03第3章氨基酸和蛋白質(zhì)

1、第3章氨基酸和蛋白質(zhì)一、教學(xué)大綱基本要求氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和構(gòu)型、物理和化學(xué)性質(zhì)以及氨基酸的分離和分析。肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次，一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鏈的構(gòu)象，二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型，超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域和纖維狀蛋白質(zhì)。一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力，球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)的功能，蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)與功能與功能，免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)兩性性質(zhì)及應(yīng)用，膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀，蛋白質(zhì)的變性，分離純化蛋白質(zhì)的主要方法。二、本章知識(shí)要點(diǎn)（一）氨基酸1. 蛋白質(zhì)的組成蛋白質(zhì)是由20種基本氨基酸組成的。用酸、堿或蛋白酶可以分別將蛋白質(zhì)

2、水解，生成游離的氨基酸。2. 氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類常見的蛋白質(zhì)氨基酸（基本氨基酸）有20種，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元。20種基本氨基酸中，有19種氨基酸是0一氨基酸，即與短基相鄰的a一碳原子上都有一個(gè)氨基。脯氨酸是亞氨基酸。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的不同，根據(jù)R基團(tuán)結(jié)構(gòu)的不同，可以將20種氨基酸分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族3類。按照R基團(tuán)的極性性質(zhì)，又可以將20種氨基酸分為4類：非極性R基氨基酸，不帶電荷的極性R基氨基酸，帶正電荷的R基氨基酸，帶負(fù)電荷的R基氨基酸。氨基酸側(cè)鏈R基的性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、性質(zhì)和功能。不常見的蛋白質(zhì)氨基酸有10多種，在蛋白質(zhì)中由基本氨基酸經(jīng)過修飾生成的。3.

3、氨基酸的兩性性質(zhì)在結(jié)晶狀態(tài)或在水溶液中，氨基酸主要以兩性離子形式存在。任一取基pKi在2.0左右，當(dāng)pH>3.5,a一短基主要以COO-形式存在。a一氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH<8.0時(shí)，立一氨基主要以a-NHs形式存在。氨基酸在pH3.58.0時(shí)，帶有相反電荷，是兩性離子。在溶液中，氨基酸帶有的電荷性質(zhì)和電荷量隨溶液pH值變化而變化。甘氨酸溶點(diǎn)232C，比相應(yīng)的乙酸（16.5C）和乙胺（80.5C）都高，可推測(cè)氨基酸在晶體狀態(tài)是以兩性離子形式存在的。溶液中的氨基酸所帶的凈電荷為零時(shí)，此時(shí)溶液的pH值稱氨基酸的等電點(diǎn)，用pl表示。氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算：中性氨基酸pl=（pKaCO

4、OH+pKNH）/2，酸性氨基酸pl=（pKaCOOH+p0/2,堿性氨基酸pl=（pKaNH+pKr）/2。4. 氨基酸側(cè)鏈R基的特性（1）側(cè)鏈R為脂肪炷基的氨基酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile）R基是中性烷基（Gly是對(duì)整個(gè)氨基酸分子的酸堿性影響很小。這5種氨基酸幾乎有相同的等電點(diǎn)（6.0+0.03）。從甘氨酸到異亮氨酸，側(cè)鏈R基團(tuán)的疏水性逐漸增加。（2）側(cè)鏈R中含有羥基的氨基酸（Ser、Thr）絲氨酸中的OH基（pKa=15,在生理?xiàng)l件下不解離，是一個(gè)極性基團(tuán)，能與其它基團(tuán)（羥基和氨基等）形成氫鍵，具有重要的生理意義。在許多酶的活性中心都有絲氨酸殘基存在。蘇氨酸中的基羥基是一個(gè)

5、仲醇，具有親水性，但此羥基形成氫鍵的能力較弱。蘇氨酸在蛋白質(zhì)活性中心中很少出現(xiàn)。（3）側(cè)鏈R中含硫的氨基酸（Cys、Met）半胱氨酸的R側(cè)鏈中含筑基，兩個(gè)半胱氨酸的筑基氧化生成二硫鍵，利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。甲硫氨酸中含有甲硫基（一SCHD,在生物體內(nèi)是一種重要的甲基供體。（4）側(cè)鏈R中含有酸性基團(tuán)的氨基酸（Asp、Glu）半胱氨酸側(cè)鏈短基pKa（6COOH為3.86，谷氨酸側(cè)鏈短基pKa（丫一COOH為4.25,它們?cè)谏項(xiàng)l件下帶有負(fù)電荷。（5）側(cè)鏈R中含有酰胺基團(tuán)的氨基酸（Asn、Gln）天冬酰胺和谷氨酰胺易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)在生物合成和代謝過程中有重要意義。（6）側(cè)鏈R中含堿

6、性基團(tuán)的氨基酸（Lys、Arg）賴氨酸的R側(cè)鏈上含有一個(gè)氨基，側(cè)鏈氨基的pKa為10.53。生理?xiàng)l件下，賴氨酸側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷（NH+）。此外，賴氨酸的側(cè)鏈有4個(gè)C的直鏈，柔性較大，使側(cè)鏈氨基的反應(yīng)活性增大。例如，肽聚糖短肽間的連接。精氨酸是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的隊(duì)基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48,生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。（7）側(cè)鏈R中含有芳香基團(tuán)的氨基酸（Ph&Try）苯丙氨酸和酪氨酸都具有共軸兀電子體系，容易與其它缺電子體系或兀電子體系形成電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物（charge-transfercomplex）或電子重疊復(fù)合物。在生物大分子的相互識(shí)別過程中具有重要作用。這2

7、種氨基酸在紫外區(qū)有特征吸收峰，蛋白質(zhì)的紫外吸收部分來自這2種氨基酸。（8）側(cè)鏈R為雜環(huán)的氨基酸（Trp、His、Pro）色氨酸有復(fù)雜的兀電子共軸休系，它比苯丙氨酸和酪氨酸更易形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。色氨酸的兀共軸休系最大，在280nm處，色氨酸吸收最強(qiáng)，酪氨酸次之，苯丙氨酸最弱。組氨酸含咪哇環(huán)，咪哇環(huán)的pKa在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者pKa為6.00,后者為7.35,它是20種氨基酸中側(cè)鏈pKa值最接近生理pH值的一種。在接近中性pH時(shí)，可離解平衡，具有緩沖能力。脯氨酸是環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸，它的a-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。在多肽鏈中，脯氨酸殘基所在的位置往往發(fā)生骨架方向

8、的變化，它在形成球狀蛋白質(zhì)空間的結(jié)構(gòu)中具有重要作用。5. 氨基酸的兩性性質(zhì)在結(jié)晶狀態(tài)或在水溶液中，氨基酸主要以兩性離子形式存在。a一短基pK1在2.0左右，當(dāng)pH>3.5,a一短基主要以COO-形式存在。a一氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH<8.0時(shí)，a一氨基主要以a-NH+3形式存在。氨基酸在pH3.5-8.0時(shí)，帶有相反電荷，是兩性離子。在溶液中，氨基酸帶有的電荷性質(zhì)和電荷量隨溶液pH值變化而變化。甘氨酸溶點(diǎn)232C，比相應(yīng)的乙酸（16.5C）和乙胺（80.5C）都高，可推測(cè)氨基酸在晶體狀態(tài)是以兩性離子形式存在的。6. 氨基酸的化學(xué)反應(yīng)DN孚CL（丹磺酰氯）反應(yīng)：在弱堿性溶液中，

9、氨基酸的氨基可以與丹磺酰氯（5一二甲基氨基荼-1一磺酰氯）發(fā)生?；磻?yīng)，生成DN孚氨基酸。此反應(yīng)可以標(biāo)記多肽鏈N末端氨基酸，用于測(cè)定多肽和蛋白質(zhì)的N末端氨基酸。Sanger反應(yīng)：在弱堿性溶液中，氨基酸的氨基與2,4二硝基氟苯（DNFB或FDNB役生親核芳香取代反應(yīng)，生成二硝基苯基氨基酸。此反應(yīng)可以用來分析多肽的N末端氨基酸。Edman反應(yīng)：在弱堿性條件下，口氨基酸與苯異硫割酸酯（PITC）反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTO氨基酸）。PTC-氨基酸可以環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脈衍生物（PT+氨基酸），用層析法可以分離鑒定PTHk氨基酸。用此方法可以分析多肽鏈N末端的氨基酸序列。菌三酮反應(yīng)：在弱酸

10、性條件下，a-氨基酸與菌三酮共熱，發(fā)生氨基氧化脫氨和脫短反應(yīng)，生成紫色化合物，最大吸收波長入max是570nm脯氨酸與菌三酮反應(yīng)，生成亮黃色化合物，最大吸收波長入max是440nm此反應(yīng)可以用于氨基酸含量的分析。氨基與?；噭┓磻?yīng)?；噭┯泄?jié)氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酊、對(duì)-甲苯磺酰氯，以及5-二甲基氨基蔡-1一磺酰氯（丹磺酰氯DNS-Cl）。氨基與烷基化試劑反應(yīng)a-短基中的氮是一個(gè)親核中心，能發(fā)生親核取代反應(yīng)。生成西佛堿的反應(yīng)（Schiff）氨基酸的a-氨基與醛類反應(yīng)，生成西佛堿，西佛堿是很多酶促反應(yīng)中的中間產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物。含硫氨基酸的烷基化反應(yīng)硫原子也是親核中心，可發(fā)生

11、親核取代反應(yīng)。生物體內(nèi)，重要的甲基化劑是S-腺首甲硫氨酸（SAM,是由Met與ATP作用得到的S一烷基化產(chǎn)物。在酶催化下，SAM可以使多種生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。a-短基參加的反應(yīng)短基與堿反應(yīng)生成鹽，與醇反應(yīng)生成酯。短基與二氯亞硯或五氯化磷反應(yīng)生成酰氯，使短基活化，可以用于多肽的人工合成。7. 氨基酸的光學(xué)性質(zhì)氨基酸的必是一個(gè)不對(duì)稱碳（甘氨除外）原子，氨基酸有D型和L型兩種構(gòu)型。蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L型，有些抗生素或微生物的細(xì)胞壁中有D型氨基酸。外消旋作用：混合等摩爾的D型和L型氨基酸，可以得到無旋光性的DL-消旋物。內(nèi)消旋作用：一個(gè)D型半胱氨酸和一個(gè)L型半胱氨酸，氧化生

12、成內(nèi)消旋胱氨酸。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收紫外光。蛋白質(zhì)分子在280nm有最大紫外光吸收，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中含有這3種氨基酸殘基。8. 氨基酸的分離和分析用紙層析、薄層層析、電泳、陽離子交換層析等方法可以分離氨基酸混合物。陽離子交換層析法：用含Na*的緩沖液將陽離子交換樹脂處理成鈉鹽，且pH值在2左右。將游離氨基酸的混合溶液（pH23）加入柱中，此時(shí)氨基酸都以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子交換，被固定在樹脂上。逐步提高洗脫液的pH值，減小氨基酸帶有的正電荷量；同時(shí)逐步提高洗脫液的鹽濃度，減小氨基酸與樹脂的作用力，可以將固定在樹脂上的氨基酸以不同的速度洗脫下來。被分離的氨基酸與菌三酮發(fā)生

13、顯色反應(yīng)，根據(jù)衍生物對(duì)光吸收的強(qiáng)弱，可以定量分析各種氨基酸。氨基酸與離子交換樹脂的作用力主要有：靜電吸引力和氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)（聚苯乙烯）的疏水作用力。靜電吸引力的大小直接與氨基酸的等電點(diǎn)有關(guān)，靜電吸引力的大小順序是：堿性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸。在等電點(diǎn)比較接近的氨基酸中，R側(cè)鏈殘基的疏水性越高，與樹脂基質(zhì)作用力越大，在層析柱中的停留時(shí)間（保留時(shí)間）越長。（二）肽1. 肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽是由一個(gè)氨基酸的v短基與另一個(gè)氨基酸的ot-氨基脫水縮合而成的化合物，氨基酸間脫水后生成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵），其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。由兩個(gè)氨基酸縮合而成的肽稱為2肽，少于10個(gè)氨基酸殘基的肽稱為

14、寡肽，多于10個(gè)氨基酸殘基的肽稱為多肽。肽鏈上的各個(gè)側(cè)鏈由不同的氨基酸R側(cè)鏈構(gòu)成。肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰段基之間的共振作用，穩(wěn)定性高。肽鍵亞氨基在pHA14內(nèi)不解離，6個(gè)原子幾乎處在同一平面內(nèi)。2. 肽的化學(xué)性質(zhì)肽的a一短基、a一氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。含有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脈反應(yīng)，可用于定量分析。肽與雙縮脈反應(yīng)生成紫色或藍(lán)紫色化合物，這是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。3, 生物活性肽生物體內(nèi)有很多具有生物活性的多肽和寡肽，稱活性肽?；钚噪脑谏锏纳L、發(fā)育、細(xì)胞分化、大腦功能、免疫、生殖、衰老、病變等過程中起重要作用。

15、活性肽是細(xì)胞內(nèi)部、細(xì)胞間、器官間信息傳遞的主要化學(xué)信使，很多激素、抗生素都屬于肽類或肽衍生物。（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)1. 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序（含二硫鍵）O二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈中各個(gè)肽段借助氫鍵形成有規(guī)則的構(gòu)象。主要有a-螺旋、3-折疊和3-轉(zhuǎn)角。超二級(jí)結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)或兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體。例如aa、0a8、333等結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域：多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵的作用力，通過彎曲、折疊，形成具有一定

16、走向的緊密球狀構(gòu)象。球狀構(gòu)象的比表面積最低，使蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境的相互作用力最小。四級(jí)結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。2. 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略：用兩種以上不同的裂解方法裂解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生兩套切點(diǎn)不同的肽段。分離、純化每一個(gè)肽段，分別測(cè)定每一個(gè)肽段的氨基酸序列，用重疊法拼接出一條完整的肽鏈。主要步驟：A, 根據(jù)蛋白質(zhì)末端分析結(jié)果和相對(duì)分子質(zhì)量，確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。B, 如果蛋白質(zhì)是寡聚蛋白，用變性劑（如8.0mol/L尿素）拆分蛋白質(zhì)亞基。C, 斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。D, 分析每一條多肽鏈的氨基酸組成，計(jì)算多肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目。E, 分析N-

17、末端和C-末端氨基酸，確定氨基酸測(cè)序的兩個(gè)端點(diǎn)。選用兩種不同的裂解方法將一條多肽鏈裂解成兩套重疊的肽段，分離純化每一個(gè)肽段，分別用Edman降解法測(cè)定每一個(gè)肽段的氨基酸序列。F, 用片斷重疊法拼接出一條完整的肽鏈。G, 確定二硫鍵的位置。H, 確定肽鏈中的天冬酰胺和谷氨酰胺3. 同源蛋白質(zhì)在不同生物體內(nèi)具有相同或相似功能的蛋白質(zhì)。例如，血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能。同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：（1）多肽鏈長度相近，氨基酸序列相似。（2）同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基。不變殘基高度保守，是必需的。如果不變殘基發(fā)生變化，會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。

18、（3）除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基?？勺儦埢?，個(gè)別氨基酸的變化不一定影響蛋白質(zhì)的功能。（四）蛋白質(zhì)的二級(jí)機(jī)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)1. 多肽主鏈的折疊多肽鏈的共價(jià)主鏈上所有的a一碳原子都參與形成單鍵，因此一個(gè)多肽主鏈可能有無限多種構(gòu)象。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的多肽鏈只有一種或很少幾種構(gòu)象，這種構(gòu)象稱蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)具有生物活性，且相當(dāng)穩(wěn)定。在生物體內(nèi)天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)主鏈上的單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鏈的二面角，肽鏈的所有可能構(gòu)象都能用和中這兩個(gè)構(gòu)象角來描述，稱二面角。多肽鏈折疊的空間限制，和中同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在，因?yàn)閮蓚€(gè)相鄰平面上的酰胺基氫原子和段基氧

19、原子的接觸距離比其范德華半經(jīng)之和小，空間位阻。二面角（、中）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙。2. 拉氏構(gòu)象圖實(shí)線封閉區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。虛線封閉區(qū)域是最大允許區(qū)，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。虛線外區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，排斥力很大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。3. 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要?jiǎng)恿τ?a.暴露在溶劑中的疏水基團(tuán)降低至最少程度。B.保持處于伸展?fàn)顟B(tài)的多肽鏈和周圍水分子間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)。a一螺旋a一螺旋是蛋白質(zhì)中常

20、見的一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鏈主鏈繞中心軸盤繞成螺旋狀，相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵。在3.613螺旋中，二面角=57°,中=48°,肽鍵上N-H氫與它后面（N端）第四個(gè)殘基上的C=O氧間形成氫鍵，螺距是0.54nm，每一圈含有3.6個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)殘基沿著螺旋的長軸上升0.15nm，氨基酸殘基的側(cè)鏈向外伸展。a一螺旋的種類有2.27螺旋（n=1）,310螺旋（n=2）,3.613螺旋（n=3）和4.316螺旋（n=4）。氨基酸側(cè)鏈對(duì)a一螺旋穩(wěn)定性的影響如果多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷的氨基酸殘基，（例如Lys,或Asp,或Glu）,則由于靜電排斥，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，從而不能形成穩(wěn)定的

21、a-螺旋。例如多聚賴氨酸和多聚谷氨酸。而當(dāng)這些殘基分散存在時(shí)，不影響a一螺旋穩(wěn)定。甘氨酸的角和甲角可取范圍較大，在肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)時(shí)，使形成a一螺旋所需的二面角的可能性很小，不易形成a一螺旋。絲心蛋白含50%Gly,不形成a一螺旋。肽鏈中的R基較大（如Ile）時(shí)，不易形成a一螺旋。脯氨酸和羥脯氨酸終止a一螺旋。R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于任螺旋的形成。蛋白質(zhì)中的a一螺旋幾乎都是右手螺旋，但也有例外，在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手a一螺旋，由AspAsn-Gly-Gly（226229）組成，二面角是（）+64和中+42。.3-折疊兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的

22、N-H氫和C=O氧之間形成氫鍵，這樣的多肽構(gòu)象就是3一折疊。3一折疊中所有的肽鏈都參與鏈間氫鍵的形成，側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。3-折疊有平行式和反平行式2種。平行式：所有參與6折疊的肽鏈的N末端在同一方向，二面角$=119。，中=+113。o反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N末端間隔相同，二面角$=139。，中=+135。在纖維狀蛋白質(zhì)中6一折疊主要是反平行式，而在球狀蛋白質(zhì)中反平行和平行兩種方式都存在。在纖維狀蛋白質(zhì)的6一折疊中，氫鍵主要是在肽鏈之間形式；而在球狀蛋白質(zhì)中，6一折疊既可在不同肽鏈間形成，也可在同一肽鏈的不同肽段間形成。從能量角度看，反平行6一折疊比平行的更穩(wěn)定，前者

23、的氫鍵NH-O幾乎在一條直線上，氫鍵最強(qiáng)。.3一轉(zhuǎn)角3一轉(zhuǎn)角是指蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折，有時(shí)稱之為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由第一個(gè)氨基酸殘基的C=0第四個(gè)氨基酸殘基的NH間形成氫鍵。目前發(fā)現(xiàn)的6轉(zhuǎn)角多數(shù)在球狀蛋白質(zhì)分子表面，6一轉(zhuǎn)角在球狀蛋白質(zhì)中含量十分豐富，約占全部殘基的1/4。3一轉(zhuǎn)角的特征：由多肽鏈上4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。主鏈骨架以180°返回折疊。第一個(gè)氨基酸殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的WH形成氫鍵。C1與C4之間距離小于0.7nm。多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。.無規(guī)卷曲沒有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象。二面角$、中存在于拉氏圖上所有允許區(qū)域，它在球狀蛋白中含量較高，對(duì)

24、外界物理、化學(xué)因素敏感，與蛋白質(zhì)的生物活性有關(guān)。a一螺旋、6轉(zhuǎn)角和6一折疊的二面角$、中在拉氏構(gòu)象圖上有固定區(qū)域，而無規(guī)卷曲的$、中二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。.超二級(jí)結(jié)構(gòu)兩個(gè)或兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體。超二級(jí)結(jié)構(gòu)有皿、6a。和666三種基本的組合形式。.結(jié)構(gòu)域和功能域多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。結(jié)構(gòu)域是獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體，是蛋白質(zhì)的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。功能域是蛋白質(zhì)分子中能獨(dú)立存在的功能單位。功能域可以是一個(gè)結(jié)構(gòu)域，也可以由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域組成。4. 纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)是動(dòng)物體的基

25、本支架和外保護(hù)成分，占脊椎動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的一半以上。分子是有規(guī)則的線形結(jié)構(gòu)，外形是纖維狀或棒狀。纖維狀蛋白質(zhì)分為不溶性和可溶性兩類，不溶性的主要有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白，可溶性的有肌球蛋白和血纖維蛋白。（五）蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)與功能1. 蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)在二級(jí)結(jié)構(gòu)（0（一螺旋、3一折疊、3一轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）的基礎(chǔ)上，多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵的作用，通過彎曲、折疊，形成具有一定走向的緊密球狀構(gòu)象。球狀構(gòu)象的比表面積最小，使得蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境的相互作用力最小。.球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征球狀蛋白質(zhì)都有各自獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，但是它們都具有以下共同的結(jié)構(gòu)特征。球狀蛋白質(zhì)含有二

26、種或二種以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（CL螺旋、3-折疊、3-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲），具有明顯的折疊層次，是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體，疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面，分子表面有一個(gè)裂隙，通常是底物或效應(yīng)物的結(jié)合部位。.膜蛋白的結(jié)構(gòu)膜蛋白可以分為膜周邊蛋白和膜內(nèi)在蛋白。膜周邊蛋白是可溶性球狀蛋白質(zhì)，分布在膜表面，通過非共價(jià)鍵與膜結(jié)合。膜內(nèi)在蛋白通過疏水肽段錨定在膜上，膜內(nèi)在蛋白主要有三種：?jiǎn)蝹€(gè)跨膜肽段的膜蛋白、7個(gè)跨膜肽段的膜蛋白和6桶型膜蛋白。還有一些蛋白質(zhì)能與膜上的脂質(zhì)形成共價(jià)鍵，錨定在膜上，形成膜蛋白。.蛋白質(zhì)的折疊蛋白質(zhì)折疊時(shí)，通過積累選擇形成自由能最低的構(gòu)象。球狀蛋白質(zhì)的折疊步驟：先快速形

27、成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)（b螺旋和3一折疊）；再形成初始的結(jié)構(gòu)域，并由結(jié)構(gòu)域形成熔球態(tài)；最后調(diào)整結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，形成完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的折疊需要分子伴侶的參與。.蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力主要是非共價(jià)鍵作用力，其中包括氫鍵、范德華力、疏水作用和鹽鍵，此外還有二硫鍵。.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)涉及亞基的種類和數(shù)目，以及各個(gè)亞基在整個(gè)蛋白質(zhì)分子中的空間排布，亞基間的接觸位點(diǎn)（結(jié)構(gòu)互補(bǔ)）和作用力（非共價(jià)作用力）。四級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)點(diǎn)：可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？梢蕴岣哌z傳經(jīng)濟(jì)性和效率。使得酶分子的不同催化亞基聚積在一起，提高催化效率。使得蛋白質(zhì)具有協(xié)同效應(yīng)

28、和別構(gòu)效應(yīng)。2. 球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能.肌紅蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存儲(chǔ)和分配的氧肌紅蛋白由一條多肽鏈組成，分子中多肽主鏈由8段直的o（一螺旋組成，最長的a-螺旋有23個(gè)氨基酸殘基，最短的a-螺旋有7個(gè)氨基酸殘基，75%勺氨基酸殘基處在a-螺旋區(qū)內(nèi)。肌紅蛋白多肽鏈繞曲成球狀分子，疏水氨基酸殘基幾乎全部在分子內(nèi)部，例如Val、Leu、Met、Phe等，親水氨基酸殘基幾乎全部在球狀分子的外表面。4個(gè)Pro殘基各自處在1個(gè)拐彎處，Ser、Thr、Asn和Ile分別處在另外4拐彎處。血紅素中，中唏環(huán)中心的Fe2+六個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與平面中唏分子的N結(jié)合，另外兩個(gè)與中唏平面垂直，1個(gè)與93位His（F8

29、）的咪哇基的N結(jié)合，另一個(gè)處于開放狀態(tài)，可以結(jié)合Q。肌紅蛋白為血紅素提供了一個(gè)疏水環(huán)境，避免Fe2+被氧化而失去氧結(jié)合能力。.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能血紅蛋白在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)氧。血紅蛋白分子接近于球體，4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。HbA是成人體內(nèi)主要的血紅蛋白，具有02俊的亞基結(jié)構(gòu)。血紅蛋白與氧結(jié)合具有別構(gòu)效應(yīng)，氧合曲線是S形曲線。氧與第一個(gè)血紅素的結(jié)合后，有助于后續(xù)的氧與血紅蛋白分子中其余的三個(gè)血紅素結(jié)合。在肌肉組織中，H+和CO促進(jìn)血紅蛋白釋放O;在肺泡毛細(xì)管中，。促進(jìn)血紅蛋白釋放H和COo2、3一二磷酸甘油酸（BPG是血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)物，它能與去氧血紅蛋白

30、結(jié)合，降低血紅蛋白對(duì)氧的親和力。.鐮刀狀細(xì)胞貧血的分子機(jī)理鐮刀狀細(xì)胞貧血是由于基因突變，引起血紅蛋白分子中氨基酸殘基被替換所造成的。人的血紅蛋白分子的四條肽鏈中，只有兩個(gè)Glu分子變化成Va1分子，就能發(fā)生鐮刀狀細(xì)胞貧血病。正常人血紅蛋白，66是Glu,鐮刀狀細(xì)胞貧血的患者的血紅蛋白66是Val。在生理?xiàng)l件下，Va1不帶電荷，疏水，Glu帶負(fù)電荷，親水。3. 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能.抗原與抗體抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)，主要有蛋白質(zhì)、核酸以及其它高分子化合物。抗體是在對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特

31、異性結(jié)合并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球狀蛋白質(zhì)，稱免疫球蛋白?？贵w具有高度特異性和多樣性，人類能夠產(chǎn)生超過108種的抗體。.免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)IgG分子由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成，四條肽鏈間有二硫鍵連接。重鏈的分子量為53000左右，輕鏈的分子量為22000左右。重鏈和輕鏈各分兩個(gè)區(qū)域，重鏈51.4為可變區(qū)，C一端34為恒定區(qū)，輕鏈N滿12為可變區(qū)，C檔12為恒定區(qū)。重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)共同組成一個(gè)抗原結(jié)合部位。.抗體抗原反應(yīng)以IgG為例，一個(gè)IgG分子含有2個(gè)抗原結(jié)合部位，它們位于丫形結(jié)構(gòu)的2個(gè)臂的頂端。如果抗原分子含有2個(gè)抗原決定簇，抗體可以形成抗原-抗體的交聯(lián)晶格，產(chǎn)生沉淀反應(yīng)。抗

32、原抗體反應(yīng)的條件：抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)，抗原與抗體有對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過作用力（離子鍵、氫鍵）使二者結(jié)合?？乖贵w反應(yīng)可以廣泛用于生物化學(xué)分析，例如免疫擴(kuò)散，免疫電泳，酶聯(lián)免疫分析和Western印跡。（六）蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其應(yīng)用1.蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)蛋白質(zhì)分子中，側(cè)鏈上各種可解離基團(tuán)以及末端的or氨基和注一短基的解離性質(zhì)，決定了蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量。在溶液中，當(dāng)某種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時(shí)，對(duì)應(yīng)的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸的殘基數(shù)與堿性氨基酸的殘基數(shù)之比有關(guān)系。酸性氨基酸殘基的含量越高，等電點(diǎn)越低；堿性氨基酸殘基的含量越高，等電點(diǎn)越高。在等電點(diǎn)

33、條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度、粘度均為最小值。2. 蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性某些物理或化學(xué)因素（高溫、高壓、紫外線和表面張力、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、服和H）能破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵，使得蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象解體，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不變。蛋白質(zhì)變性的后果是生物活性喪失，側(cè)鏈基團(tuán)外露，物理、化學(xué)性質(zhì)改變，生物化學(xué)性質(zhì)改變。蛋白質(zhì)的復(fù)性是指當(dāng)變性因素除去以后，變性的蛋白質(zhì)又可以重新回復(fù)到原來的天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)的復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。3. 凝膠過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的原理不同大小的蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，被排阻在顆粒之外，通過顆粒之間的

34、間隙快速流出層析柱。比凝膠孔徑小的分子能不同程度地進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，因此不同大小的蛋白質(zhì)分子在層析柱中移動(dòng)的路徑不同，分子量大的蛋白質(zhì)先流出柱子，分子量小的蛋白質(zhì)后流出柱子。4. SD驟丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的原理SDS是強(qiáng)變性劑，能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用力，筑基乙醇能打開二硫鍵。在有SDS和筑基乙醇存在下，單體蛋白或亞基的多肽鏈展開。SDS使蛋白質(zhì)結(jié)合，使得多肽鏈帶上大量的相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差異，使得不同蛋白質(zhì)的電荷/質(zhì)量比相同。此外在SDS的作用下，SDA蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中呈棒狀，直徑約為1.8nm,長度與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量

35、成正比。分子量小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度快，分子量大的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度慢。5. 蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化主要涉及兩個(gè)方面：蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)化合物的分離。不同種類蛋白質(zhì)之間分離。可以利用蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)之間物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，以及蛋白質(zhì)之間物理、化學(xué)性質(zhì)的差異來分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)溶解度的差異：不同的蛋白質(zhì)在同一種溶劑中溶解度不同，同一種蛋白質(zhì)在不同的溶劑中溶解度不同。主要有PEG沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法和熱變性法。蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的差異：不同蛋白質(zhì)中含有的酸性氨基酸殘基與堿性氨基酸殘基的比例不同，它們的等電點(diǎn)不同，在一定的pH環(huán)境中帶有的電荷性質(zhì)和電荷量不同。因此可

36、以用離子交換層析法和電泳法分離純化蛋白質(zhì)。電泳法主要有聚丙烯酰氨凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、等電聚焦電泳和層析聚膠電泳。分子大小的差異：可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同，選用凝膠過濾法、超濾法、透析法和離心法來分離純化蛋白質(zhì)。與配體親和力的差異：根據(jù)不同的蛋白質(zhì)能分別與相應(yīng)的特異性配體非共價(jià)結(jié)合，利用親和層析法可以分離純化蛋白質(zhì)。6. 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定測(cè)定總蛋白質(zhì)含量的方法有：凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin-酚法和紫外吸收法。測(cè)定某一種特定蛋白質(zhì)的含量，可以用生物學(xué)的方法。對(duì)于酶或激素蛋白，可以利用它們的酶活性或激素活性來測(cè)定。對(duì)于不具備酶活性或激素活性的蛋白質(zhì)，可以利用抗體-抗原反應(yīng)來測(cè)定。7. 蛋

37、白質(zhì)純度的鑒定HPLC法、溶解度分析法、沉降法和N末端氨基酸分析法。電SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果是純的均一的蛋白質(zhì)，電鑒定蛋白質(zhì)純度的方法主要有電泳法、高效液相層析（泳法主要有等電聚焦電泳，毛細(xì)管電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳和泳法、高效液相層析法分析圖譜上只出現(xiàn)一個(gè)條帶或一個(gè)峰。三、重點(diǎn)、難點(diǎn)重點(diǎn)：氨基酸的結(jié)構(gòu)，氨基酸側(cè)鏈的物理、化學(xué)性質(zhì)與多肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。氨基酸的兩性性質(zhì)，氨基酸的化學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，肽的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性，蛋白質(zhì)的折疊。纖維蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征與功能，球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征與功能

38、。肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和氧合曲線。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)。蛋白質(zhì)的分離純化方法及純度鑒定。難點(diǎn)：氨基酸的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，氨基酸滴定曲線，氨基酸的化學(xué)反應(yīng)及其應(yīng)用，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，寡聚蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，肌紅蛋白與血紅蛋白的氧合曲線，蛋白質(zhì)的分離純化方法。四、典型例題解析例題3-1:對(duì)蛋白質(zhì)中自然發(fā)生的氨基酸替換的研究結(jié)果如下，請(qǐng)解釋下列現(xiàn)象。(1) 絲氨酸的替換最不容易引起蛋白質(zhì)功能的改變。(2) 色氨酸的替換最容易引起蛋白質(zhì)功能的改變。(3) LystArg和IleLeu這樣的替換一般對(duì)蛋

39、白質(zhì)的功能基本沒有影響。解：蛋白質(zhì)分子中，氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的大小、電荷性質(zhì)和極性的改變都可能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能。(1) Ser具有一個(gè)中等大小的側(cè)鏈，側(cè)鏈?zhǔn)菢O性的，不帶電荷。極性不帶電荷的殘基(Asn、Gln或Thr)或者極性帶電荷的殘基(Arg、Asp、Glu或Lys)有可能取代Ser,不會(huì)顯著破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象。Trp側(cè)鏈的的疏水性最強(qiáng)，往往出現(xiàn)在球狀分子的內(nèi)部。在蛋白質(zhì)疏水核內(nèi)，Phe苯環(huán)形成的范德華力的能力比Trp呼噪環(huán)的要小，會(huì)引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，影響蛋白質(zhì)的功能。(2) Lys和Arg的側(cè)鏈都帶正電荷，且長度相近。Ile和Leu大小相似，且都疏水。

40、這兩種替代幾乎不影響蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象，因此不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。例題3-2:(a)Tris是一個(gè)弱酸(Ka=8.3x10-9mol/L，它是生化實(shí)驗(yàn)中常用的緩沖劑。問在pH8.00時(shí)，Tris有其共軸酸(Tris-H+)的比值是多少？(b)若上述溶液中Tris的總濃度為100mmol/L,在加入5mmol/L(H+)后，溶液pH值是多少？若Tris的總濃度減少到20mmol/L,pH變化又是多少？解：(a)因?yàn)閜H=pKa+1g(Tris/Tris-H+)pKa=-1gKa=8.08所以8.00=8.08+1g(Tris/Tris-H+)Tris/Tris-H+=0.83(b)若Tris+Tr

41、is-H+=100mmol/L則根據(jù)(a)中結(jié)果可得：Tris=45mmol/LTris-H+=55mmol/L當(dāng)加入5mmol/LH+后，則Tris減少5mmol/L，而Tris-H+增力口5mmol/L,即：Tris=40mmol/LTris-H+=60mmol/L因此pH=pKa+1g(Tris/Tris-H+)8.08+1g(40/60)=7.9即加入5mmol/LH+可使pH降低0.1單位。若Tris的總濃度為20mmol/L,則Tris+Tris-H+=20mmol/LTris/Tris-H+=0.83所以Tris=9mmol/LTris-H+=11mmol/L加入5mmol/LH

42、+后，則Tris減少到4mmol/L，而Tris-H+增加到16mmol/L,pH=pKa+1g(Tris/Tris-H+)8.08+1g4/16)=7.48即此時(shí)加入5mmol/L可使pH降低0.52個(gè)單位。例題3-3:用陽離子交換層析分離下列每一對(duì)氨基酸，用pH7的緩沖溶液洗脫，哪一種氨基酸先從離子交換柱上流出，為什么？A.Lys與Met。B.Lys與Asp。C.Glu與Met。D.Gly與Leu。E.Ser與Ala。解：影響氨基酸流出順序的主要因素是：(1) pH7時(shí)氨基酸的電荷性質(zhì)和電荷量，通常等電點(diǎn)低的氨基酸帶有負(fù)電荷，不與陽離子交換樹脂結(jié)合，因此會(huì)先流出，反之，帶正電荷，后流出。(

43、2) 電荷量相同或相近時(shí)，側(cè)鏈R基團(tuán)疏水性強(qiáng)的氨基酸與樹脂基質(zhì)作用力大，因此會(huì)后流出。Met先流出。Lys的等電點(diǎn)pI=9.74,Met的等電點(diǎn)pI=5.75，在pH7時(shí)Lys帶有一個(gè)的正電荷，與陽離子交換樹脂結(jié)合牢固。而Met帶負(fù)電荷，不能與陽離子交換樹脂結(jié)合，因此Met先流出。B.Asp先流出(Asp的pI=2.97)。C.Glu先流出(Glu的pI=3.22)。D.Gly先流出(Gly的pI=5.97,Leu的pI=5.98)。這兩種氨基酸的等電點(diǎn)幾乎相同，這時(shí)要考慮它們的側(cè)鏈基團(tuán)的疏水性。Gly的側(cè)鏈基團(tuán)的疏水性比Leu的小，與樹脂基質(zhì)作用力小，因此Gly先流出。E.Ser先流出。Se

44、r的等電點(diǎn)是pI=5.68,Ala的等電點(diǎn)是pI=6.02，而且Ala側(cè)鏈的疏水性比Ser的大。例題3-4:結(jié)合肌紅蛋白和血紅蛋白的氧合曲線，簡(jiǎn)述動(dòng)物體內(nèi)的氧從肺中轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉中的過程。肺泡中的p(Ob)為100torr，肌肉的毛細(xì)管中p(Q)為20torr,P50=26torr。血紅蛋白在肺泡中的丫值是0.97，在肌肉的毛細(xì)管中的丫值是0.25。肌紅蛋白的P50=2torr。解：肌紅蛋白是單亞基的氧結(jié)合蛋白，它的氧合曲線是雙曲線。血紅蛋白是含有4個(gè)亞基的氧結(jié)合蛋白，亞基間存在協(xié)同效應(yīng)，它的氧合曲線是S形曲線。血紅蛋白在肺泡中的氧分?jǐn)?shù)飽和度Y是0.97,因此肺泡中的血紅蛋白能大量地結(jié)合氧，并且將

45、氧運(yùn)到肌肉組織中。在肌肉毛細(xì)血管中，血紅蛋白的氧分?jǐn)?shù)飽和度Y是0.25，大量釋放氧，氧的釋放量Y是0.72o肌肉毛細(xì)血管中的肌紅蛋白的P50=2torr,可以高度結(jié)合血紅蛋白釋放的氧。例題3-5:分離純化蛋白質(zhì)的一般原則是什么？解：在分離純化某一個(gè)特定蛋白質(zhì)時(shí)，通常要求在盡量保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和活性的同時(shí)，提高蛋白質(zhì)的純度、均一性和回收率，一般可以分為以下幾步。(1) 前處理用各種方法將細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放到提取液中，用過濾或離心法除去細(xì)胞碎片。動(dòng)物組織和細(xì)胞可以用電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器或超聲波破碎機(jī)處理。植物組織和細(xì)胞可以用石英砂與提取液一起研磨，或用纖維素酶處理。細(xì)菌細(xì)的胞壁

46、可以用超聲波破碎機(jī)處理，與石英砂研磨或用溶菌酶處理。(2) 粗分級(jí)分離前處理得到的蛋白質(zhì)溶液中含有大量的雜蛋白以及少量的核酸和多糖，可以選用適當(dāng)?shù)姆椒?，去除雜蛋白。一般可以采用鹽析、等電點(diǎn)沉淀或有機(jī)溶液沉淀等方法。(3) 細(xì)分級(jí)分離粗分級(jí)分離步驟已經(jīng)將大部分雜蛋白除掉，細(xì)分級(jí)分離可以將樣品進(jìn)一步純化。一般用凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等方法。又是還可以采用各種電泳方法。(4) 結(jié)晶這是分離純化的最后一步，結(jié)晶和重結(jié)晶可以進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度標(biāo)志，還表明蛋白質(zhì)處于天然狀態(tài)，沒有發(fā)生變性。例題3-6:凝膠過濾層析與凝膠電泳中的分子篩效應(yīng)有什么不同？為什么？解：這兩種分離方法

47、的原理不同。在凝膠過濾層析中，分子量大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔隙內(nèi)部，只能穿過凝膠顆粒之間的間隙，很快流出層析柱。因此，分子量大的蛋白質(zhì)，移動(dòng)的路徑短，移動(dòng)速度較快；分子量小的蛋白質(zhì)，移動(dòng)的路徑長，移動(dòng)速度較慢。而在凝膠電泳中，整個(gè)凝膠是一個(gè)完整的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子量大的蛋白質(zhì)與分子量小的蛋白質(zhì)都必須穿過凝膠，移動(dòng)的路徑是相同的。分子量大的蛋白質(zhì)在膠孔中的摩擦力較大，移動(dòng)速度較慢，分子量小的蛋白質(zhì)在膠孔中的摩擦力較小，移動(dòng)速度較快。例題3-7:什么是蛋白質(zhì)的變性作用？引起蛋白質(zhì)變性的因素有哪些？解：蛋白質(zhì)的變性作用，是指蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象解體，多肽鏈由有序狀態(tài)成為伸展松散的無

48、規(guī)則狀態(tài)。變性作用一般不涉及肽鍵的斷裂，而主要是次級(jí)鍵斷裂。變性后的蛋白質(zhì)，溶解度降低，粘度增加，失去生物活性，失去結(jié)晶能力，易被蛋白酶水解。引起蛋白質(zhì)變性的因素有兩大類：物理因素：高溫、高壓、紫外線、超聲波。化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬、變性劑。例題3-8:蛋白質(zhì)化學(xué)研究中常用的試劑有：漠化割，尿素，隘基乙醇，胰蛋白酶，過甲酸，丹磺酰氯，6mol/L鹽酸，菌三酮，異硫割酸苯酯，和胰凝乳蛋白酶。為完成下列各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)選擇最合適的試劑。A. 一個(gè)小肽的氨基酸序列測(cè)定B. 多肽的N末端氨基酸測(cè)定C. 一個(gè)不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性D. 芳香族氨基酸殘基的短一側(cè)肽鍵的水解E. 甲硫氨酸的短基一側(cè)肽

49、鍵的裂解F. 通過氧化途徑將二硫鍵打開解：A.小肽的氨基酸序列測(cè)定用異硫割酸苯酯A. 多肽的N末端氨基酸測(cè)定用丹磺酰氯B. 不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性用尿素C. 芳香族氨基酸殘基的愈一側(cè)肽鍵的水解用胰凝乳蛋白酶D. 甲硫氨酸的愈基一側(cè)肽鍵的裂解用漠化割E. 通過氧化途徑將二硫鍵打開用過甲酸例題3-9:多聚谷氨酸在pH3.0以下的水溶液中形成a一螺旋，而在pH5.0以上的水溶液中卻為伸展?fàn)顟B(tài)，試解釋這個(gè)現(xiàn)象。在什么pH條件下，多聚賴氨酸會(huì)形成a-螺旋？解：氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的解離性質(zhì)對(duì)a一螺旋的形成有很大的影響。由單種氨基酸構(gòu)成的聚合物，只有當(dāng)側(cè)鏈基團(tuán)不帶電荷時(shí)才能形成a-螺旋。因?yàn)橄噜彋埢膫?cè)鏈

50、上帶有同種電荷會(huì)產(chǎn)生靜電排斥力，阻止a-螺旋的形成。谷氨酸側(cè)鏈的pKa為4.1，在pH3.0以下的水溶液中多聚谷氨酸側(cè)鏈幾乎不帶電荷，能夠形成a一螺旋。在pH5.0以上的水溶液中，多聚谷氨酸側(cè)鏈幾乎全部帶負(fù)電荷，不能形成a-螺旋，呈現(xiàn)伸展?fàn)顟B(tài)。賴氨酸側(cè)鏈的pKa為10.5,當(dāng)pH遠(yuǎn)高于10.5時(shí)，多聚賴氨酸的側(cè)鏈不帶電荷，可以形成a一螺旋。當(dāng)pH遠(yuǎn)低于10.5時(shí)，多聚賴氨酸的側(cè)鏈帶正電荷，呈現(xiàn)伸展?fàn)顟B(tài)。例題3-10:試解釋下列現(xiàn)象。用熱水洗滌羊毛衫時(shí)，羊毛衫會(huì)變長，但是在電熱干燥器內(nèi)干燥時(shí)，羊毛衫又會(huì)收縮。而絲綢制品經(jīng)過同樣的處理卻不收縮。解：羊毛纖維的多肽鏈的基本結(jié)構(gòu)單位是a-螺旋，每個(gè)氨基

51、酸殘基沿a-螺旋的軸向長度是0.15nm。在加熱條件下，纖維中的部分a一螺旋轉(zhuǎn)化為6折疊構(gòu)象。6一折疊中每個(gè)氨基酸殘基的軸向長度是0.65-0.7nm,所以羊毛纖維伸展變長。當(dāng)干燥以后，多肽鏈又由3-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)閍-螺旋構(gòu)象，羊毛纖維收縮。絲綢纖維中主要是絲心蛋白，多肽鏈由6-折疊構(gòu)象組成，在加熱條件下不會(huì)發(fā)生a-螺旋構(gòu)象與6-折疊構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)化，因此絲綢纖維在熱水洗滌和干燥時(shí)基本不會(huì)出現(xiàn)伸展和收縮現(xiàn)象。例題3-11:有一蛋白質(zhì)，在某組織內(nèi)含量較低，很難分離提純，現(xiàn)已知其分子量，并從其它實(shí)驗(yàn)室要來該蛋白質(zhì)的抗體，問用哪些實(shí)驗(yàn)方法可以初步證實(shí)組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)？解：先用根據(jù)這種蛋白質(zhì)的分子

52、量，選用一定濃度的聚丙烯酰胺作用分離膠，用SDS-PAG吩離從該組織中所提取得到的蛋白質(zhì)。然后，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，轉(zhuǎn)移到特定類型的薄膜上，最后用酶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測(cè)，觀察一種分子量的蛋白質(zhì)條帶是否呈陽性反應(yīng)。如果呈陽性反應(yīng)，則初步證實(shí)組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)。例題3-12:假定蛋白質(zhì)是在pH7.0低離子強(qiáng)度的溶液中，下述蛋白質(zhì)的哪些氨基酸殘基能形成:(1)a螺旋；(2)6折疊；無規(guī)則卷曲；(4)二硫鍵。Ile-Cys-Pro-Val-G1n-His-Tyr-Thr-A1a-Phe-Cys-Trp-Leu-Met-Pro-C1y-G1y-Hypro-Phe-Gly-5101520Ala-Gly-Ala

53、-G1y-Ser-Gly-Ala-Gly-Ile-Glu-Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp-Tyr-25303540LYs-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Cys-Glu-Ile-Gly-Ser-G1y-Ser-Gly-Ala-G1y-Ser-G1y-Arg-Arg-45505560Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Pto-Hypro65(2) 解：(1)a螺旋：414,29406折疊：20-28和58-50形成反平行的6折疊。(3) 無規(guī)卷曲：1519,4149(帶電荷的殘基)，5965。二硫鍵：2位或11位的Cys可以和47位Cys形成二

54、硫鍵。例題3-13:根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷一多肽鏈的氨基酸序列。(1) 酸水解和氨基酸組成為Ala2,Arg,Lys?,Met,Phe,Ser2。(2) 愈肽酶A水解得一氨基酸為Ala。(3) 胰蛋白酶水解得四個(gè)肽段，其氨基酸組成如下：Ala,ArgLys,Phe,SerLysAla,Met,Ser。(4) 漠化割水解得兩個(gè)肽段，其氨基酸組成如下：Ala,Arg,Lys2,Met,Phe,SerAla,Ser。(5) 嗜熱菌蛋白酶水解得兩個(gè)肽段，其氨基酸組成如下：Ala,Arg,SerAla,Lys2,Met,Phe,Ser。解：從(1)可知該肽為九肽。從(2)可知其C端為Ala。從(2)(3)

55、和胰蛋白酶的專一性可知如下肽段：(A)Ala-Arg(B)(Phe,Ser)-Lys(C)Lys(D)(Met,Set)-Ala從(4)和(2)可知：(E)-Met-Ser-Ala從(5)和嗜熱菌蛋白酶的專一性可知：(F)-Phe-(Ala,Lys2,Met,Ser)從(E)和(F)可知：(G)-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala從(A)(B)(G)可知該肽的氨基酸序列為Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala例題3-14:有三種未知的蛋白質(zhì)A、B、Co種蛋白質(zhì)主要是a螺旋構(gòu)象。另一種主要是6折疊構(gòu)象。還有一種是三股螺旋的膠原蛋白。用氨基酸分析儀測(cè)定了

56、每種蛋白質(zhì)的氨基酸組成。結(jié)果如表31所示，你能指出哪種蛋白質(zhì)相應(yīng)于哪種構(gòu)象嗎？為什么？表3-1三種蛋白質(zhì)的氨基酸組成(摩爾百分?jǐn)?shù))ABCABCAla29.45.010.7Leu0.56.92.4Arg0.57.25.0Lys0.32.33.4Asp1.36.04.5Met-0.50.8Cys-11.2-Phe0.52.51.2Glu1.012.17.1Pro0.37.512.2Gly44.68.133.0Ser12.210.24.3His0.20.70.4Trp0.21.2-Hypro-9.4Tyr5.24.50.4Ile0.72.80.9Val2.25.12.3解：蛋白質(zhì)A中含小側(cè)鏈的氨基酸

57、多，Gly、Ala和Ser共占86.2%，所以蛋白質(zhì)A是絲蛋白，是6折疊構(gòu)象。蛋白質(zhì)B中半胱氨酸的含量高，占11.2%，所以蛋白質(zhì)B是羊毛纖維，是Q螺旋構(gòu)象。蛋白質(zhì)C中，Gly占33%,Pro占12.2%,Hypro占9.4%,所以蛋白質(zhì)C是三股螺旋的膠原蛋白。例題3-15:什么是別構(gòu)效應(yīng)(變構(gòu)效應(yīng))?解：別構(gòu)效應(yīng)是指生物體內(nèi)具有多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)與變構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合后而引起其構(gòu)象的改變，從而蛋白質(zhì)分子改變生物活性大小的現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)。別構(gòu)效應(yīng)是生物體代謝調(diào)節(jié)的重要方式之一。例如：血紅蛋白分子是由四個(gè)亞基(a202)組成的蛋白質(zhì)。脫氧血紅蛋白分子由于分子內(nèi)形成了八對(duì)鹽鍵，使分子的構(gòu)象受到約束，構(gòu)象穩(wěn)定，和氧的親和力較弱。當(dāng)一個(gè)a-亞基與Q結(jié)合后，部分鹽鍵被破壞，某些氨基酸殘基發(fā)生位移，這時(shí)與氧的結(jié)合位點(diǎn)隨即暴露出來，使第二個(gè)a-亞基構(gòu)象改變，對(duì)氧的親和力增加而與氧結(jié)合。這樣又可以使兩個(gè)6-亞基依次發(fā)生構(gòu)象改變而以更高的親和力與氧結(jié)合。這時(shí)八對(duì)鹽鍵已經(jīng)全部斷裂，a162和a261之間的位移也達(dá)到7埃。血紅蛋白分子的變構(gòu)作用使得整個(gè)