自己整理實驗室常用技術(shù)

1、實驗室常用技術(shù)資料Lab. experiment technologyLQ細(xì)胞凍存1. 實驗前準(zhǔn)備：細(xì)胞室及工作臺紫外線照射30min；吹打管、中槍頭、中槍、培養(yǎng)液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集對數(shù)生長期細(xì)胞，在凍存前一天最好換液2用吸管吸出培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2遍吸出沖洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。3. 適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。4. 用吸管將培養(yǎng)液加入凍存管中，離心1000r/min，8分鐘。(可以留下一部分細(xì)胞懸液在培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng))5. 用中槍吸去上清液直至凍存管內(nèi)剩余1ml培養(yǎng)液，加入1

2、10ulDMSO(二甲基亞楓)，用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞均勻。6. 冷存管置于430min-2030min-801618小時(或隔夜)-液氮槽長期儲存。(-20不可超過1h，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。7記錄每一個冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時能夠找到每一個冷凍管。細(xì)胞復(fù)蘇冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常。1 材料：37 恒溫水浴箱，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶 2 步驟： 1、操作人員應(yīng)戴防護面罩

3、及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 3、取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化。4、常溫離心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)，去除上清夜，加入新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。5、取出細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)瓶，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。G418和篩選1、篩選之前由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。1.G418的配制：取

4、1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量（10000個/ml）接種入24孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，開始加藥。3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4.加G418篩選:吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。6

5、.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。一般400-左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。2、確定了最佳篩選濃度后做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1、轉(zhuǎn)染：選取對數(shù)生長期細(xì)胞，接入平皿（4X105個/ml,5ml）,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時按1：4密度傳代，接入12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至5070匯合。2、加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。3、換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選10

6、14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大。4、挑單克?。猴@微鏡下觀察單克隆，加入胰酶消化，將單克隆吸入96孔板（每孔接1個克?。?，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。（及早凍存）5、單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測目的基因是否存在。Lf2000轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前應(yīng)篩選合適的DNA:Lf2000轉(zhuǎn)染比例。一般按照1:1，2:1，3:1進行篩選。選擇轉(zhuǎn)染比率最高者為合適比例。篩選合適的細(xì)胞匯合度，看高匯合度還是低匯合度轉(zhuǎn)染效率高。篩選時注意觀察最佳轉(zhuǎn)染時間。以下操作以24孔板為例：1、 貼壁細(xì)胞： 轉(zhuǎn)染前一天，去不含抗生素的培養(yǎng)液5

7、00ul接于培養(yǎng)板(細(xì)胞密度0.5-2X105個/ml)，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合可到90-95%。懸浮細(xì)胞：準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前取即可，取500ul細(xì)胞懸液（4-8X105個/ml），培養(yǎng)液不含抗生素。2、 準(zhǔn)備混合物：A：將DNA稀釋于50ulOpti中，輕柔混勻。B：使用前輕柔混勻Lf2000，取合適劑量用50ulOpti 稀釋，室溫放置20min(注意：到stepC時要在25min內(nèi)完成)。C：加入A和B，輕柔混勻，室溫放置20min.3、 每孔中加入100ul混合物，前后晃動培養(yǎng)板，輕柔混勻。4、 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-48h，轉(zhuǎn)然后4-6h換液。PBS配制500ml NaCl 4g KCl 0.1g Na2

8、HPO4.12H2O 1.7907gKH2PO4 0.12g用400ml蒸餾水溶化，HCL/NaOH調(diào)PH至7.3-7.4，加水至500ml,高壓滅菌。胰酶配制 1、PBS 500ml 胰酶 1.25g EDTA 0.1g 攪拌4h2、濾膜、濾紙用雙蒸水浸泡2h,3、裝好濾器，勿按緊，包好，晾干后高壓。4、略烤干5、層流室過濾6、分裝到高壓過的小瓶7、-20C保存?zhèn)溆茫瑫r做無菌試驗。CuSO4配制 2% CuSO4 1500ml 硫酸銅 30g 雙蒸水 1500ml 高壓滅菌后，將液體倒入37C恒溫箱。雙抗配制 青霉素 100u/ml培養(yǎng)液，鏈霉素100ug/ml培養(yǎng)液 青霉素 100萬單位

9、 鏈霉素 1g PBS 100ml配制后濃度為10000u/ml，使用時取10ul/ml培養(yǎng)液。電泳緩沖液TAE配制 貯存液（50X），1 L Tris 堿 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 100ml 加水定容至1L ALB培養(yǎng)基配制（400ml）細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨 4g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 2g氯化鈉 4g預(yù)先在三角燒瓶中加入200ml雙蒸水，將上述配方加入其中，攪拌。5mol/L NaOH調(diào)PH至7.4.，加入雙蒸水定容至400ml。取200ml做固體培養(yǎng)基裝入A瓶，200ml做液體培養(yǎng)基。稱取3g瓊脂加入A瓶。另取一小瓶，加入100ml雙蒸水（配氨

10、芐）。將以上三瓶液體高壓，15psi,20min。配氨芐，過濾除菌。待A、B瓶冷卻至50oC，照100ug/ml濃度的氨芐，每瓶加入200ul，之后將A瓶液體倒入培養(yǎng)皿中，將B瓶和培養(yǎng)皿（倒置）貯存于4 oC。注：溶液尚未冷卻時，輕輕轉(zhuǎn)動，使溶解的瓊脂均勻分布，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。使用前1-2小時應(yīng)取出貯存的平皿。細(xì)胞組織RNA提?。ㄕ麄€過程在冰上進行）一、 溶解細(xì)胞（1） 貼壁細(xì)胞：吸去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗兩遍，加入胰酶消化，吸去胰酶加入PBS吹打，制成細(xì)胞懸液，將懸液移入EP管，離心1000 rpm,10min，棄上清。加入Trizol 1ml。反復(fù)吹打，使沉淀溶解。（可以先加上500ul吹

11、打，再加500ul充分混勻）（2） 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞離心，加入Trizol反復(fù)吹打，使沉淀溶解。Trizol量為1ml/5-10X106個細(xì)胞（動植物及酵母）或1ml/1X107個細(xì)菌。（3） 組織：將組織切成小塊（100mg），PBS沖洗干凈，裝入EP管，剪碎（非常碎，剪成組織懸液，時間可稍長些），加入上500ulTrizol吹打使組織溶解，再加500ul充分混勻。二、 水相與有機相的分離 將上述所得液體于室溫放置5min以使蛋白體解離，加入氯仿(0.2ml/ml Trizol),蓋上管 蓋，劇烈震蕩（不要用振蕩器）15s，室溫放置2-3min。2-8OC下離心12000rpmX15min,

12、離心后液體分三相：下層紅色的酚-氯仿相，中間及上層水相。RNA全部位于水相，體積約占加入Trizol的60%。三、 沉淀RNA將水相移入新的EP管（若要是提取DNA或蛋白質(zhì)保留有機相）加入異丙醇（0.5ml/ ml Trizol）,-20OC放置90min（可過夜），2-8OC離心12000rpmX10min，可見管底部凝膠狀沉淀，即為RNA。四、 洗滌RNA用75%酒精（1ml/ml Trizol）沖洗沉淀，2-8OC離心7500rpmX5min,棄上清。將所得沉淀置于空氣或真空（操作臺內(nèi)）中，干燥（注意不要過干，過干RNA難以溶解）。加入不含Rnase的水或0.5%SDS溶液溶解RNA。瓊

13、脂糖凝膠電泳檢測。-20OC保存。反轉(zhuǎn)錄RNA 3ul(量可改變) OLIGO 1ul 65OC水浴，5minH2O 5ul(量可變)冰上靜置1min5Xbuffer 4ulRninhibitor 1ulDNTP 2ul 全部取好混勻后再分加M-MVLV 1ul混勻，瞬離，42OC水浴60min70OC水浴5min,終止反應(yīng)PCRH2O 12.2ulBuffer 2.5ul 19.2ulDNTP 2.5ulMgCL2 2ul上游引物 0.75ul 25ul下游引物 0.75ulTAQ 0.3ulcDNA 4ul 石蠟封口，用PCR儀器，設(shè)定PCR條件。待反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因表達。

14、 ATF5PCR條件：94OC 5min94OC 30s55OC 30s 35cycle72OC 30s72OC 10min瓊脂糖凝膠電泳1、 制膠：稱取1.2g瓊脂糖（跑PCR產(chǎn)物時膠的濃度可大些1.5-1.8g）,加入100ml 0.5X TAE，加熱融化后冷卻至60OC左右，加入5ulEB，混勻。倒入膠板，除去氣泡。冷卻30min。硬化后放入電泳槽。（用不完可用保鮮膜包好放入4OC保存）。電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液0.5X TAE，使液面高出凝膠表面1-2mm。2、 上樣：取5ul樣品與上樣緩沖液按4：1混勻，用微量加樣器小心加入凝膠樣品孔內(nèi)，注意勿溢出孔外。3、 電泳、紫外光檢測和分析接通電

15、源，電壓為5v/cm。電泳完成后，切斷電源，紫外燈下觀察條帶。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（操作過程需嚴(yán)格在無菌罩內(nèi)操作）1XTSS兩步轉(zhuǎn)化法1、 菌種的復(fù)蘇：用無菌鉑絲直接挑取凍存的大腸桿菌菌株，在LB瓊脂平板表面劃線，（同時在ALB固體培養(yǎng)基劃板，驗證大腸桿菌，正常不生長）置37oC培養(yǎng)12-16小時。2、 從培養(yǎng)板中挑取單個菌落轉(zhuǎn)到3ml LB液體培養(yǎng)基中，于37oC搖床震搖,培養(yǎng)過夜直到OD值約0.6再轉(zhuǎn)入含有10mlLB（按比例1：100接）液體培養(yǎng)基的燒瓶中劇烈震搖4h,200rpm/min。3、 取1ml細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到EP管中，冰上靜置10min,離心3500rpmX5min,棄上清。（注意分組

16、）4、 加入100ulTSS溶液，反復(fù)輕柔吹打以重懸菌液（打開細(xì)胞壁）。5、 加入連接產(chǎn)物1ul(體積不能超過10ul)，輕輕混勻后水浴40min。6、 42oC熱休克90s。7、 冰浴2min，以冷卻細(xì)胞。8、 于EP管中加入100ul 37預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，37oC震搖30min。9、 將100ul菌液均勻涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。37oC培養(yǎng)12-16h。若所轉(zhuǎn)化質(zhì)粒可用a-互補篩選重組陽性克隆，則加入80ul/40ul X-Gal(20mg/ml)和8ul/4ul IPTG(20mg/ml),混勻后涂板。10、 將平板置4oC數(shù)小時后，觀察培養(yǎng)結(jié)果（若非藍白斑選擇質(zhì)粒無需此

17、步）。實驗設(shè)計1、 轉(zhuǎn)化時設(shè)對照組（不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒）和轉(zhuǎn)化組（轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒）2、 第9步時，對照組分別在LB固體培養(yǎng)基和ALB固體培養(yǎng)基上涂板，轉(zhuǎn)化組只需用ALB固體培養(yǎng)基3、 預(yù)期結(jié)果：對照組在LB固體培養(yǎng)基生長旺盛，在ALB固體培養(yǎng)基上不生長；轉(zhuǎn)化組在ALB固體培養(yǎng)基生長。質(zhì)粒DNA的分離與純化 堿裂解法小量提取質(zhì)粒材料 LB液體培養(yǎng)基 STE溶液（0.1M NaCl，10mM Tris-HCl PH8.0，1mM EDTA） Solution I溶液（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH8.0，10mM EDTA） Solution溶液（0.2M NaOH，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)

18、配） Solution溶液（5M乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml） 3M乙酸鈉溶液pH 5.2、純水、無水乙醇、70%乙醇 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、TE緩沖液（10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA）方法 1、挑取含質(zhì)粒的宿主菌單個菌落接種于5ml ALB液體培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)20小時以上，至OD600約為0.5。 2、將1.53ml菌液轉(zhuǎn)入EP管中，12000rpm離心2分鐘沉淀菌斑，棄上清，倒置于吸水紙上是液體流盡。 3、加入預(yù)放置于4的STE溶液100ul重懸菌斑，12000rpm離心1分鐘，棄上清，倒置于吸水紙上是液體流盡。

19、4、加入4的100ul的Sol I重懸菌斑，必要時可振蕩重懸，4放置510分鐘。 5、加入200ul新鮮配制的Sol，倒置混勻510次，冰上放置23min（勿振），使細(xì)菌裂解。 6、加入150ul預(yù)置4的Sol，溫和顛倒數(shù)次混勻5sec，冰上放置5min，使質(zhì)粒DNA復(fù)性。然后15000rpm離心10分鐘，上清入新EP管，勿吸沉淀。 7、加入等體積（約450ul）的苯酚/氯仿/異戊醇振蕩混勻，15000rpm離心5min，將上層水相入新EP管，再加等體積的氯仿，振蕩混勻，15000rpm離心5min，將上層水相入新EP管。 8、上清入新管，加入二倍體積的預(yù)置于20的無水乙醇，再加入原液1/10

20、體積的3M NaAc，顛倒混勻，20放置1小時，以沉淀質(zhì)粒DNA。 9、15000rpm離心10min，將上清去掉，再加入1ml 70%的乙醇，沿管壁加入，8000rpm離心10min，小心將上清棄去。 10、在空氣中完全干燥后加入純水或TE緩沖液30ul溶解沉淀，37水浴30min后放置20保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)粒提取試劑的配制Solution：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris-HCL（pH8.0）；10mmol/L EDTA配制方法：200mmol/L 葡萄糖 25ml （葡萄糖 0.99085g） 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 2ml 1mmol/L Tris-

21、HCL（pH8.0） 2.5ml 加ddH2O定容至100ml, 高壓蒸汽滅菌15min, 貯存于4。Solution ：200mmol/L NaOH；1% SDS（現(xiàn)用現(xiàn)配）配制方法： 5mmol/L NaOH 40ul 10% SDS 100ul ddH2O 860ulSolution ：5mol/L乙酸鉀 60ml；冰乙酸11.5ml；ddH2O 28.5ml；PH4.8配制方法： 乙酸鉀 29.442g 冰乙酸 11.5ml 加ddH2O定容至100ml，貯存于4。STE緩沖液:10mmol/L Tris-HCL（pH8.0）； 0.1mol/L NaCL；10mmol/L EDTA

22、（pH8.0）配制方法：NaCL 0.5844g1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 1ml0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.2ml加ddH2O定容至100ml, 高壓蒸汽滅菌15min, 貯存于4。10% SDS（十二烷基磺酸鈉） SDS 10g ddH2O 80ml 加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.2，加ddH2O定容至100ml。 (注：SDS為表面活性劑，稱量時要戴面罩。10% SDS無須滅菌。) 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） Tris 堿 12.114g 濃鹽酸 5.03ml ddH2O 80ml 用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0，補d

23、dH2O定容至100ml。0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） EDTA- Na 18.61g ddH2O 80ml 在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0（約需2gNaOH）ddH2O 定容至100ml，高壓滅菌備用。 (注：EDTA二鈉鹽需加NaOH將pH至調(diào)至接近8.0時才能完全溶解。)3mol/L 乙酸鈉（pH5.2） 冰乙酸鈉 40.81g ddH2O 80ml 用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2，ddH2O定容至100ml，高壓滅菌備用。 質(zhì)粒小提試劑盒（所有過程在室溫下進行）E.Z.N. ATM Plasmid Mini Kit I自 備 物品：13000

24、15;g轉(zhuǎn)離心機 無菌1.5ml離心管（4個）實驗前準(zhǔn)備：將RNaseA加入到Solution瓶中，并置于4保存。 用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer。 使用前檢查SolutionII，SolutionIII有無結(jié)晶析出，如果有將其37溫育，使其溶解。1、 挑取凍存的含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種ALB固體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)至長出單菌落。 挑取含有質(zhì)粒的大腸桿菌（DH5、JM109）單克隆，接種于1-5ml的ALB中，37，300rpm活化12-16h 。2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室溫離心1min，棄上清。3、 加入250ul Solution I/RNaseA,吹打或渦旋重懸

25、菌斑（吹打至看不到固體顆粒）。<充分重懸有利于提高產(chǎn)量>4、 加入250ul Solution II，輕柔顛倒混勻數(shù)次，清洗裂解產(chǎn)物<禁用振蕩器，用力過猛會導(dǎo)致染色體DNA斷裂，Solution II蓋子要擰緊>，可室溫靜置2min（管中拉絲，水膜形成）。5、 加入350ul Solution III，輕柔顛倒混勻數(shù)次，直至白色絮狀沉淀生成。<加入Solution III后立即混勻，必須完全混勻 > 6、 13000×g，室溫離心10min。（迅速進行下一步）7、 準(zhǔn)備柱子，向柱內(nèi)加入100-200ul BufferGPS, 10000g離心2mi

26、n,去除 BufferGPS8、 將上層清夜小心加入干凈的 HiBind Miniprep Column(1)將HiBind Miniprep Column(1)套入2ml收集管注意不要混入沉淀，確保沒有細(xì)菌通過柱子。10000g室溫離心1min,使液體完全通過柱子。9、 棄濾液，重新使用離心管。<將濾液暫存于另一離心管>向柱子中加500ul Buffer HB，10000×g，室溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。10、 向柱子中加入700ul無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，10000×g，室溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。11、 向

27、柱子中加入700ul無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，10000×g，室 溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。12、13000×g，室溫離心2min，離心空柱子以除去柱子內(nèi)的酒精。13、將柱子放入干凈的1.5ml離心管，加入30-50ul Elution Buffer(10Mm Tris-HCl,PH8.5)或高壓過的雙蒸水到柱子上，室溫靜置1-2min, 13000×g，室溫離心1min，洗滌DNA，將所得DNA分裝入EP管，-20保存。（可以進行第二次離心，將殘余的質(zhì)粒洗脫，但是濃度很低）14、用瓊脂糖凝膠電泳測提取質(zhì)粒大小，用紫外分光光度計檢

28、測質(zhì)粒濃度。DNA濃度=A260 X 50 ug/mlMTT材料： 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、MTT（5mg/ml,濾過除菌）、培養(yǎng)板、大、中槍和槍頭、EP管、5ml離心管、細(xì)胞計數(shù)板、DMSO步驟：1、 吸掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液。2、 加入適量的預(yù)溫PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，吸掉PBS。3、 加入0.25%胰酶，以剛好覆蓋瓶底為宜，輕輕左右搖動培養(yǎng)瓶。4、 鏡下觀察，待細(xì)胞消化變圓豎起培養(yǎng)瓶，吸掉胰酶。5、 加入含10%胎牛血清的1640，輕輕反復(fù)吹打，使細(xì)胞脫落形成單細(xì)胞懸液。6、 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，吹打混勻。7、 倒置顯微鏡計數(shù)。8、 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個/ml，（取

29、部分懸液于一新的5ml離心管，家培養(yǎng)液）9、 轉(zhuǎn)移細(xì)胞于96孔板，每孔200ul，每接一空混勻5ml管。（每種藥物3塊板，以得3 個平行測定結(jié)果）10、 37培養(yǎng)24h。（細(xì)胞進入對數(shù)生長期時開始加藥）11、 換為不含血清的164012、 繼續(xù)培養(yǎng)24h。13、 取8個新EP管，做好標(biāo)記，每管加入相應(yīng)量的無血清培養(yǎng)基14、 向EP管中加藥，從最高濃度到最低濃度稀釋（最高濃度下多數(shù)細(xì)胞被殺死，最低濃度下不會殺死細(xì)胞，5倍一列稀釋，共制備8個濃度），充分混勻。15、 取出96孔板中的細(xì)胞，以每一濃度重復(fù)3個復(fù)孔，按不同濃度做好標(biāo)記。16、 吸棄孔中培養(yǎng)液（可傾斜平板），每孔加入200ul含有藥物的

30、培養(yǎng)基。17、 放入培養(yǎng)箱，按要求培養(yǎng)一定時間（SKOV3一般作用48小時）18、 藥物作用結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入5mg/ml MTT（錫紙包裹的1.5ml離心管中），每孔20ul。19、 37孵育4-8h（錫箔包板），以形成藍色甲贊結(jié)晶。20、 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，小心吸掉上清。21、 每孔加入150ulDMSO，溶解MTT-甲贊結(jié)晶。22、 待結(jié)晶充分混合后即可上機檢測（分光光度計490nm） 調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO） 對照孔（細(xì)胞、藥物、培養(yǎng)基、MTT、DMSO） 以藥物濃度為橫坐標(biāo)（x軸）、吸光值為縱坐標(biāo)（y軸），平均吸光值作為對照吸光值。 對照組吸光值減少一半時所需藥物濃

31、度為IC50濃度 試驗孔吸光值/對照組吸光值×100=抑制百分率 以抑制百分率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Guava Nexin Reagent標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞并描述早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞/死亡細(xì)胞間的差異步驟：1、 培養(yǎng)細(xì)胞：包括陽性和陰性對照組（適當(dāng)時間誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）2、 將Guava Nexin Reagent 從冰箱取出，恢復(fù)至室溫3、 準(zhǔn)備用Guava Nexin Reagent孵育的所有細(xì)胞標(biāo)本，保證準(zhǔn)備的細(xì)胞樣本中至少含 1%BSA、1%FBS或10%NHS 將細(xì)胞上清和脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。 用胰酶消化平皿內(nèi)的細(xì)胞，吸出絕大多數(shù)胰酶，加入含10%血清的1640

32、中和胰酶，并輕柔吹打至單細(xì)胞懸液。 將平皿內(nèi)的單細(xì)胞懸液移植15ml離心管內(nèi)，再次吹打均勻。 1500rpm，離心10min，棄上清。 加100ul 5%1640重懸細(xì)胞并移入1.5ml EP管中（細(xì)胞濃度在2×104-1×105/sample或2×105-1×106/ml），<李老師：取每孔細(xì)胞量的1/3-1/4，則加入300ul1640重懸細(xì)胞，吹打均勻取100ul加入EP管>4、 每管加入100ul Guava Nexin Reeagant （若PS表達多可加125ul甚至150ul，同時減少培養(yǎng)液的量，100-50ul）5、 室溫下避

33、光孵育20min（錫紙包裹）6、 按Guava系統(tǒng)獲取標(biāo)本。<取未加處理的正常細(xì)胞做gate> 理想結(jié)果：左下象限：活細(xì)胞 AnnexinV-PE(-) 7-AAD(-) 右下象限：凋亡早中期細(xì)胞 AnnexinV-PE(+) 7-AAD(-) 右上象限：凋亡晚期細(xì)胞 AnnexinV-PE(+) 7-AAD(+) 左上象限：絕大多數(shù)為核碎片AnnexinV-PE(-) 7-AAD(+)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(室溫)TM Endo-FreePlasmid Maxi Kit （6）自備物品：30005000×g轉(zhuǎn)離心機 無菌50ml離心管（4-6個） 無水乙醇 42水浴鍋

34、無菌吸水紙實驗前準(zhǔn)備： Buffer N3提前置于冰上。 將RNaseA加入到Solution瓶中，并置于2-8保存。 用160ml無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer。 若質(zhì)粒大于10kb,70預(yù)熱Elution Buffer（分裝出3-4ml用5ml離心管預(yù)熱）。 調(diào)節(jié)65烤箱。步驟： 細(xì)菌培養(yǎng)1、 挑取凍存的含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于ALB固體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)至長出 單菌落。 挑取含有質(zhì)粒的大腸桿菌（DH5、JM109）單克隆，接種于2-5ml的ALB中，37，300rpm活化8h 。 取適量（1:500）接入200ml提前溫育的ALB培養(yǎng)基（氨芐50ug/ml），37搖床培養(yǎng)12-

35、16h（OD達到1.5-2.0為好）<高copy接入200ml ALB,低copy接入400ml ALB> 堿性SDS裂解2、 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml離心管，30005000×g，室溫離心10min。<重復(fù)將所有培養(yǎng)液離心完>3、 棄盡上清，用無菌吸水紙吸干容器的余液，加入10ml Solution I/RNaseA,吹打或渦旋重懸菌斑（吹打至看不到固體顆粒）。<充分重懸有利于提高產(chǎn)量>4、 加入10ml Solution II，輕柔顛倒混勻10-15次，清洗裂解產(chǎn)物<禁用振蕩器，用力過猛會導(dǎo)致染色體DNA斷裂，Solution II蓋子要擰緊

36、>，可室溫靜置2min（管中拉絲，水膜形成）。5、 加入5ml 冰浴的Buffer N3（沉淀菌體蛋白），輕柔顛倒混勻數(shù)次，直至白色絮狀沉淀生成。（過程中室溫孵育2-3min，時常顛倒混勻）<必須完全混勻，不能呈褐色并粘稠> 準(zhǔn)備Lysate Clearance ,將注射器活塞拔出，放到試管架上。6、 準(zhǔn)備HiBind Maxi Column，將柱子放入50ml收集管（提取盒提供），柱內(nèi)加入5ml BufferGPS，室溫放置3-10min。30005000×g，室溫離心5min，棄洗脫液將柱子在放回50ml收集管。 Lysate Clearance Filter

37、Syringe 清洗溶解產(chǎn)物7、 立即將菌液倒入Lysate Clearance Filter Syringe，靜置5min（可多靜置一會），白色沉淀飄到頂部（不完全到頂），用一個新的50ml離心管收集溶解產(chǎn)物，將活塞放回注射器筒。8、 繼續(xù)將注射氣筒保持在50ml離心管上，緩緩?fù)苿踊钊?，將裂解液打入試管中，殘余白色沉淀不要強制通過濾器。 ETR Solution 去除內(nèi)毒素9、 加入0.1倍體積的ETR Solution（藍色）到過濾后的溶液中，顛倒混勻7-10次，冰上靜置10-20min，放置時不斷顛倒（液體加入ETR后變渾濁，冰上靜置后變澄清）。10、 42孵育5min ,溶液重新變渾濁

38、，30005000×g，室溫離心5min，ETR在管底形成藍色層（若ETR懸浮在溶液中，則將試管室溫放置5-10min）。11、 小心地將上層水相轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中，加入0.5倍體積的室溫?zé)o水乙醇，輕柔顛倒混勻5-6次，室溫孵育2min。 HiBind Maxi Column 純化質(zhì)粒DNA 12-18步用水平轉(zhuǎn)頭可提高產(chǎn)出率，室溫離心。12、 從11步的上清溶液中取20ml加入HiBind DNA Maxi Column。柱子放在50ml離心管上，30005000×g，室溫離心3-5min，棄濾液，重新使用離心管。<將濾液暫存于另一離心管>13、 重復(fù)

39、12步直到所有清夜通過柱子，棄濾液，重新使用離心管。14、 向柱子中加入10ml Buffer HB，30005000×g，室溫離心3-5min，棄濾液，重新使用離心管。15、 向柱子中加入15ml無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，30005000×g，室溫離心3-5min，棄濾液，重新使用離心管。16、 向柱子中加入10ml無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，30005000×g，室溫離心3-5min，棄濾液，重新使用離心管。17、 6000×g，室溫10-15min，離心空柱子以除去柱子內(nèi)的酒精。 從 DNA Maxi Colu

40、mn中洗滌質(zhì)粒DNA（為了快速洗滌18步可省略）18、 干燥柱子：65烤10-15min（用錫紙包住柱子）19、 將柱子放入干凈的50ml離心管，加入3ml（第一次加2ml，第二次加1ml）Endotoxin-Free Elution Buffer 到柱子上，室溫靜置2min, 6000×g，室溫離心5min，洗滌DNA，將所得DNA分裝入EP管，-20保存。20、 用瓊脂糖凝膠電泳測提取質(zhì)粒大小，用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度。QIAGEN質(zhì)粒大提提取前準(zhǔn)備：1. RNase A加入Buffer P1,終濃度100ug/ml,2-8保存。2. 檢查Buffer P2中SDS狀態(tài)（低溫

41、析出），必要的話37預(yù)熱。3. 4遇冷Buffer P3。準(zhǔn)備材料:1. 標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)物品（接種環(huán)、培養(yǎng)皿、搖床等）。2. 架子（垂直放置柱子。）3. 冰4. 70%酒精5. 異丙醇6. 質(zhì)粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）7. 1.5-2.0ml離心管8. 4離心機提取步驟：A)細(xì)菌培養(yǎng)、收獲和裂解1.新鮮培養(yǎng)板中挑取單克隆于2-5ml ALB培養(yǎng)基，37，300rpm培養(yǎng)8h。（使用的培養(yǎng)器皿體積需大于四倍的培養(yǎng)基體積）2.按1/500-1/1000比例接種于ALB培養(yǎng)基，37，300rpm培養(yǎng)14-16h。高拷貝質(zhì)粒：取100-200ul接種于100ml ALB培

42、養(yǎng)基。低拷貝質(zhì)粒：取250-500ul接種于500ml ALB培養(yǎng)基。（使用的培養(yǎng)器皿體積需大于四倍的培養(yǎng)基體積。培養(yǎng)的細(xì)菌密度達到3-4X109個/ml，這樣得到的菌斑重量為3g/L培養(yǎng)基）3.將獲得的菌液4，6000g離心15min。（如果此時你想停止提取，可將菌斑凍于-20）4.加入10ml Buffer P1充分重懸菌斑。（確保使用的容器足夠裝下裂解液，確保使用前加入RNase A，如果Buffer P1內(nèi)加入LyseBlue,使用前輕柔晃動瓶身以確保LyseBlue混勻，必須確保菌斑充分混勻）5.加入10ml Buffer P2，輕柔顛倒4-6次混勻徹底，室溫（15-25）孵育5mi

43、n。（不能渦旋混勻，這樣會使基因斷裂。此時溶液變粘稠。不要使裂解反應(yīng)過程超過5min。加入Buffer P2后立即扣上蓋子，避免空氣中的CO2使其酸化。如果Buffer P1內(nèi)加入LyseBlue，那么加入Buffer P2后細(xì)菌懸液變藍，如果懸液不變藍或仍可見棕色斑塊，則繼續(xù)混勻直到顯色）6.加入10ml Buffer P3，立刻輕柔顛倒4-6次徹底混勻，冰上孵育20min。（使用預(yù)冷的Buffer P3和冰浴可以加快沉降，加入Buffer P3后可見白色絮狀沉淀，沉淀中含有基因組DNA，蛋白質(zhì)，細(xì)菌碎片和KDS。裂解液需徹底混勻以確保鉀、硫酸鹽沉淀。如果混合物依然有粘性，那么繼續(xù)混勻徹底中

44、和溶液。如果使用LyseBlue，藍色溶液變清。）B)提取上清7.以4，不低于20000g離心30min，立刻取含有質(zhì)粒的上清。（離心前，需再次混勻樣品。離心需要在非玻璃器皿中進行，例如聚丙烯。離心后上清液清透。）8.以4，不低于20000g離心15min再次離心，取上清。移取120ul上清作為樣品1，用于分析以確定生長和裂解的條件是否合適C)用QIAGEN-tip連接、清洗和洗提質(zhì)粒DNA9.向QIAGEN-tip 500中加入10mlBuffer QBT平衡柱子，通過重力使其自然流空。（QIAGEN-tip需要徹底流干，此過程不需要看守，當(dāng)液面達到柱子上部時自然會停止。）10.將從第8步獲

45、取的上清移入柱子，使其自然流下通過濾膜。（上清應(yīng)該立刻移入柱子。如果時間停滯過長或者因為蛋白的繼續(xù)沉降使其渾濁，在放入柱子之前需要重新離心。）移取120ul濾液作為樣品2. 11.用2X30ml Buffer QC沖洗柱子。（Buffer QC自然通過柱子，第一遍沖洗足以將絕大多數(shù)質(zhì)粒污染物洗脫，但是當(dāng)提取量大時，第二遍就非常重要。）移取240ul濾液作為樣3。12.用15ml Buffer QF洗脫DNA。（用15ml或50ml離心管收集洗脫液。不推薦使用聚碳酸酯離心管，因為不能耐受后續(xù)步驟使用的酒精。注：如果產(chǎn)物大于45-50Kb，65預(yù)熱洗脫Buffer有助于提高產(chǎn)量。） 移取120ul

46、濾液作為樣品4，用于分析。D)沉淀、清洗、溶解DNA13.加入10.5ml（0.7倍體積）室溫異丙醇到洗脫液中沉淀DNA。立刻混勻，4，不低于15000g離心30min。小心棄上清。（一次性錐形底離心管可以選擇4，5000g離心60min。異丙醇沉淀具有玻璃外觀，比酒精沉淀的絮狀含鹽沉淀難發(fā)現(xiàn)。異丙醇沉淀貼壁不牢，棄上清時要非常小心。）14.加入5ml室溫70%酒精，不低于15000g離心10min。小心棄上清避免碰到沉淀。（一次性錐形底離心管可以選擇4，5000g離心60min。70%酒精用來洗脫沉淀的鹽，并且揮發(fā)的乙醇可以移走殘余的異丙醇，是DNA提取更容易。）15.空氣中干燥沉淀5-10

47、min,用合適體積的質(zhì)粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）溶解DNA。（溶解DNA時清洗側(cè)壁，充分收集，特別是使用玻璃器皿時。應(yīng)避免使用移液器反復(fù)吹打促進DNA混勻，這可能會導(dǎo)致DNA斷裂。沉淀過于干燥會導(dǎo)致DNA難以溶解。DNA溶液最好保存在微堿性環(huán)境中，酸性Buffer難以溶解DNA。）質(zhì)粒小提試劑盒（所有過程在室溫下進行）E.Z.N. ATM Plasmid Mini Kit I自 備 物品：13000×g轉(zhuǎn)離心機 無菌1.5ml離心管（4個）實驗前準(zhǔn)備：將RNaseA加入到Solution瓶中，并置于4保存。 用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer。

48、 使用前檢查SolutionII，SolutionIII有無結(jié)晶析出，如果有將其37溫育，使其溶解。1、 挑取凍存的含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種ALB固體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)至長出單菌落。 挑取含有質(zhì)粒的大腸桿菌（DH5、JM109）單克隆，接種于1-5ml的ALB中，37，300rpm活化12-16h 。2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室溫離心1min，棄上清。3、 加入250ul Solution I/RNaseA,吹打或渦旋重懸菌斑（吹打至看不到固體 顆粒）。<充分重懸有利于提高產(chǎn)量>4、 加入250ul Solution II，輕柔顛倒混勻數(shù)次，清洗裂解產(chǎn)物<禁用振蕩

49、器， 用力過猛會導(dǎo)致染色體DNA斷裂，Solution II蓋子要擰緊>，可室溫靜置2min（管中拉絲，水膜形成）。5、 加入350ul Solution III，輕柔顛倒混勻數(shù)次，直至白色絮狀沉淀生成。<加入Solution III后立即混勻，必須完全混勻 > 6、 13000×g，室溫離心10min。（迅速進行下一步） （柱子使用前加100-200ul Buffer GPS，室溫10000g 離心2min,去除GPS）7、 將上層清夜小心加入干凈的 HiBind Miniprep Column(1)將HiBind Miniprep Column(1)套入2ml收

50、集管注意不要混入沉淀，確保沒有細(xì)菌通過柱子。10000g室溫離心1min,使液體完全通過柱子。8、 棄濾液，重新使用離心管。<將濾液暫存于另一離心管>向柱子中加500ul Buffer HB，10000×g，室溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。9、 向柱子中加入700ul無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，10000×g，室溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。10、 向柱子中加入700ul無水乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，10000×g，室溫離心1min，棄濾液，重新使用離心管。11、 13000×g，室溫離心

51、2min，離心空柱子以除去柱子內(nèi)的酒精。12、 將柱子放入干凈的1.5ml離心管，加入30-50ul Elution Buffer(10Mm Tris-HCl,PH8.5)或高壓過的雙蒸水到柱子上，室溫靜置1-2min, 13000×g，室溫離心1min，洗滌DNA，將所得DNA分裝入EP管，-20保存。（可以進行第二次離心，將殘余的質(zhì)粒洗脫，但是濃度很低）13、 用瓊脂糖凝膠電泳測提取質(zhì)粒大小，用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度。14、 DNA濃度=A260 X 50 ug/mlWestern blot的原理、操作及注意事項原理：通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑

52、（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進行檢測，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的選擇和制備A：樣品的制備1 組織： 組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20保存，用時取出，直接溶解上樣。2 細(xì)胞：細(xì)胞的處理方法： 離心收集細(xì)胞或者直接

53、往細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20保存，用時取出，直接溶解上樣。3 分泌蛋白的提?。ㄌ乩褐苯邮占置谝海尤?ME、溴酚藍制樣。B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因1.雙縮脲法：雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進行定量測定。2.Lowry法：此法是雙縮脲法的進一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個絡(luò)合物還原