白血病融合基因

1、bcr/abl融合基因慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic Myelogenous Leukemia,CML）是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病。在受累的細(xì)胞系中可找到Ph標(biāo)記染色體或（和）bcr/abl基因重排。基因結(jié)構(gòu)人abl基因位于9號染色體長臂，有1b、1a和2-11共12個外顯子。轉(zhuǎn)錄始自1b或1a，形成的兩種mRNA長度分別為7kb和6kb，合成的兩種蛋白質(zhì)分子量均約為145，前者定位于細(xì)胞膜，而后者主要在細(xì)胞核內(nèi)。abl主要結(jié)構(gòu)有N端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。SH2結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸殘基

2、，可結(jié)合DNA。abl蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。在G0期，abl-Rb蛋白復(fù)合物與DNA結(jié)合。在G1S轉(zhuǎn)變過程中，Rb被磷酸化，abl與之分離，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞進(jìn)入S期。bcr基因位于22號染色體長臂，有23個外顯子。蛋白產(chǎn)物分子量均為160。bcr蛋白第1-63個氨基酸是二聚體化結(jié)構(gòu)，參與bcr蛋白多聚體的形成。bcr蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，但詳細(xì)過程還不十分明確。bcr基因斷裂點集中在三個區(qū)域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和（-bcr）區(qū)域。abl基因斷裂位于第1或第2內(nèi)含子。因斷裂點不一，bcr/abl融合基因及其m

3、RNA和蛋白產(chǎn)物呈多樣性。CML的bcr基因斷裂點常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量為210kb。bcr基因在ALL中大約2/3為m-BCR位點。Ph1染色體和bcr/abl融合基因是CML的分子基礎(chǔ)，并可作為區(qū)分典型CML和非典型CML的診斷指標(biāo)。由于t(9；22)(q34；q11.2)而產(chǎn)生的費城染色體（Ph）在血液腫瘤中具有重要的診斷和預(yù)后意義，出現(xiàn)于90%以上的CML、30%的成人ALL、2%-10%的兒童ALL、以及少數(shù)的AML和MM患者。位于9q34的ABL基因與位于22q11的BCR基因相互易位，形成bcr/abl融合基因。此基因產(chǎn)生一種新的mRNA，編碼的蛋

4、白為P210。P210具有增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性，改變了細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動蛋白的功能，從而擾亂了細(xì)胞內(nèi)正常的信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞失去了對周圍環(huán)境的反應(yīng)性，并抑制了凋亡的發(fā)生。具有BCR/ABL融合基因的患者預(yù)后差。基因檢測3.1 Southern Blot即DNA印跡，可以對bcr-abl融合基因DNA重排進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。將經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，胚系DNA會產(chǎn)生特征性片段，但發(fā)生過基因重排的細(xì)胞DNA因酶切位點有所改變會產(chǎn)生有別于胚系的DNA酶切片段。大多數(shù)bcr基因的斷裂點集中于5.8kb的主要斷裂點集簇區(qū)（M-bcr）

5、。從白血病患者白細(xì)胞中抽提的基因組DNA，經(jīng)一組限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用取自M-bcr3和5端的bcr探針與之雜交。放射自顯影洗片后即可顯示所要檢測的條帶，對于CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對應(yīng)的條帶外，其他的條帶說明存在重排的bcr等位基因。3.2 RT-PCR采用異硫氫酸胍酚、氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，方法見參考文獻(xiàn)，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增bcr-abl基因接合區(qū)mRNA是檢測CML敏感而特異的方法，設(shè)計兩對引物，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增后產(chǎn)物10l，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。3.3

6、實時定量PCR利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值，然后根據(jù)待測樣本的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣本的起始拷貝數(shù)。另外bcr/abl融合基因編碼的蛋白P210可以用Western印跡或酶聯(lián)免疫反應(yīng)加以檢測。PML/RAR融合基因急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的一種特殊類型（M3），占所有AML病例的10%-15%。APL具有獨特的臨床表型及細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征。目前發(fā)現(xiàn)約95%的APL患者伴有異常染色體核型t(15;17)(q22;q21)，該易位使15號染色體上的PML基因與17號染色體上的RA

7、R基因發(fā)生相互易位形成PML/RAR融合基因，是APL的一個特異分子標(biāo)志。PML/RAR融合蛋白通過顯性負(fù)抑制作用抑制早幼粒細(xì)胞分化成熟，從而阻斷細(xì)胞分化導(dǎo)致持續(xù)增殖。全反式維甲酸（ATRA）和三氧化二砷能靶向降解PML/RAR融合蛋白，恢復(fù)野生型PML和RAR基因功能，解除其對基因轉(zhuǎn)錄的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分化和凋亡，使APL得到有效治療。ATRA與化療聯(lián)合使用可使APL的完全緩解率達(dá)90%-95%，并可使70%以上的患者得到長期生存。PML/RAR融合基因檢測可作為APL早期診斷、治療方案選擇及微小殘留病灶監(jiān)測的一項檢測手段。用熒光原位雜交方法或熒光定量RT-PCR方法來檢測PML/RAR融

8、合基因，的情況，可對融合基因進(jìn)一步具體分型。廣州安必平上海源奇TEL-AML1融合基因當(dāng)染色體12和21號發(fā)生易位形成TEL-AML1時,TEL的斷裂點位于內(nèi)含子5，AML1斷裂點80%-90%位于內(nèi)含子1(外顯子1和外顯子2間)，余則發(fā)生于內(nèi)含子2。TEL和AML1斷裂后,DNA修復(fù)時將TEL基因HLH區(qū)和幾乎整個AML1基因拼接在一起形成TEL-AML1融合基因，所表達(dá)TEL-AML1融合蛋白突出作用是抑制轉(zhuǎn)錄活性。白血病相關(guān)融合基因檢測試劑盒（TEL-AML1）品名：白血病相關(guān)融合基因檢測試劑（TEL-AML1）（RT-PCR法）廠商：上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司 TEL-AML1雜合體

9、的檢測不僅可以快速鑒定預(yù)后相關(guān)的分子marker，常被學(xué)者作為檢測MRD的標(biāo)記，可以據(jù)此判斷疾病的進(jìn)展、治療效果以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸等。 TEL-AML1融合基因陽性ALL的特點: 1、病年齡。t(12;21)的兒童ALL多發(fā)生在1-10歲,1-5歲者占76.2%。 2、免疫表型特征。所有的t(12;21)病人都表達(dá)B祖細(xì)胞免疫表型，以CD19、CD10陽性最為多見，偶見前-前B表型，未見成熟B細(xì)胞及T細(xì)胞表型。  3、與預(yù)后的關(guān)系。TEL-AML1表達(dá)陽性組屬高危ALL的占13%，而陰性組屬高危ALL的占68%，說明TEL-AML1往往與低危ALL相關(guān)，預(yù)后較好；TEL-AML1陽性組地塞

10、米松誘導(dǎo)實驗陽性率為88%，而陰性組僅為38%，陽性組地塞米松誘導(dǎo)實驗效果明顯優(yōu)于陰性組。TEL-AML1融合基因 t(12;21)(p12;q22)易位產(chǎn)生的TEL-AML1融合基因主要見于25%B-系急性淋巴白血病的兒童和3%成人中。   TEL基因習(xí)慣上又稱ETV6(ETS-variant gene 6)，基因位于12p13上,全長300 kb, 編碼452個氨基酸，其所編碼蛋白由螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)和ETS結(jié)構(gòu)域組成。 AML1又稱CBF2,是核心結(jié)合因子CBF(core bindingfactor)的亞基,基因定位于21q22

11、上,全長超過260 kb，含有12個外顯子，表達(dá)480氨基酸的核磷酸蛋白，TEL和AML1的融合使AML1編碼的CBRa失去與DNA結(jié)合能力或不能正常轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮激活靶基因的作用,即AML1從轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄抑制因子。檢測原理： 本試劑盒由白血病TEL-AML1融合基因特異性引物、熒光探針、逆轉(zhuǎn)錄酶以及Taq酶等成分組成，采用一步法在同一反應(yīng)管中相繼完成逆轉(zhuǎn)錄和PCR過程，從而檢測人骨髓標(biāo)本中的白血病TEL-AML1融合基因RNA；同時使用尿苷酶（UNG）防污染體系, 經(jīng)加熱可選擇性地降解PCR產(chǎn)物中的U-DNA，以防止先前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；采用內(nèi)參基因，控制整個試劑盒檢測過程及標(biāo)本的

12、有效性。 實驗操作步驟說明：  產(chǎn)品特性說明： 1.本試劑盒能從抗凝骨髓提取的RNA中檢測TEL-AML1的相關(guān)融合基因，最低檢出量達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。 2.試劑盒對各精密度質(zhì)控品，在相應(yīng)的反應(yīng)液中重復(fù)做10次，均能檢出，且其實驗數(shù)據(jù)CV值均小于10%。CBF/MYH11融合基因M4Eo是M4型白血病中的一種特殊類型，約占急性粒細(xì)胞白血病的10%?；颊吖撬柚辛Ｏ岛蛦魏讼翟技?xì)胞同時惡性增生，嗜酸粒細(xì)胞占5%30%。含有CBF-MYH11融合基因的M4Eo患者預(yù)后較好。Inv(16) /t(16；16)(p13；q22)為急性髓系白血病(AML)-M4Eo的非隨機(jī)染色體異常

13、，16q22斷裂區(qū)受累基因CBF編碼CBF的亞單位，inv（16）/t(16；16)導(dǎo)致形成CBF/MYH11融合基因。inv(16)/t(16；16)(p13；q22)的結(jié)果是16號染色體長臂的CBF基因與短臂的平滑肌肌球蛋白重鏈1(MYH11)基因發(fā)生重排，形成CBF-MYH11和MYH11-CBF兩種融合基因，其中CBF-MYH11融合基因易促使白血病發(fā)病。CBF鏈不直接結(jié)合DNA，而是通過與CBF形成異二聚體來增加鏈與DNA結(jié)合的親和力，穩(wěn)定該異二聚體的穩(wěn)定性。目前已識別了一些CBF結(jié)合位點，它們存在于TCR、GM-CSF、GM-CSF受體、髓過氧化物酶及中性粒細(xì)胞彈性蛋白基因的調(diào)控區(qū)

14、，因此可能是由這些基因的表達(dá)失控而致白血病。CBF基因斷裂點恒定地位于3端編碼區(qū)的17個氨基酸處(nt495)，而MYH11基因的斷裂點存在5種不同方式，因此根據(jù)MYH11斷裂點的不同，CBF-MYH11轉(zhuǎn)錄本有5種不同的剪接方式， 迄今共發(fā)現(xiàn)10余種CBF/MYH11融合基因轉(zhuǎn)錄本，但最常見的為A型(即MYH11基因的斷裂點在于nt1921)，占80%，其余均少見。AML1 /ETO融合基因t（8；21）（q22；q22）是初治急性粒細(xì)胞白血病（AML）患者中常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，大約20%40%的AML-M2患者有t（8；21）（q22；q22），并且在M2b亞型中發(fā)生率高達(dá)90%以上。位

15、于染色體21q22的AML1基因與8q22的ETO基因融合，產(chǎn)生AML1/ETO融合基因。AML1/ETO融合基因是轉(zhuǎn)錄激活基因，導(dǎo)致細(xì)胞不斷增殖。臨床上t（8；21）白血病好發(fā)于青年和兒童（5%10%），主要與M2型密切相關(guān)，并且年齡越小發(fā)生率越高。t（8；21）代表預(yù)后較好的急性白血病類型，成人患者對治療反應(yīng)佳，完全緩解率高，中位生存時間長，但易復(fù)發(fā)；兒童患者的治療和預(yù)后不如成人患者理想。AML1/ETO融合基因可作為M2b診斷分型的標(biāo)志，以及微小殘留病灶監(jiān)測的一項檢測手段。AML：acute myelocytic leukemia急性髓細(xì)胞白血病，一類白血病的總稱，臨床中急性骨髓系白血病

16、可分為M0-M7共8種。M1 急性髓細(xì)胞白血病未成熟型M2 急性髓細(xì)胞白血病部分成熟型：（染色體和分子生物學(xué)檢驗）t（8；21）（q22；q22）易位是M2b的一種常見非隨機(jī)染色體重排，其檢出率高達(dá)90%。AML1基因重排可作為本病基因診斷的標(biāo)志。M3急性早幼粒細(xì)胞白血?。海ㄈ旧w及分子生物學(xué)檢驗）約70%90%的APL具有特異性的染色體易位t（15；17），是APL特有的遺傳學(xué)標(biāo)志，t（15；17）染色體易位使17號染色體上的維甲酸受體（PAR）基因發(fā)生斷裂。與15號染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病（PML）基因發(fā)生融合，形成PML-RAR融合基因。M4 急性粒單核細(xì)胞白血病M5 急性單核細(xì)胞白血

17、病M6 急性紅白細(xì)胞白血病M7 急性巨核細(xì)胞白血?。海ㄈ旧w檢驗）染色體有inv（3）或del（3）、+8、+21異常。M0急性微分化型粒細(xì)胞白血病E2A/PBX1融合基因白血病相關(guān)融合基因檢測試劑盒（E2A-PBX1）（RT-PCR法）廠商：上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司E2A-PBX1基因 t（1;19）易位見于25 %的嬰兒ALL 和成人ALL (兒童患者為主) ,免疫亞型主要為前B-ALL，易位產(chǎn)生E2A一PBX融合基因。   根據(jù)斷裂點的不同，E2A-PBX1存在兩種亞型。 有該融合基因表型的患者易發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，預(yù)后差。因此E2A-PBX1融合基

18、因是個高危的分子生物學(xué)標(biāo)志，與早期的治療失敗有密切關(guān)系。對該融合基因進(jìn)行定量檢測可以輔助臨床的預(yù)后判斷以及對疾病進(jìn)行實時檢測，以隨時調(diào)整化療方案。檢測原理： 本試劑盒由白血病E2A-PBX1融合基因特異性引物、熒光探針、逆轉(zhuǎn)錄酶以及Taq酶等成分組成，采用一步法在同一反應(yīng)管中相繼完成逆轉(zhuǎn)錄和PCR過程，從而檢測人骨髓標(biāo)本中的白血病E2A-PBX1融合基因RNA；同時使用尿苷酶（UNG）防污染體系, 經(jīng)加熱可選擇性地降解PCR產(chǎn)物中的U-DNA，以防止先前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；采用內(nèi)參基因，控制整個試劑盒檢測過程及標(biāo)本的有效性。產(chǎn)品特性說明： 1.本試劑盒能檢測包括含E2A-PBX1所有2種剪接體。 2.本試劑盒能從抗凝骨髓提取的RNA中檢測E2A-PBX1的相關(guān)融合基因，最低檢出量達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。 3.試劑盒對各精密度質(zhì)控品，在相應(yīng)的反應(yīng)液中重復(fù)做10次，均能檢出，且其實驗數(shù)據(jù)CV值均小于10%。白血病30種融合基因檢測試劑盒本試劑盒適用于白血病中常見30種融合基因的檢測。包括MLL-AF9，M