù)柱；流動相：乙腈水(2278)，0.05%TFA；流速：1.0 ml/min；檢測波長：215 nm，參考波長350 nm；柱溫：30；進(jìn)樣量：20 l 。2.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取2.1項下配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋成250，100，50，20，10，5 g/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45 m濾膜過濾，20 l進(jìn)樣，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。2.

10、5  精密度實驗2.6   回收率實驗采用標(biāo)樣添加法，取100，50，20 g/ml 3個濃度的發(fā)酵液分別添加濃度為50 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)液至理論值分別為150，100，70 g/ml進(jìn)樣測定，測定峰面積，計算回收率。3  結(jié)果3.1  色譜行為考察本實驗選擇水加乙腈作流動相，TFA作陰離子對試劑，針對不同的乙腈和TFA濃度及洗脫速度對降血壓肽的洗脫峰形、分離效果進(jìn)行研究。研究表明，影響分離度的因素主次依次為乙腈濃度TFA濃度洗脫速度。從相鄰峰的分離度和縮短分析時間綜合考慮，最終優(yōu)化條件為乙腈濃度22%，TFA0.05%，洗脫速度1 ml/min

11、。AHP的保留時間為4.154.20 min之間。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖如圖12。圖1  降血壓肽標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（略）圖2  發(fā)酵樣品中的降血壓肽色譜圖（略）3.2   線性考察及最低檢測限以250，100，50，20，10，5 g/ml為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，0.45 m濾膜過濾，20 l進(jìn)樣，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。實驗表明， 5250 g/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。r=0.999 8。         圖3  降血壓肽標(biāo)準(zhǔn)曲線（略） 

12、0;  當(dāng)進(jìn)樣濃度為0.4 g/ml，S/N =3即最低檢測限為8 ng。3.3  精密度日內(nèi)、日間精密度結(jié)果如表1所示。RSD在0.0071%0.0812%之間。3.4  加樣回收率取100，50，20 g/ml 3個濃度的發(fā)酵液分別添加濃度為50 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)液至理論值分別為150，100，70 g/ml進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。3.5  樣品測定分別取3個批次的發(fā)酵液，經(jīng)樣品處理，按上述方法測定其中的降血壓肽含量，結(jié)果如表3所示。4  討論   迄今為止，日本是研究AHP最多的國家，早在20世紀(jì)80年代就對降血壓肽進(jìn)行了

13、廣泛的研究，采用各種廉價的原料蛋白開發(fā)了多種ACE抑制肽功能因子添加到食品中，取得了很好的經(jīng)濟(jì)社會效益。我國在AHP方面的研究，前景非常喜人。建立一套適宜的分離分析技術(shù)，是將降血壓肽推向商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，分離提取的效率也會直接影響到它的應(yīng)用前景。降血壓肽的分離分析甚至結(jié)構(gòu)鑒定是一項最復(fù)雜，也是最有意義的工作。表1  降血壓肽的精密度（略）表2  降血壓肽的回收率（略）表3  發(fā)酵樣品中AHP含量的測定（略）基因工程技術(shù)的發(fā)展及蛋白質(zhì)研究的不斷深入，必然需要靈敏、快速、準(zhǔn)確的分析方法的支持。肽和蛋白質(zhì)在溶液中的擴(kuò)散系數(shù)比較小，黏度大，外界溫度、介質(zhì)的pH值、有機(jī)溶劑

14、性質(zhì)等會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生變性。而RP-HPLC的溶解能力較大且RP-HPLC柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚，與其它色譜方法相比，具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢，對于肽和蛋白質(zhì)的分離分析，RP-HPLC正受到越來越多的關(guān)注46，非常適合于發(fā)酵液這種復(fù)雜體系中降血壓肽的定量分析，也為其他小分子肽類物質(zhì)的定量分析提供了有效的科學(xué)依據(jù)。并且對推動我國多肽類保健食品、藥品的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。   由于RP-HPLC較高的分辨率及獨特的選擇性，作為一種蛋白質(zhì)及多肽的分離分析手段已越來越得到人們的認(rèn)可，并用于許多新興領(lǐng)域如蛋白質(zhì)組的分析。多種聯(lián)用技術(shù)如RP-HPL

15、C質(zhì)譜、RP-HPLC毛細(xì)管電脈及RP-HPLC生物傳感器的出現(xiàn)也使得更加快速的在線分析成為可能，實現(xiàn)了對樣品各成分分子量、純度及活性等的實時分析。相信隨著對RP-HPLC分離機(jī)理研究的逐步深入、分離體系的不斷完善及各種檢測手段如質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，反相液相色譜法必將在蛋白質(zhì)及多肽研究領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Yamamoto N.Antihypertensive peptide derived from food proteins.J BiopolymersJ.1997,47:119.2 Yamamoto N,Ejiri M,Mizuno S.Biogenic peptides and their potential useJ.Curr Pham Des,2003,9:1345.3 Yoshikawa M,Fujita H,Matoba N,et al.Bioactive peptid