prtP編碼的細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌粘附及免疫作用的影響

1、prtP 編碼的細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌粘附及免疫作用的影響干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)屬于乳桿菌屬 (Lactobacillus),是可用于保健食品的益生菌 , 能夠耐受人體的防御機制, 其中包括口腔中的酶、 胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等。 干酪乳桿菌具有促進細(xì)胞分裂, 產(chǎn)生抗體免疫及預(yù)防癌癥等生理功能。由于干酪乳桿菌對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效, 現(xiàn)成為人們研究、開發(fā)、生產(chǎn)的焦點。 最新研究發(fā)現(xiàn) , 在乳酸乳球菌中 , 細(xì)胞外膜的絲氨酸蛋白酶 lactocepin能介導(dǎo)乳酸菌的黏附作用, 而且在某些乳酸菌中 ,lact

2、ocepin 對腸道炎性具有良好的抑制作用。它能夠降解部分炎性細(xì)胞因子。 因此對這種細(xì)胞表面蛋白的深入研究不但可以提高益生菌的益生功能, 且可為開發(fā)腸道免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論基礎(chǔ)。1 干酪乳桿菌 21858prtP 基因突變株構(gòu)建及其生物學(xué)特征。根據(jù) GenBank信息 , 細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin由 prtP 基因編碼 , 本文通過通過 -Red重組技術(shù) , 替換干酪乳桿菌prtP 基因 , 構(gòu)建干酪乳桿菌 (21858)prtP基因突變株(21858 ) 。通過測定兩株乳酸菌的基本生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)21858和 21858 生長曲線類似 ,21858 自凝聚率在各個時間點都低于2

3、1858, 且時間越長差距越明顯。 21858與四種致病菌的共凝聚率大于21858。21858的疏水率為為44.1 ± 1.5%, 大于 21858 疏水率 23.9 ±0.62%, 且具有顯著差異 (P<0.05)。對致病菌的抑制效果21858 好于 21858, 但都沒明顯差異 (P>0.05)。提示 prtP 基因?qū)Ω衫胰闂U菌生長曲線無影響, 敲除 prtP 基因會降低干酪乳桿菌的自凝聚率和與治病菌的共凝聚率, 會提升疏水率 , 對致病菌抑制性有降低趨勢。 2 21858prtP 基因突變株 21858粘附能力研究通過建立體內(nèi)外粘附模型測定

4、 21858 和 21858對腸粘液、細(xì)胞及小鼠腸道的粘附能力。結(jié)果顯示 21858 小腸粘液粘附率4.638 ±2.3%,21858小腸粘液粘附率3.665 士 4.5%, 具有顯著差異 (P<0.05)。通過細(xì)胞粘附模型發(fā)現(xiàn)21858 對三種細(xì)胞的粘附性都大于21858。21858 和 21858對脾臟細(xì)胞的粘附?jīng)]有顯著差異(P>0.05),對小腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附性有顯著差異(P<0.05)。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析乳酸菌在體內(nèi)粘附情況 , 發(fā)現(xiàn)在小鼠的十二指腸、空腸、回腸中21858 的粘附率高于21858, 但是在結(jié)腸中 2185

5、8粘附率要高于 21858, 且在灌胃后 21858在腸道各個部位粘附菌數(shù)都隨時間存在一定上升趨勢。但兩株菌在空腸內(nèi)隨著時間有明顯下降趨勢。且發(fā)現(xiàn)回腸中總粘附菌數(shù)高于小腸其他部位。提示 prtP 基因編碼的細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin,能夠提高干酪乳桿菌對小腸粘液、細(xì)胞表面以及小鼠腸道的粘附。 3.21858prtP 基因突變株 21858免疫效力研究研究發(fā)現(xiàn)21858 能提升小鼠體重 , 且與對照組有顯著差異(P<0.05),21858對體重的提升效果好于21858, 時間越長效果越明顯。21858 和 21858對免疫器官的指數(shù)有特異性影響。21858 和 218

6、58對胸腺指數(shù)在短期內(nèi) (10d) 沒有顯著影響 (P>0.05),但在較長期 (20 d),21858和21858高劑量組相對于對照組都有顯著差異(P<0.05),而其他各組相對于對照組無顯著差異。且高劑量組胸腺指數(shù)相對中劑量組有顯著差異, 提示干酪乳桿菌對胸腺指數(shù)影響存在劑量依賴關(guān)系。對于脾臟指數(shù), 兩種干酪乳桿菌在整個喂養(yǎng)階段都有提高的作用 , 且提升效果具有濃度依賴性, 濃度越高 , 提升越明顯。21858 提升效果優(yōu)于 21858。說明 21858 對免疫器官的影響要優(yōu)于21858。對免疫細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)21858 和 21858在飼喂的整個階段均能提高小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率 , 且在相同時間和劑量下21858 組的轉(zhuǎn)化率高于 21858組。對巨噬細(xì)胞的活化研究提示21858 能通過提高巨噬細(xì)胞的能量代謝水平或吞噬能力來活化巨噬細(xì)胞 , 增強其對抗原的處理能力。但 21858對巨噬細(xì)胞的活化沒有明顯提升作用 , 提示 21858 活化巨噬細(xì)胞能力要強于 21858。本研究通過流式細(xì)胞儀對小鼠 CD11c+,CD80+雙陽性脾淋巴細(xì)胞進行檢測。結(jié)果表明 , 兩種受試乳酸菌在喂養(yǎng)小鼠的整個階段均可持續(xù)提高CD11c+C