水稻小粒密穗突變體sep1的遺傳分析、基因定位與育種利用

1、水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 王躍星,吳昆,方云霞陳紅旗倪深付向東朱旭東,(中國水稻爭辯所水稻生物學(xué)國家重點試驗室,杭州;中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)爭辯所,北京;共同第一作者;通訊聯(lián)系人,Email:ricezxdcom)GeneticAnalysis,GeneMappingandBreedingApplicationofSmallGrainandDensePanicleMutantsepinRiceWANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,CHENHongqi,NIShen,FUXiangdong,ZHUXudong,(StateKeyLaborat

2、oryofRiceBiology,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;InstituteofGeneticsandDevelopingBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,China;Theseauthorscontributedequallytothispaper;Correspondingauthor,Email:ricezxdcom)WANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,etalGeneticanalysis,genemappingandbreedingappl

3、icationofsmallgrainanddensepaniclemutantsepinriceChinJRiceSci,():Abstract:ByCorrayradiation,asmallgrainanddensepaniclemutantsepwasobtainedfromtheindicavarietyShuangkezaoComparedtothewildtypeShuangkezao,itwasamutantwithsmallergrain,shorterspikestalkbutmoregrainnumberperpanicleThehistologicalsliceobse

4、rvationofthemainstemshowedthatthemutanthadmorevascularbundlenumberinonecycleandmorecellnumberperunitareathanthewildtypeGeneticandallelismanalysisresultsshowedthatthesmallgrainanddensepaniclemutantwascontrolledbyarecessivegene,anditwasdifferenttothedensepaniclegeneswhichhadbeenalreadyclonedThenbycons

5、tructingthegeneticsegregatedpopulationandusingtheInDelmarkers,thesmallgrainanddensepaniclegenewasmappedonthecentromericregionofchromosomebetweenmarkerXPandXPInaddition,thebreedingapplicationofthemutantwascarriedoutonCMSlinesandthestabilelinesofhighgenerationshadfinallybeenobtainedKeywords:rice;small

6、grainanddensepanicle;geneticanalysis;genemapping;breedingapplication王躍星,吳昆,方云霞,等水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用中國水稻科學(xué),():摘要:通過Co衰變產(chǎn)生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得小粒密穗突變體sep,該突變體與野生型雙科早相比表現(xiàn)為籽粒變小,穗軸變短,著粒密度增加.主莖切片觀看結(jié)果顯示,突變體維管束數(shù)和單位面積細胞數(shù)均比野生型多.遺傳分析和等位性分析結(jié)果表明,該突變體為隱性突變,與已克隆的直立密穗基因不等位.利用InDel分子標記將小粒密穗基因sep定位在第染色體著絲粒四周的兩個標

7、記XP與XP之間,物理距離約為Mb.此外,還利用該突變體開展了相應(yīng)的育種利用爭辯,已獲得高代穩(wěn)定的不育系材料.關(guān)鍵詞:水稻;小粒密穗;遺傳分析;基因定位;育種利用中圖分類號:Q;S文獻標識碼:A文章編號:()禾谷類作物穗的構(gòu)成主要包括籽粒大小和穗的形態(tài),二者直接打算最終的產(chǎn)量.穗型是水稻育種上一個重要的農(nóng)藝性狀,其主要由一次和二次枝梗的形態(tài)、數(shù)量和長度打算.粒形和穗型作為水稻抱負株型的重要性狀,對于水稻產(chǎn)量增加起到了至關(guān)重要的作用,已受到越來越多育種家的重視.國內(nèi)外已有報道發(fā)覺并完成定位克隆的直立密穗基因有DEP(qPE)、DEP(EP)、DEP和EP等.這些基因大多來自粳稻品種或品系.其中,

8、DEP位點是一個把握水稻產(chǎn)量性狀的主效QTL,該位點在品種馴化過程中發(fā)生突變,產(chǎn)生的dep能導(dǎo)致稻穗變短、直立、著粒密集.dep收稿日期:;修改稿收到日期:.基金項目:浙江省自然科學(xué)基金資助項目(YC);國家方案資助項目(CBA).中國水稻科學(xué)(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn歡迎下載是一個來自中花和日本晴的直立密穗突變體.DEP編碼一個目前功能未知的植物特有蛋白,主要在幼嫩組織(尤其幼穗)中表達.形態(tài)和表達分析表明DEP主要影響穗軸和一、二次枝梗的伸長,但并不減弱穗原基的分化和形成.DEP與小圓?；騭rs和EP為等位基因.dep也來

9、自粳稻,其穗從開花到完熟都保持直立狀態(tài),與野生型稻穗在花后就開頭下垂的外形明顯不同.此外,dep突變體的穗長、粒形以及每穗粒數(shù)等性狀也發(fā)生改變.與野生型相比,dep突變體的維管束更小、莖更粗,這解釋了穗直立的表型.EP是使用N甲基N亞硝基脲處理粳稻品種Hwasunchalbyeo,獲得一個直立穗突變體hep,遺傳分析表明該表型受一個隱型突變基因ep把握.ep突變顯著增加了小維管束的數(shù)量和穗軸的粗大度,這是產(chǎn)生直立穗表型的緣由.本爭辯通過r射線輻照秈稻品種“雙科早”獲得了份小粒密穗突變體sep(smallgrainanddensepanicle,sep).本爭辯對該突變體的表型、生理特征以及主要

10、農(nóng)藝性狀進行了觀看,并對sep進行遺傳分析和基因定位,為該基因的克隆、功能分析奠定基礎(chǔ).同時,開展了sep在不育系育種中的應(yīng)用,以期利用該突變等位基因來培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)小粒不育系,起到提高制種效率和節(jié)本增效的作用.材料與方法供試材料利用Co衰變產(chǎn)生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得了大量的形態(tài)突變體.其中,sep突變體表現(xiàn)為小粒和密穗性狀.于和年將sep突變體與野生型種植于中國水稻爭辯所富陽試驗基地,成熟期調(diào)查株的株高、穗長、牢固率、粒長和粒寬等農(nóng)藝性狀,取平均值.突變體的遺傳分析與育種利用突變體基因遺傳分析群體為sep與粳稻品種日本晴、美國品種L的F及F群體,配置正、反交.利用sep與光舒(直

11、立穗粳稻)雜交考查其與已經(jīng)定位基因DEP的等位性關(guān)系;利用sep與日本晴的F群體中小粒密穗分別單株對突變體基因開展定位爭辯.將sep與華粳秈、稻花香號、中B和中巧B等配組,獲得育種利用群體(F,F和回交群體等).對上述各世代材料實行單本移栽,逐株考查單株表型分別狀況,在考查直立密穗突變體的同時考查分析直立密穗突變體后代分別的遺傳特點.突變體組織切片觀看取野生型和突變體的莖稈用FAA固定液固定、保存.石蠟切片制作方法參見文獻.突變體的基因定位親本、F及F遺傳群體植株的基因組DNA采用CTAB法提取.通過NCBI(http:/wwwncbinlmnihgov)公布的粳稻日本晴和秈稻的全基因組序列差

12、異查找插入/缺失(InDel)位點,利用PrimerPremiers軟件設(shè)計InDel分子標記(表,引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成).將提取的DNA用于PCR擴增試驗,PCR體系如下:DNAL,正反向引物(mol/L)各L,表本爭辯中用于定位的分子標記TableMolecularmarkersformappinginthestudy標記Marker正向引物序列Forwardprimersequence()反向引物序列Reverseprimersequence()物理位置Physicalposition/bpXPCCACCGAAACATAAACATCATCTGGGTTTGTGAATTGAGA

13、ATXPAAAGCCACCTAATAGAATCAAACCATTTGGAGCGGATAGTCXPTACGAAATGGACAAGATAGCACGCTTACTTTCTTCTGGGTGATAXPGCTTCAAAACAATCATCATATCAGTCAAAACGTAGGTACTTCAGXPAAATTGGTTCGTCGCTGGTTAAAACGGAAAACCAAGGGGAAAXPAATAGTTATTCTAGGGGAGGGGCCATTTCATTCCATTTTCATACTXPGCCAAAGAATCCAGCACCCCTTTTCGTTCCCCACCATCCACXPCTCCCTTCCATCGCCACAATCCAAACT

14、CGAAACCGACAAAXPGATAACCGTGCTGTCTCCCCCGCGATACGTTTGTACACCGXPGGATCGAAAGAAACAAAATAGTAGTCCCACGTAAATACAGAAACXPTCCAGGTGATAAGAAAGTGAATGAATGTTGAGTGGTATGCGATGA中國水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表雙科早及其突變體sep株高和穗相關(guān)性狀TableComparisonofplantheightandpanicletraitsbetweenShuangkezaoandthemutantsep材料Material株高Plantheight/cm穗

15、長Paniclelength/cm每穗粒數(shù)Noofgrainsperpanicle牢固率Seedsettingrate/粒長Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm雙科早Shuangkezao±±±±±±sep±±±±±±和兩年數(shù)據(jù)平均.和分別表示野生型與突變體在和水平上差異顯著.Valuesaremeansofandandmeandifferencebetweenwildtypeandthemutantatandsignificancelevel,resp

16、ectively表sep與L、日本晴組合F分別的卡方檢驗TableTestofchisquareonsegregationrateofFpopulationbetweensepandL,Nipponbare組合Combination正常表型株數(shù)Normalpanicleplantnumber突變表型株數(shù)Mutantplantnumber總株數(shù)Totalplantnumber分別比例Segregationratio卡平方檢驗Chisquaretestsep/L,Psep/日本晴sep/Nipponbare,PdNTPs(mol/L)L,×PCR緩沖液L,Taq酶L,加ddHO補足L.P

17、CR程序如下:下預(yù)變性min;下s,下s,下s,個循環(huán).PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳,電泳結(jié)束后在凝膠成像儀拍照并讀膠.統(tǒng)計分析接受MicrosoftExcel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用SAS軟件進行方差分析.結(jié)果與分析突變體的表型鑒定小粒密穗突變體sep與野生型雙科早相比,表現(xiàn)為籽粒變小,穗型變短,著粒密度增加,植株變矮(圖).此外,生育期、分蘗數(shù)、牢固率等性狀無明顯差異,其小粒密穗性狀能穩(wěn)定遺傳.突變體sep與野生型雙科早株高及穗部考種數(shù)據(jù)見表.突變體的顯微結(jié)構(gòu)從野生型雙科早和小粒密穗突變體sep的成熟植株主莖進行切片(圖)可以觀看到,不論是主莖橫切面還是縱切面,野生型植株主莖細胞均比突變體

18、略大,突變體細胞排列更緊密,細胞數(shù)量更多.突變體主莖橫切面維管束數(shù)量(圖C)顯著多于野生型;縱切面單位面積細胞數(shù)量(圖F)也顯著多于野生型.這一結(jié)果說明突變體植株整體細胞數(shù)量增多,排列更緊密,且細胞橫向進展明顯,從而造成圖雙科早與突變體sep的表型比較FigComparisonofplants,paniclesandgrainsofShuangkezao(SKZ)andsep了株高降低,同時也構(gòu)成了突變體每穗粒數(shù)顯著增加的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).突變體的遺傳分析及基因定位在sep與L、日本晴等配組后,雜交F均表現(xiàn)為正常表型,F穗型發(fā)生分別,遺傳比例符合正常表型突變表型(表),表明sep小粒密穗突變表型受

19、單隱性核基因把握.王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 A雙科早橫切;Bsep橫切;C橫切面維管束數(shù)量;D雙科早縱切;Esep縱切;F縱切面虛線框面積中細胞數(shù).A,CrosssectionofShuangkezao;B,Crosssectionofsep;C,Statisticcomparisonofvascularbundlenumberinonecycle;D,LongitudinalsectionofShuangkezao;E,Longitudinalsectionofsep;F,Cellnumberinthedottedbox圖雙科早和突變體sep莖的顯微結(jié)

20、構(gòu)比較FigMicroscopicstructurecomparisonbetweenShuangkezaoandsep圖sep基因在第染色體上位置FigLocationoftheseponChromosome將突變體sep分別與攜dep基因的光舒雜交,進行等位性檢測,結(jié)果表明sep基因與dep不等位,為新的小粒密穗基因.利用本試驗室均勻分布于條染色體的對公共引物對sep/日本晴的F分別群體進行連鎖分析,初步確定目標基因位于第染色體著絲粒四周,介于InDel標記XP與標記XP之間的約Mb區(qū)間內(nèi),在該區(qū)域還未有相關(guān)基因的報道.進一步在連鎖標記四周開發(fā)了對存在多態(tài)的InDel標記(表),利用這些標

21、記以株分別單株為材料對突變體基因進行進一步的定位,最終將sep定位于著絲粒四周的InDel標記XP與標記XP之間約Mb的區(qū)間內(nèi)(圖).突變體sep的育種利用對突變體sep與華粳秈、稻花香號、中B的分別世代重點選擇小粒密穗、異交習(xí)性好、米質(zhì)優(yōu)異的單株,用相應(yīng)的輪回親本進行連續(xù)回交,在中國水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)HJX華粳秈;DHX稻花香號.HJX,Huajingxian;DHX,Daohuaxiang圖NILsep(sep/華粳秈后代株系)、NILsep(sep/稻花香號后代株系)與親本籽粒、株高及穗部性狀比較FigComparisonofgrain,planthei

22、ghtandpanicletraitsbetweenHJXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/HJX),DHXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/DHX)選擇突變性狀同時,兼顧選擇系內(nèi)株間較整齊、花時較早、柱頭外露的單株,年分別從sep/華粳秈組合和sep/稻花香號組合獲得了穩(wěn)定不育系NILsep和NILsep.NILsep和NILsep與各自輪回親本籽粒相比(圖),它們的穗長變短,籽粒變小,植株變矮,但著粒密度增加.爭辯目前在我國長江中下游地區(qū)和東北遼寧省、吉林省的部分稻區(qū)種植的直立和半直立穗型的高產(chǎn)粳稻品種都含有D

23、EP突變基因,表明DEP已在我國水稻增產(chǎn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.大量粳型密穗品種的推廣種植實踐表明,密穗型品種植株細胞縱向縮短、橫向變長,細胞數(shù)目也同時增多,表現(xiàn)為株高降低,莖桿更粗大,穗型直立,著粒密度增加,最終也能達到穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的抱負狀態(tài).從群體光能利用效率抗倒伏力量來看,密穗型品種也具有肯定的形態(tài)優(yōu)勢.爭辯者利用r射線輻照秈稻品種雙科早時獲得了大量的形態(tài)突變體,其中共有份密穗型突變體,分別編號為SKZ、SKZ、SKZ(sep)、SKZ和SKZ.雜交等位性分析和基因定位結(jié)果表明,突變體SKZ、SKZ、SKZ密穗性狀把握基因與已克隆基因DEP等位,基因定位結(jié)果均位于號染色體相同位置;突變體SKZ密穗

24、性狀把握基因和DEP、DEP、DEP都不等位(該突變體基因的定位工作正在進行中);突變體SKZ(sep)密穗性狀把握基因與DEP、DEP、DEP均不等位,且sep和SKZ密穗性狀把握基因間不等位.與其他份突變體相比,sep不但同時表現(xiàn)出典型的小粒密穗,且牢固率等性狀均未消滅明顯下降(表),因此首先針對該材料開展遺傳分析,基因定位和育種利用的工作.在雜交稻不育系選育中,為求得到更高的雜交水稻產(chǎn)量潛力,提高千粒重是現(xiàn)行接受的手段之一,但這也同時導(dǎo)致了稻農(nóng)用種量的增加而投入更多用于購種的成本,.以往推廣的不育系中大多為大粒品種,如龍?zhí)馗、A和內(nèi)香A等,只有極少數(shù)小粒不育系如博白A,而且也僅局限在兩

25、廣(廣東和廣西)地區(qū)推廣較多.另一方面,雜交水稻種子生產(chǎn)成本逐年上升,直接導(dǎo)致了雜交種的價格的快速上漲.年雜交水稻種子市場價格總體比年上漲了;年雜交水稻種王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 子價格比年上漲了,其中部分市場主導(dǎo)品種價格上漲幅度遠大于全國平均漲幅,甚至有少數(shù)品種價格漲幅超過;年全國三系雜交稻均價元/kg,同比上漲,兩系雜交中稻均價元/kg,同比上漲.因此,如何提高制種效率,降低制種成本,達到節(jié)本增效的同時,減輕農(nóng)夫購種負擔,是一個急需解決的問題.通過小粒密穗突變體sep的發(fā)掘和利用,可以將隱性的小粒密穗基因?qū)氩挥?使籽粒變小同時每穗粒數(shù)增加,這樣在

26、相同制種面積下,可產(chǎn)出更多粒數(shù)的雜交稻種子,而在雜交稻F代,該隱性性狀又不會消滅,從而不轉(zhuǎn)變雜交稻生產(chǎn)出的谷粒大小,保持高產(chǎn)農(nóng)藝性狀,最終削減制種面積,提高土地利用效率,降低種子公司制種成本,削減稻農(nóng)購種的成本,增加稻農(nóng)的收益.在雜交水稻種子快速上漲的背景下,這不失為一個有效的策略.當然小粒不育系種子在發(fā)芽率,發(fā)芽勢上,以及葉期前幼苗養(yǎng)分供應(yīng)方面,與大粒品種間是否存在差異,如何在育種實踐和生產(chǎn)中真正開展運用還有待進一步爭辯和探討.參考文獻:HuangXZ,QianQ,LiuZB,etalNaturalvariationattheDEPlocusenhancesgrainyieldinriceN

27、atGenet,():YanCJ,ZhouH,YanS,etalIdentificationandcharacterizationofamajorQTLresponsibleforerectpanicletraitinjaponicarice(OryzasativaL)TheorApplGenet,():ZhouY,ZhuJY,LiZY,etalDeletioninaquantitativetraitgeneqPEassociatedwithpanicleerectnessimprovesplantarchitectureduringricedomesticationGenetics,():FumioTS,YasushiK,HiroshiK,etalAlossoffunctionmutationofricedensepaniclecausessemidwarfnessandslightlyincreasednumberofspikeletsBreedingSci,():LiF,LiuWB,TangJY,etalRicedenseanderectpanicleisessentialfordetermi