淺論存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)化療藥物抑癌作用的影響

1、淺論存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)化療藥物抑癌作用的影響                 作者：李莉萍 ，羅超權(quán)，張志珍，梁念慈【摘要】  目的 探討存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒(mU6/survivin質(zhì)粒)對(duì)化療藥物抑癌作用的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)mU6/survivin質(zhì)粒與多種常規(guī)腫瘤化療藥物對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用。結(jié)果 比較單純化療藥物作用組的各相應(yīng)濃度點(diǎn)，siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin與化療藥物順鉑、環(huán)

2、磷酰胺、5氟尿嘧啶或秋水仙堿合用組對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF7的細(xì)胞增殖抑制率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);對(duì)靶向DNA藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5氟尿嘧啶的抗癌性能具有顯著的協(xié)同增強(qiáng)作用(二者合用效應(yīng)Q值均1)，但對(duì)靶向微管的藥物秋水仙堿沒(méi)有相加作用(Q值1)。結(jié)論 在解除腫瘤細(xì)胞中存活素功能的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物化療，可能是腫瘤的一個(gè)新的可行方向。 【關(guān)鍵詞】  存活素;siRNA;質(zhì)粒;化療藥物     Abstract: Objective To study the influence of survivin siRNA expr

3、ession plasmid on antitumor role of chemotherapeutic drugs. Methods The combined role of mU6/survivin plasmid and several chemotherapeutic drugs in the proliferation of MCF7 cells was determined by MTT method. Results The combined use of mU6/survivin plasmid and cisplatin, cyclophosphamide, 5fluorou

4、racil or colchicine resulted in significant inhibition of MCF7 cells compared with the single use of mU6/survivin plasmid or chemotherapeutic drugs (P0.01). The synergistic effect was observed in the combination of pmU6/survivin and cisplatin, cyclophosphamide and 5fluorouracil (Q1) other than colch

5、icine (Q1). Conclusion The combination of chemotherapy and survivin deprival may be a novel regimen for cancer patients.Key words: surviving; siRNA; plasmid; chemotherapeutic drug腫瘤手術(shù)切除結(jié)合化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性治療仍然是當(dāng)今腫瘤治療的主要手段，順鉑、環(huán)磷酰胺、5氟尿嘧啶(5Fu)和秋水仙堿都是廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐的常規(guī)腫瘤化療藥物，但其藥效并不總是理想，腫瘤治療后伴隨而來(lái)的耐藥或多藥耐藥性(MDR)更是治療過(guò)程中難以

6、克服的障礙。存活素特異性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，臨床數(shù)據(jù)顯示，存活素表達(dá)高低與腫瘤患者的存活率相關(guān)1。我們針對(duì)存活素基因設(shè)計(jì)和克隆的mU6/ Survivin siRNA表達(dá)質(zhì)粒，能高效地剔降乳腺癌MCF7細(xì)胞中的存活素mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用該質(zhì)粒剔降乳腺癌細(xì)胞MCF7中存活素的表達(dá)，之后施以化學(xué)毒性藥物進(jìn)行治療，觀察順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿在存活素被沉默之后的抗癌效果。1 材料和方法1.1 試劑空載體mU6pro由美國(guó)Michigan大學(xué)Dave Turner博士惠贈(zèng); ProFection 哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司; 5Fu(99%)、環(huán)磷酰胺(99%)、秋水

7、仙堿(99.6%)購(gòu)自南京學(xué)子醫(yī)化研發(fā)中心;順鉑注射液(1 mg/mL)由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);乳腺癌細(xì)胞MCF7為本科室保存。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)于含15 %小牛血清、0.5 U/mL胰島素、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置37，5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣法，操作按ProFection哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。pEGFPN1和mU6/survivin質(zhì)粒以13的比例共轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，在60 mm培養(yǎng)皿上轉(zhuǎn)染3 g mU6/survivin質(zhì)粒, 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)綠

8、色熒光蛋白EGFP的效率來(lái)確定轉(zhuǎn)染效率均超過(guò)80%，空載體mU6pro轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。1.3 腫瘤化療藥物增敏性實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒或mU6pro空載體12 h后，0.25%胰酶消化，按0.5×104/孔接種于96孔板，在37、5% CO2下培養(yǎng)24 h，分別加入DMSO或終濃度為10、20、40、80和160 g/L的順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu、秋水仙堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每孔加入10 L 5 g/L MTT ，繼續(xù)溫育4 h，然后加入100 L DMSO，裂解細(xì)胞15 min，酶標(biāo)儀讀取光密度值OD57

9、0nm/450nm。按下列公式細(xì)胞增殖抑制率：B=對(duì)照組OD值，A=實(shí)驗(yàn)組OD值，抑制率=(1A/B)×100%。合用效應(yīng)用Q值來(lái)表示，Q值=實(shí)測(cè)合并效應(yīng)/期望合并效應(yīng)=實(shí)測(cè)抑制率/(EA+EBEA×EB)，EA、EB分別代表質(zhì)粒、化療藥物單獨(dú)作用時(shí)的抑制率。Q值1為拮抗，Q值=1為相加，Q值1為增強(qiáng)。單純藥物作用組轉(zhuǎn)染空載體mU6pro+藥物，單純質(zhì)粒作用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+DMSO，藥物質(zhì)粒合用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+藥物。1.4 DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA裂解實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒36 h后，加入濃度為20 g/L的不同的腫瘤

10、化療藥物,如順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu或秋水仙堿等，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗3次，加50 L細(xì)胞裂解液(1 % NP40,20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L TrisHCl pH 7.5)處理10 s，1500 g離心5 min，獲得上清，重復(fù)裂解1次，合并上清。加10 L 10 % SDS，2 L 10 g/LRNase A,37水浴2 h, 加4 L 20 g/L蛋白酶K,56 水浴2 h,隨后加70 L 10 mmol/L NH4Ac,600 L無(wú)水乙醇沉淀DNA，4 條件下15000 g離心15 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，照相。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)

11、據(jù)用(±s)%表示，Students test確定組間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)順鉑對(duì)MCF7細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)表1。順鉑單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)，并隨著順鉑濃度升高，其細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)它與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí)，比較順鉑單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度的順鉑的二者合用效應(yīng)Q值，所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值

12、均1，具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)順鉑誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。表1 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)順鉑對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 與順鉑單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：P0.01。2.2 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抑癌作用結(jié)果見(jiàn)表2。在本實(shí)驗(yàn)采用的濃度范圍內(nèi)，環(huán)磷酰胺單藥組對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不明顯。但當(dāng)與mU6/survivin質(zhì)粒合用時(shí)，比較環(huán)磷酰胺單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖

13、抑制率(21.16±1.60)%相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度環(huán)磷酰胺的二者合用效應(yīng)Q值，所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均1，具有增強(qiáng)協(xié)同作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。2.3 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)5Fu的抑癌作用結(jié)果見(jiàn)表3。5Fu單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)5Fu與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí)，比較5Fu單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制

14、率相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度5Fu的二者合用效應(yīng)Q值，除10 g/L濃度點(diǎn)外，其余各濃度點(diǎn)Q值均1，具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)5Fu 誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。表2 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與環(huán)磷酰胺單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：P0.01。 表3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)5Fu對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與5Fu單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：*P0.01;

15、與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：P0.01。表4 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)秋水仙堿誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 與秋水仙堿單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：P0.01。2.4 mU6/Survivin質(zhì)粒對(duì)秋水仙堿的腫瘤細(xì)胞增殖抑制結(jié)果見(jiàn)表4。秋水仙堿單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)它與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí)，比較秋水仙堿單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。然而，計(jì)算mU6/S

16、urvivin質(zhì)粒與不同濃度秋水仙堿的二者合用效應(yīng)Q值時(shí)發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)采用的濃度范圍內(nèi)，所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均1，顯示出它們的合用不但沒(méi)有加合作用，反而具有一定程度的拮抗作用。DNA電泳結(jié)果則顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中促進(jìn)秋水仙堿誘導(dǎo)的DNA裂解(圖1)。3 討論順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿都是廣譜的抗腫瘤化療藥物。順鉑是一種鉑金屬化合物，能與DNA鏈中鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生交聯(lián)，使DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA功能45。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，其需先經(jīng)分解為活化形式磷酰胺氮芥才有抑癌活性。磷酰胺氮芥與DNA鏈交叉連結(jié)，導(dǎo)致DNA的改變或斷裂而破壞DNA功能，阻礙DNA復(fù)

17、制。5Fu是RNA鏈中重要組成部分尿嘧啶的類似物，取代尿嘧啶參與DNA的合成。秋水仙堿則是一種微管蛋白結(jié)合劑，阻遏微管蛋白聚合，而微管蛋白在細(xì)胞有絲分裂紡錘體組裝中扮演重要角色。DNA復(fù)制和有絲分裂是細(xì)胞周期過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。面對(duì)化療藥物造成的破壞，出于自我保護(hù)需要，腫瘤細(xì)胞第一反應(yīng)是要盡可能修復(fù)缺陷，維護(hù)其基因組的完整性。通過(guò)改變藥物引起的損傷DNA的修復(fù)能力，破壞凋亡信號(hào)通路，改變與腫瘤耐藥相關(guān)蛋白和酶的表達(dá)等等方式，對(duì)化療藥物治療產(chǎn)生耐藥從而使化療效果下降。例如，大約40%的乳腺癌患者表達(dá)藥物載體蛋白Pgp, Pgp的表達(dá)升高誘導(dǎo)某些化療藥物的耐藥性，是一種典型的多藥耐藥蛋白。又如，順鉑

18、誘導(dǎo)存活素 mRNA和蛋白質(zhì)增加，可能與其腫瘤耐藥相關(guān)。但如果損傷實(shí)在無(wú)法修復(fù)，腫瘤細(xì)胞的第二反應(yīng)則是動(dòng)員相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞實(shí)行死亡程序。         相關(guān)顯示，存活素表達(dá)與腫瘤放療化療耐受相關(guān)，化療藥物后存活素表達(dá)水平明顯升高10。存活素及其家族在多藥耐受細(xì)胞中過(guò)表達(dá)11，調(diào)節(jié)存活素表達(dá)可以影響Pgp的穩(wěn)定性和活性12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin剔降MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá)，對(duì)靶向DNA合成復(fù)制和損傷后修復(fù)的藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5Fu的抗癌活性具有顯著的加強(qiáng)作用，可見(jiàn)，降低和

19、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中存活素的過(guò)表達(dá)，可能意味著降低了腫瘤細(xì)胞的抗藥性能，使腫瘤化療藥物的細(xì)胞毒性得到了充分體現(xiàn)。與此同時(shí)，存活素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分裂和凋亡13,其siRNA誘導(dǎo)凋亡或使細(xì)胞對(duì)藥物或死亡配體/受體誘導(dǎo)的凋亡敏感14，增強(qiáng)腫瘤對(duì)放療的敏感性15，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性16，部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表征。本課題組的結(jié)果還顯示，mU6/survivin能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多核化和核巨型化，導(dǎo)致細(xì)胞裂亡17。由此可見(jiàn)，mU6/survivin沉默MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá)，啟動(dòng)和引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞執(zhí)行各種死亡通路，可能是其增強(qiáng)腫瘤化療藥物抗癌效果的作用機(jī)制之一。有報(bào)道顯示，存活素過(guò)表達(dá)通過(guò)影響微管動(dòng)力學(xué)和抑制凋亡提

20、高對(duì)微管靶向藥物的耐受性18。本結(jié)果顯示，剔降MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá)，雖然從表面數(shù)值看來(lái)，秋水仙堿抑癌效果比單藥或單純質(zhì)粒作用要強(qiáng)一些，但二者藥效不具加合性。也就是說(shuō)，存活素表達(dá)缺失不能增強(qiáng)癌細(xì)胞MCF7對(duì)秋水仙堿細(xì)胞毒性的敏感度，奇怪的是，這種缺失卻增強(qiáng)了秋水仙堿誘導(dǎo)的MCF7癌細(xì)胞DNA裂解的涂布現(xiàn)象。由此看來(lái)，mU6/survivin對(duì)秋水仙堿抗癌作用的影響不能單從短期作用的細(xì)胞毒性角度得以精確分析和反映，或許存活素 siRNA 對(duì)微管靶向藥物的影響來(lái)得更慢一些。總而言之，siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin使腫瘤對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性更加敏感。在應(yīng)用siRNA 干擾等技術(shù)解

21、除腫瘤細(xì)胞中存活素的功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)行腫瘤化療藥物治療，可以成為未來(lái)腫瘤治療學(xué)的一個(gè)方向。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以為腫瘤治療新方法新概念的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【文獻(xiàn)】  1 Yamashita S, Masuda Y, Kurizaki T, et al. Survivin expression predicts early recurrence in earlystage breast cancer J. Anticancer Res, 2007, 27(4C):28032808. 李莉萍, 梁念慈, 羅超權(quán). 存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)MCF 7細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控J. 癌癥,

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