分子生物基本試驗技術(shù)

1、組織細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞傳代1 去除原有培養(yǎng)液2 PBS洗一遍3 胰蛋白酶消化,37,1-2分鐘4 加入新鮮的培養(yǎng)液，吹打至細(xì)胞分散，剩余一定比例的細(xì)胞懸液，加入一定量的新鮮培養(yǎng)液。5 CO2溫箱37培養(yǎng)凍存細(xì)胞1 去除原有培養(yǎng)液2 PBS洗一遍3 胰蛋白酶消化,37,1-2分鐘4 加入新鮮的培養(yǎng)液，吹打至細(xì)胞分散，收集細(xì)胞懸液至離心管中5 離心，2000rpm，2分鐘6 去除上清，加入新鮮的培養(yǎng)液（10%DMSO+20%FBS）解凍復(fù)蘇細(xì)胞1 將凍存細(xì)胞置于37水浴中，<1分鐘2 用70%酒精消毒管口3 將細(xì)胞溶液用20ml培養(yǎng)液稀釋4 離心，2000rpm，2分鐘5 去除上清，加入新鮮的培養(yǎng)

2、液細(xì)胞轉(zhuǎn)染Dhamafect1(DHARMACON)轉(zhuǎn)染*細(xì)胞密度：96孔板：1*104/孔，12孔板：1*105/孔，10CM盤：1*106/孔SiRNA終濃度：50-100nM12孔板1 SiRNA(20M )2.5l/孔+去血清培養(yǎng)液，混勻于室溫下靜置5分鐘2 Dhamafect1試劑2l/孔+去血清培養(yǎng)液，混勻于室溫下靜置5分鐘3 將100l SiRNA混液與100l Dhamafect1試劑混液充分混合成轉(zhuǎn)染液，室溫下靜置20分鐘4 將200l轉(zhuǎn)染液加入800l正常培養(yǎng)液中。5 去除細(xì)胞舊的培養(yǎng)液，加入含有轉(zhuǎn)染液的新的培養(yǎng)液CO2溫箱37孵育24-48h。Western Blot收細(xì)

3、胞1 去除原有培養(yǎng)液2 PBS洗一至兩遍3 根據(jù)細(xì)胞密度加入適量的溶胞試劑（lysis buffer）*12孔板每孔加40-60ul4 刮去細(xì)胞溶液，收集在1.5ml離心管中5 超聲打碎細(xì)胞溶液10-20秒（Sonicate,Sonic Dismembrator）6 4攝氏度離心13000rbm，8-10分鐘7 取上清即可蛋白定量*標(biāo)準(zhǔn)樣品（2mg/ml）配成80，40，20，10，5，2.5ug/100ul*BCA蛋白分析試劑，A:B=50:1,100ul/well*96孔板，細(xì)胞裂解液5-10ul+H2O90-95ul1加入樣品和BCA試劑后，37攝氏度，30分鐘2用ELISA儀測吸光度（

4、OD值），參照標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度得出樣品濃度。電泳*凝膠濃度：分子量越大濃度越低*緩沖液：Tris-Hepes-SDS Running Buffer*加樣前用1ml洗頭吹打加樣槽，驅(qū)趕氣泡*加樣時不可將吸頭進(jìn)入過多，以免凝膠分離*加樣緩慢，以避免氣泡將樣品頂出1根據(jù)樣品蛋白定量，以最小濃度計算所需提及，并加入loading緩沖液，100攝氏度加熱5-10分鐘（總體積小于等于60ul）2電泳，100v，50-60分鐘轉(zhuǎn)膜三明治：從負(fù)極到正極依次是：海綿-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿22v過夜，60v四小時緩沖液：封閉緩沖液：5%脫脂牛奶/5%小牛血清TBST40-60分鐘室溫下輕搖加入一抗1：1000，

5、4攝氏度，輕搖過夜TBST洗三次，每次10-15分鐘加入二抗1：3000，室溫一小時輕搖TBST洗三次，每次10-15分鐘曝光免疫沉淀*Affinity Gel140ul/樣品 Affinity Gel懸液，用500ul冰PBS洗兩遍，離心后去除上清2加入約含1000ug蛋白的細(xì)胞裂解液，用水使體積達(dá)1ml34攝氏度旋轉(zhuǎn)混勻過夜44攝氏度離心，13000rbm，去除上清，冰500ul冰PBS洗兩遍，離心后去除上清5加入loading緩沖液80ul/管， 100攝氏度加熱三分鐘64攝氏度離心，13000rbm，取上清至新的離心管7做Western Blot96孔板XTT1 細(xì)胞密度：1000/孔

6、，次日加藥，24，48，96h行XTT2 A50ul/well+B1ul/well+培養(yǎng)液100ul/well,37攝氏度4小時3 492nm光譜，測od值免疫組化（96孔板）1 待測細(xì)胞，PBS洗兩遍，每次5分鐘，用4%paraformoldehyde(溶于PBS)室溫孵育十分鐘2 PBS洗兩遍，每次5分鐘，3 用1%H2O2室溫孵育10-15分鐘4 PBS洗兩遍，每次5分鐘5 PBST（PBS+0.1%Triton X-100）洗一遍，5-10分鐘6 用Diluted Normal Horse Serum(NHS)孵育20分鐘封閉7 加入一抗1：100溶于上封閉液中，4攝氏度孵育過夜8 去

7、除一抗溶液，PBS洗三遍，每次5分鐘9 用Diluted Biotinylated “universal”Secondary Ab室溫孵育30分鐘10 PBS洗三遍，每次5分鐘11 用ABC試劑室溫孵育30分鐘12 PBS洗一遍，5分鐘13 加入底物（30ul ImmuPACT DAB+1ml Diluent Vector Lab ImmuPACT DAB Peroxidase Substrate）2-10f分鐘，用水洗5分鐘，顯微鏡觀察免疫熒光（96孔板）1 待測細(xì)胞，PBS洗兩遍，每次5分鐘，用4%paraformoldehyde(溶于PBS)室溫孵育十分鐘2 PBS洗兩遍，每次5分鐘，3

8、 PBST（PBS+0.1%Triton X-100）洗一遍，5-10分鐘4 用Diluted Normal Horse Serum(NHS)孵育20分鐘封閉5 加入一抗1：100溶于上封閉液中，4攝氏度孵育過夜6 去除一抗溶液，PBS洗三遍，每次5分鐘7 用FITC-labeled 二抗（1：200）（溶于原封閉液中），孵育45-60分鐘，室溫下。8 PBS洗三遍，每次5分鐘9 加入VECTASHIELD mounting medium分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增1 將感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞解凍，20-25ul/離心管（1.5ml）2 加入1ug質(zhì)粒，混勻，冰上靜置10分鐘以上3 42攝氏度熱休克20-40秒4 再次置于冰上2分鐘5 加入200ul的LB培養(yǎng)液，37攝氏度，225轉(zhuǎn)搖30-60分鐘6 用吸頭沾少許在LB培養(yǎng)盤上快速滑