微生物限度檢查方法適用性驗證方案

1、微生物限度檢查方法適用性試驗方案驗證方案組織與實施微生物限度檢查方法適用性試驗工作應由質量管理部門負責組織，質量管理部門有關人員組成驗證小組，參與實施。方案起草部門/職務簽名日期質量管理部QC萬案審核部門/職務簽名日期質量管理部QC經理方案批準部門/職務批準人批準日期質量管理部質量總監(jiān)3目錄一、概述二、驗證目的和風險評估三、驗證內容四、方法判定五、再驗證周期六、參考文獻七、結果評價及結論41概述:微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括需 氧菌數、霉菌數和酵母菌數及控制菌檢查。當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行需氧菌、霉菌和酵 母菌計數方法的適

2、用性試驗和控制菌檢查方法的適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的需氧 菌、霉菌和酵母菌數的測定和控制菌檢查。依照中國藥典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法進行方法適用性試驗。2、試驗目的和風險評估：驗證目的：確認所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌計數方法及控制菌檢查方法適合我公司所生產產品的微生 物限度檢查。風險評估：項目潛在失效模式失效影響采取措施未按方案執(zhí)行試驗部分項目出現偏差和漂移直接影響試驗結果的正確性嚴格執(zhí)行經批準 的試驗方案試驗過程操作不當未達到試驗標準試驗失敗未嚴格遵循試驗方 案規(guī)定3、驗證內容：3.1、培養(yǎng)基來源:品名批號規(guī)格來源確認人：確認日期:3.2、檢查

3、用培養(yǎng)基配制方法：培養(yǎng)基名稱配制方法PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取本品14.63g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基取本品40g,加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基取本品30.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。沙氏匍萄糖液體培養(yǎng)基取本品30.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。沙氏匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基取本品65.0g，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C,15分鐘滅菌，備用。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基取本品50.0g，加水

4、1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。麥康凱液體培養(yǎng)基取本品35.0，加水1000ml，加熱溶解，分裝，121C, 15分鐘滅菌，備用。確認人：確認日期:3.3、使用儀器名稱型號校驗單位有效期至數顯電熱恒溫培養(yǎng)數顯霉菌培養(yǎng)箱確認人：確認日期:3.4、驗證試驗用菌種:菌種名稱代號傳代代數來源金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌確認人：確認日期:3.5試驗方法:取供試品10ml加PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml宀1:10供試液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控 制菌采用常規(guī)法。3.6菌液的制備：361取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌

5、、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培物一鉑金餌，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中置3035 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h，取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1ml加入9ml0.9 %無菌氯化鈉溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀釋至107,分取各菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml ,各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中置2025 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物1m

6、l加入9ml0.9 %無菌氯化鈉溶液中，制成 10-1的菌液，依法10倍稀釋至107,取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數，取小于 100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.6.3取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種子沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，20-25 C培養(yǎng)5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%無菌氯化 鈉溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀釋至107，取，取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基 25m

7、l，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液備用。3.7需氧菌、霉菌和酵母菌計數方法適用性試驗：3.7.1供試液制備：取供試品10 ml，加PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml宀1:10供試液。3.7.2實驗條件：培養(yǎng)箱：培養(yǎng)箱：需氧菌培養(yǎng)溫度： 3035C 35天霉菌和酵母菌培養(yǎng)溫度：2025C 57天3.7.3試驗方法:3.7.3.1 試驗組:3.7.3.1.1 分別取供試液9.9ml ,分別加入0.1ml濃度為1000CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯 草芽孢桿菌，混勻后取其中1ml注皿，傾注溫度不超過 45C的胰酪大豆胨

8、瓊脂培養(yǎng)基20ml，置3035C或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不超過3天，計數，每株試驗菌平行制備2個平皿。3.7.3.1.2 分別取供試液9.9ml ,分別加入0.1ml濃度為1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混勻后分別取其中1ml注皿，傾注溫度不超過 45C的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml，置3035C或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不超 過5天，計數，每株試驗菌平行制備 2個平皿。另分別取其中1ml注皿，傾注溫度不超過45C的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml，置2025C或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不超過5天，計數，每株試驗菌平行制備2個平皿。3.7.3.2 菌液對照組：分別取稀釋液 9.9ml，分別加入0.1ml濃度為1000CFU的

9、菌液，按試驗組操作，傾注溫度不超過 45C的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置與試驗組相同條件下培養(yǎng)，計數。每株試驗菌平行制備 2個平皿。3.7.3.3 供試品對照組：取供試液1ml，傾注溫度不超過 45C的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置與試驗組相同條件下培養(yǎng),計數。每株試驗菌平行制備2個平皿。3.7.4 實驗結果3.7.4.1結果判定：試驗組的菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.52范圍內。比值=試驗組菌落數供試品對照組的菌落數*對照組菌落數3.7.4.2需氧菌計數方法適用性試驗結果試驗次數：1供試品批號菌種類型試驗組菌液組供試品對照組

10、比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期:復核人：日期:試驗次數：2供試品批號菌種類型試驗組菌液組供試品對照組比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期:復核人：日期:試驗次數：3供試品批號菌種類型試驗組菌液組供試品對照組比值銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期:復核人：日期:試驗次數：13.743霉菌和酵母菌計數方法適用性試驗結果菌種類型試驗組菌液組供試品對照組比值白色念珠菌黑曲霉供試品批號檢驗人：日期:試驗次數：2復核人：日期:菌種類型試驗組菌液組供試品對照組比值白色念珠菌黑曲霉供試品批號檢驗人：日期:

11、復核人：日期試驗次數：3供試品批號：菌種類型試驗組菌液組供試品對照組比值白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期:復核人：日期3.7.5結論：檢驗人：日期：復核人：日期：3.8控制菌微生物檢測方法適用性試驗：3.8.1實驗方法：381.1試驗組：取供試液10ml及不大于100cfu大腸埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置3035C培養(yǎng)18-24小時，取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244C培養(yǎng)24-48小時。取麥康凱 液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上3035C培養(yǎng)18-72小時。試驗組應生長良好。3.8.1.2 陰性對照組：取稀釋劑10ml,加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中

12、，置3035C培養(yǎng)18-24小時，陰性對照應無菌生長。3.8.1.3陽性對照組：取不大于100cfu大腸埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置3035C培養(yǎng)18-24小時，取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244C培養(yǎng)24-48小時。取麥康凱液體 培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上3035C培養(yǎng)18-72小時。陽性對照組應生長良好。3.8.2 實驗結果：試驗次數：1供試品批號:控制菌項目常規(guī)法大腸埃希菌試驗組陽性對照組陰性對照組檢驗人：日期:復核人：日期:供試品批號試驗次數：2控制菌項目常規(guī)法大腸埃希菌試驗組陽性對照組陰性對照組檢驗人：日期:復核人：日期:試驗次數：3供試品批號控制菌項目常規(guī)法大腸埃希菌試驗組陽性對照組陰性對照組383結論:檢驗人：日期：復核人：日期：4. 方法判定：本