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1、淺論存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)化療藥物抑癌作用的影響                 作者:李莉萍 ,羅超權(quán),張志珍,梁念慈【摘要】  目的 探討存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒(mU6/survivin質(zhì)粒)對(duì)化療藥物抑癌作用的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)mU6/survivin質(zhì)粒與多種常規(guī)腫瘤化療藥物對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用。結(jié)果 比較單純化療藥物作用組的各相應(yīng)濃度點(diǎn),siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin與化療藥物順鉑、環(huán)

2、磷酰胺、5氟尿嘧啶或秋水仙堿合用組對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF7的細(xì)胞增殖抑制率均明顯提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);對(duì)靶向DNA藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5氟尿嘧啶的抗癌性能具有顯著的協(xié)同增強(qiáng)作用(二者合用效應(yīng)Q值均1),但對(duì)靶向微管的藥物秋水仙堿沒(méi)有相加作用(Q值1)。結(jié)論 在解除腫瘤細(xì)胞中存活素功能的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物化療,可能是腫瘤的一個(gè)新的可行方向。 【關(guān)鍵詞】  存活素;siRNA;質(zhì)粒;化療藥物     Abstract: Objective To study the influence of survivin siRNA expr

3、ession plasmid on antitumor role of chemotherapeutic drugs. Methods The combined role of mU6/survivin plasmid and several chemotherapeutic drugs in the proliferation of MCF7 cells was determined by MTT method. Results The combined use of mU6/survivin plasmid and cisplatin, cyclophosphamide, 5fluorou

4、racil or colchicine resulted in significant inhibition of MCF7 cells compared with the single use of mU6/survivin plasmid or chemotherapeutic drugs (P0.01). The synergistic effect was observed in the combination of pmU6/survivin and cisplatin, cyclophosphamide and 5fluorouracil (Q1) other than colch

5、icine (Q1). Conclusion The combination of chemotherapy and survivin deprival may be a novel regimen for cancer patients.Key words: surviving; siRNA; plasmid; chemotherapeutic drug腫瘤手術(shù)切除結(jié)合化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性治療仍然是當(dāng)今腫瘤治療的主要手段,順鉑、環(huán)磷酰胺、5氟尿嘧啶(5Fu)和秋水仙堿都是廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐的常規(guī)腫瘤化療藥物,但其藥效并不總是理想,腫瘤治療后伴隨而來(lái)的耐藥或多藥耐藥性(MDR)更是治療過(guò)程中難以

6、克服的障礙。存活素特異性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中,臨床數(shù)據(jù)顯示,存活素表達(dá)高低與腫瘤患者的存活率相關(guān)1。我們針對(duì)存活素基因設(shè)計(jì)和克隆的mU6/ Survivin siRNA表達(dá)質(zhì)粒,能高效地剔降乳腺癌MCF7細(xì)胞中的存活素mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用該質(zhì)粒剔降乳腺癌細(xì)胞MCF7中存活素的表達(dá),之后施以化學(xué)毒性藥物進(jìn)行治療,觀察順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿在存活素被沉默之后的抗癌效果。1 材料和方法1.1 試劑空載體mU6pro由美國(guó)Michigan大學(xué)Dave Turner博士惠贈(zèng); ProFection 哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司; 5Fu(99%)、環(huán)磷酰胺(99%)、秋水

7、仙堿(99.6%)購(gòu)自南京學(xué)子醫(yī)化研發(fā)中心;順鉑注射液(1 mg/mL)由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);乳腺癌細(xì)胞MCF7為本科室保存。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)于含15 %小牛血清、0.5 U/mL胰島素、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,置37,5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣法,操作按ProFection哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。pEGFPN1和mU6/survivin質(zhì)粒以13的比例共轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞,在60 mm培養(yǎng)皿上轉(zhuǎn)染3 g mU6/survivin質(zhì)粒, 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)綠

8、色熒光蛋白EGFP的效率來(lái)確定轉(zhuǎn)染效率均超過(guò)80%,空載體mU6pro轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。1.3 腫瘤化療藥物增敏性實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒或mU6pro空載體12 h后,0.25%胰酶消化,按0.5×104/孔接種于96孔板,在37、5% CO2下培養(yǎng)24 h,分別加入DMSO或終濃度為10、20、40、80和160 g/L的順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu、秋水仙堿,繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每孔加入10 L 5 g/L MTT ,繼續(xù)溫育4 h,然后加入100 L DMSO,裂解細(xì)胞15 min,酶標(biāo)儀讀取光密度值OD57

9、0nm/450nm。按下列公式細(xì)胞增殖抑制率:B=對(duì)照組OD值,A=實(shí)驗(yàn)組OD值,抑制率=(1A/B)×100%。合用效應(yīng)用Q值來(lái)表示,Q值=實(shí)測(cè)合并效應(yīng)/期望合并效應(yīng)=實(shí)測(cè)抑制率/(EA+EBEA×EB),EA、EB分別代表質(zhì)粒、化療藥物單獨(dú)作用時(shí)的抑制率。Q值1為拮抗,Q值=1為相加,Q值1為增強(qiáng)。單純藥物作用組轉(zhuǎn)染空載體mU6pro+藥物,單純質(zhì)粒作用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+DMSO,藥物質(zhì)粒合用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+藥物。1.4 DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA裂解實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒36 h后,加入濃度為20 g/L的不同的腫瘤

10、化療藥物,如順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu或秋水仙堿等,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,PBS洗3次,加50 L細(xì)胞裂解液(1 % NP40,20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L TrisHCl pH 7.5)處理10 s,1500 g離心5 min,獲得上清,重復(fù)裂解1次,合并上清。加10 L 10 % SDS,2 L 10 g/LRNase A,37水浴2 h, 加4 L 20 g/L蛋白酶K,56 水浴2 h,隨后加70 L 10 mmol/L NH4Ac,600 L無(wú)水乙醇沉淀DNA,4 條件下15000 g離心15 min,1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察,照相。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)

11、據(jù)用(±s)%表示,Students test確定組間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)順鉑對(duì)MCF7細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)表1。順鉑單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng),并隨著順鉑濃度升高,其細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)它與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí),比較順鉑單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn),其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率相比較,其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度的順鉑的二者合用效應(yīng)Q值,所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值

12、均1,具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)順鉑誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。表1 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)順鉑對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 與順鉑單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較:*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較:P0.01。2.2 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抑癌作用結(jié)果見(jiàn)表2。在本實(shí)驗(yàn)采用的濃度范圍內(nèi),環(huán)磷酰胺單藥組對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不明顯。但當(dāng)與mU6/survivin質(zhì)粒合用時(shí),比較環(huán)磷酰胺單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn),其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖

13、抑制率(21.16±1.60)%相比較,其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度環(huán)磷酰胺的二者合用效應(yīng)Q值,所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均1,具有增強(qiáng)協(xié)同作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。2.3 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)5Fu的抑癌作用結(jié)果見(jiàn)表3。5Fu單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)5Fu與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí),比較5Fu單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn),其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制

14、率相比較,其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計(jì)算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度5Fu的二者合用效應(yīng)Q值,除10 g/L濃度點(diǎn)外,其余各濃度點(diǎn)Q值均1,具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中對(duì)5Fu 誘導(dǎo)的DNA裂解沒(méi)有影響。表2 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與環(huán)磷酰胺單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較:*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較:P0.01。 表3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)5Fu對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與5Fu單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較:*P0.01;

15、與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較:P0.01。表4 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)秋水仙堿誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 與秋水仙堿單藥組對(duì)應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較:*P0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較:P0.01。2.4 mU6/Survivin質(zhì)粒對(duì)秋水仙堿的腫瘤細(xì)胞增殖抑制結(jié)果見(jiàn)表4。秋水仙堿單藥能有效地抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)它與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時(shí),比較秋水仙堿單藥組各對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn),其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率相比較,其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。然而,計(jì)算mU6/S

16、urvivin質(zhì)粒與不同濃度秋水仙堿的二者合用效應(yīng)Q值時(shí)發(fā)現(xiàn),在本實(shí)驗(yàn)采用的濃度范圍內(nèi),所有對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均1,顯示出它們的合用不但沒(méi)有加合作用,反而具有一定程度的拮抗作用。DNA電泳結(jié)果則顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF7細(xì)胞中促進(jìn)秋水仙堿誘導(dǎo)的DNA裂解(圖1)。3 討論順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿都是廣譜的抗腫瘤化療藥物。順鉑是一種鉑金屬化合物,能與DNA鏈中鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生交聯(lián),使DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交叉聯(lián)結(jié),破壞DNA功能45。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑,其需先經(jīng)分解為活化形式磷酰胺氮芥才有抑癌活性。磷酰胺氮芥與DNA鏈交叉連結(jié),導(dǎo)致DNA的改變或斷裂而破壞DNA功能,阻礙DNA復(fù)

17、制。5Fu是RNA鏈中重要組成部分尿嘧啶的類似物,取代尿嘧啶參與DNA的合成。秋水仙堿則是一種微管蛋白結(jié)合劑,阻遏微管蛋白聚合,而微管蛋白在細(xì)胞有絲分裂紡錘體組裝中扮演重要角色。DNA復(fù)制和有絲分裂是細(xì)胞周期過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。面對(duì)化療藥物造成的破壞,出于自我保護(hù)需要,腫瘤細(xì)胞第一反應(yīng)是要盡可能修復(fù)缺陷,維護(hù)其基因組的完整性。通過(guò)改變藥物引起的損傷DNA的修復(fù)能力,破壞凋亡信號(hào)通路,改變與腫瘤耐藥相關(guān)蛋白和酶的表達(dá)等等方式,對(duì)化療藥物治療產(chǎn)生耐藥從而使化療效果下降。例如,大約40%的乳腺癌患者表達(dá)藥物載體蛋白Pgp, Pgp的表達(dá)升高誘導(dǎo)某些化療藥物的耐藥性,是一種典型的多藥耐藥蛋白。又如,順鉑

18、誘導(dǎo)存活素 mRNA和蛋白質(zhì)增加,可能與其腫瘤耐藥相關(guān)。但如果損傷實(shí)在無(wú)法修復(fù),腫瘤細(xì)胞的第二反應(yīng)則是動(dòng)員相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞實(shí)行死亡程序。         相關(guān)顯示,存活素表達(dá)與腫瘤放療化療耐受相關(guān),化療藥物后存活素表達(dá)水平明顯升高10。存活素及其家族在多藥耐受細(xì)胞中過(guò)表達(dá)11,調(diào)節(jié)存活素表達(dá)可以影響Pgp的穩(wěn)定性和活性12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin剔降MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá),對(duì)靶向DNA合成復(fù)制和損傷后修復(fù)的藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5Fu的抗癌活性具有顯著的加強(qiáng)作用,可見(jiàn),降低和

19、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中存活素的過(guò)表達(dá),可能意味著降低了腫瘤細(xì)胞的抗藥性能,使腫瘤化療藥物的細(xì)胞毒性得到了充分體現(xiàn)。與此同時(shí),存活素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分裂和凋亡13,其siRNA誘導(dǎo)凋亡或使細(xì)胞對(duì)藥物或死亡配體/受體誘導(dǎo)的凋亡敏感14,增強(qiáng)腫瘤對(duì)放療的敏感性15,抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性16,部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表征。本課題組的結(jié)果還顯示,mU6/survivin能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多核化和核巨型化,導(dǎo)致細(xì)胞裂亡17。由此可見(jiàn),mU6/survivin沉默MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá),啟動(dòng)和引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞執(zhí)行各種死亡通路,可能是其增強(qiáng)腫瘤化療藥物抗癌效果的作用機(jī)制之一。有報(bào)道顯示,存活素過(guò)表達(dá)通過(guò)影響微管動(dòng)力學(xué)和抑制凋亡提

20、高對(duì)微管靶向藥物的耐受性18。本結(jié)果顯示,剔降MCF7細(xì)胞中存活素的表達(dá),雖然從表面數(shù)值看來(lái),秋水仙堿抑癌效果比單藥或單純質(zhì)粒作用要強(qiáng)一些,但二者藥效不具加合性。也就是說(shuō),存活素表達(dá)缺失不能增強(qiáng)癌細(xì)胞MCF7對(duì)秋水仙堿細(xì)胞毒性的敏感度,奇怪的是,這種缺失卻增強(qiáng)了秋水仙堿誘導(dǎo)的MCF7癌細(xì)胞DNA裂解的涂布現(xiàn)象。由此看來(lái),mU6/survivin對(duì)秋水仙堿抗癌作用的影響不能單從短期作用的細(xì)胞毒性角度得以精確分析和反映,或許存活素 siRNA 對(duì)微管靶向藥物的影響來(lái)得更慢一些。總而言之,siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin使腫瘤對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性更加敏感。在應(yīng)用siRNA 干擾等技術(shù)解

21、除腫瘤細(xì)胞中存活素的功能的基礎(chǔ)上,進(jìn)行腫瘤化療藥物治療,可以成為未來(lái)腫瘤治療學(xué)的一個(gè)方向。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以為腫瘤治療新方法新概念的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【文獻(xiàn)】  1 Yamashita S, Masuda Y, Kurizaki T, et al. Survivin expression predicts early recurrence in earlystage breast cancer J. Anticancer Res, 2007, 27(4C):28032808. 李莉萍, 梁念慈, 羅超權(quán). 存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)MCF 7細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控J. 癌癥,

22、2004, 23(7):742 748. 金正均.合并用藥中的相加J.藥報(bào), 1980, 1 (1): 7076. Martin L P, Hamilton T C, Schilder R J. Platinum resistance: the role of DNA repair pathwaysJ. Clin Cancer Res, 2008, 14(5): 12911295. Heffeter P, Jungwirth U, Jakupec M, et al. Resistance against novel anticancer metal compounds: differences

23、 and similaritiesJ. Drug Resist Updat, 2008, 11(12):116. Coley H M. Mechanisms and strategies to overcome chemotherapy resistance in metastatic breast cancerJ. Cancer Treat Rev, 2008, 34(4): 378390. Wyatt M D, Wilson D M 3rd. Participation of DNA repair in the response to 5fluorouracil J. Cell Mol L

24、ife Sci, 2008. Epub ahead of print Bhattacharyya B, Panda D, Gupta S, et al. Antimitotic activity of colchicine and the structural basis for its interaction with tubulinJ. Med Res Rev , 2008, 28(1):155183. Ikeguchi M, Liu J, Kaibara N. Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line (MKN45) during cisplatin treatmentJ. Apoptosis, 2002, (1):2329.10 Ferrario A, Rucker N, Wong S, et al. Survivin, a member of the inhibitor of apoptosis family,is induced by photodynamic therapy and is a target for improving treatment response J. Canc

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