動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1、第第 三三 章章動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程學(xué)細(xì)胞工程學(xué)第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn) 一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài) 適應(yīng)功能適應(yīng)功能, ,形態(tài)各異。形態(tài)各異。 離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類(lèi)：離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類(lèi)： 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面，自身分生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)。面上生長(zhǎng)。 兩種形態(tài)：兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型 上皮細(xì)

2、胞型上皮細(xì)胞型懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。兼性貼壁細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞 生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴支持物。如中國(guó)地鼠卵生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴支持物。如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠巢細(xì)胞，小鼠L929L929細(xì)胞。細(xì)胞。二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝v1.1.動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成v2.2.動(dòng)物細(xì)胞的代謝動(dòng)物細(xì)胞的代謝三、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)三、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) 細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 細(xì)胞分裂時(shí)間為細(xì)胞分裂時(shí)間為121248h48h， 細(xì)胞的分裂細(xì)胞的分裂 周期周期

3、= =間期間期+ +分裂期分裂期 間期（間期（G G1 1+S+G+S+G2 2） 分裂期（分裂期（M M）G G1 1期：期：4 46h 6h 合成合成DNADNA聚合酶聚合酶 RNARNA合成合成S S期：期：6 68h DNA8h DNA合成合成G G2 2期：期：2 25h DNA5h DNA量加倍量加倍, , RNA RNA合成合成M M期：期：0.50.51h 1h 染色體分裂染色體分裂細(xì)胞代數(shù)為細(xì)胞分裂次數(shù)細(xì)胞代數(shù)為細(xì)胞分裂次數(shù)傳代數(shù)表示細(xì)胞培養(yǎng)分種傳代次數(shù)傳代數(shù)表示細(xì)胞培養(yǎng)分種傳代次數(shù) 細(xì)胞代數(shù)細(xì)胞代數(shù)= =傳代數(shù)傳代數(shù)分種數(shù)分種數(shù)/2/2 X=(logN-logNo) X=(

4、logN-logNo)log2log2 X X 代數(shù)代數(shù) N N 培養(yǎng)最終細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)最終細(xì)胞數(shù) No No 培養(yǎng)起始細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)起始細(xì)胞數(shù) 倍增時(shí)間倍增時(shí)間= =培養(yǎng)經(jīng)過(guò)時(shí)間培養(yǎng)經(jīng)過(guò)時(shí)間代數(shù)代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì), ,并有接觸抑制并有接觸抑制現(xiàn)象?，F(xiàn)象。正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的。正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的。 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 有限細(xì)胞系有限細(xì)胞系 無(wú)限細(xì)胞系無(wú)限細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感. . 各種理化因素：滲透壓、各種理化因素：滲透壓、pHpH、離子濃度、離子濃度、剪切剪切 力、微量元素等。力、微量元素等。 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要

5、求高動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高 必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。能與細(xì)菌不同。 動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位：動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位： 游離核糖體：合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。游離核糖體：合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：合成蛋白質(zhì)是分泌的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。 動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn)缺點(diǎn): :培養(yǎng)條件高、成本貴

6、、產(chǎn)量低。培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :分泌胞外、純化方便、翻譯分泌胞外、純化方便、翻譯 后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得 一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求 原代細(xì)胞原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞原代細(xì)胞 是直接取自動(dòng)物組織器官是直接取自動(dòng)物組織器官, ,經(jīng)過(guò)粉經(jīng)過(guò)粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（10109 9/g/g）。）。 需要大量動(dòng)物，費(fèi)錢(qián)費(fèi)勞力。需要大量動(dòng)物，費(fèi)錢(qián)費(fèi)勞

7、力。 雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。胞、淋巴細(xì)胞。 二倍體細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系 原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代篩選克隆，從多種原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：染色體組型是染色體組型是2n2n核型；核型；貼壁依賴接觸抑制；貼壁依賴接觸抑制；可傳代培養(yǎng)可傳代培養(yǎng)5050代；代；無(wú)致瘤性。無(wú)致瘤性。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，常由于染色通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，

8、失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無(wú)限增殖能力。轉(zhuǎn)化過(guò)程可以是自而獲得無(wú)限增殖能力。轉(zhuǎn)化過(guò)程可以是自發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。4.4.融合細(xì)胞系融合細(xì)胞系(1)(1)仙臺(tái)病毒融合法仙臺(tái)病毒融合法(2)(2)聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法(3)(3)電融合法電融合法5.5.重組工程細(xì)胞系重組工程細(xì)胞系三、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選三、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選 在生產(chǎn)中采用更多的更有前景的是融合細(xì)在生產(chǎn)中采用更多的更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。胞及采用基因工程構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。 被用構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有：被用構(gòu)建工程

9、細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有： CHO-dhfr CHO-dhfr 、BHK-21BHK-21、 NamalwaNamalwa、VeroVero、 SP2/0SP2/0、 Sf-9 Sf-9 等細(xì)胞。等細(xì)胞。真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建 使用的載體有兩類(lèi)：使用的載體有兩類(lèi)：病毒載體病毒載體 牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體病毒載體病毒載體 牛痘病毒：牛痘病毒： 用構(gòu)建多價(jià)疫苗用構(gòu)建多價(jià)疫苗 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒： 用于基因治療。用于基因治療。 桿狀病毒：桿狀病毒： 用于外源基因表達(dá)。用于外源基因表達(dá)。 其

10、作為載體的其作為載體的 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 雙鏈雙鏈DNADNA，易重組，易重組 插入插入7 78kb DNA8kb DNA不影響正常病毒粒子的形不影響正常病毒粒子的形成。成。 多角體蛋白和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，多角體蛋白和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；形成有感染力病毒粒子；多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%20%30%30%；用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽(yáng)性

11、克隆。標(biāo)記物，選陽(yáng)性克隆。如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源基因?；?。 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增，在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增，都含有如下基本成分：都含有如下基本成分： 允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。 含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。 能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。 有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)?；蜉d體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選

12、基因載體導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞常用方法是：基因載體導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞常用方法是： 磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法 電穿孔法電穿孔法 磷酸鈣沉淀法：磷酸鈣沉淀法： 溶解的溶解的DNA DNA 加加NaNa2 2HPOHPO4 4和和CaClCaCl2 2 形成磷酸形成磷酸鈣沉淀，鈣沉淀， DNADNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNADNA磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時(shí)，則通過(guò)細(xì)胞吞噬作用而將時(shí)，則通過(guò)細(xì)胞吞噬作用而將DNADNA導(dǎo)入。導(dǎo)入。 電穿孔法：電穿孔法： 借助電穿孔儀的高壓脈沖電場(chǎng)，借助電穿孔儀的高壓脈沖電場(chǎng)，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性小孔，外源使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬

13、時(shí)可逆性小孔，外源DNADNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。貝數(shù)低。 BHK-21: BHK-21: 從從5 5只無(wú)性別的生長(zhǎng)只無(wú)性別的生長(zhǎng)1 1天的地鼠幼天的地鼠幼鼠腎臟中分離的鼠腎臟中分離的; ;成纖維樣細(xì)胞成纖維樣細(xì)胞, ,核型為核型為2n=44;2n=44;培養(yǎng)基為培養(yǎng)基為DMEMDMEM加加7%7%胎牛血清。用于增胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。四、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性四、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性 CHO

14、-K1CHO-K1：從中國(guó)地鼠卵巢中分從中國(guó)地鼠卵巢中分 離的上皮樣細(xì)胞。離的上皮樣細(xì)胞。 核型：核型： 2n=202n=202222。 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：DEMEDEME培養(yǎng)基培養(yǎng)基 0.1mmol/L0.1mmol/L次黃嘌呤，次黃嘌呤，0.1mmol/L0.1mmol/L胸苷，胸苷， 10%10%小牛血清，小牛血清， 加入脯氨酸。加入脯氨酸。 MRC-5MRC-5： 從正常男性肺組織中獲得的人二從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。倍體細(xì)胞系。 核型為核型為2n=462n=46。 屬成纖維細(xì)胞。屬成纖維細(xì)胞。 培養(yǎng)基用加小牛血清。培養(yǎng)基用加小牛血清。 同工酶同工酶G6PD BG6PD B

15、型。型。 有限壽命有限壽命42424646代。增殖速度較代。增殖速度較W1-38W1-38快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較W1-38W1-38低。對(duì)人的低。對(duì)人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。 Namalwa Namalwa： 從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類(lèi)淋巴母細(xì)胞。建成的人的類(lèi)淋巴母細(xì)胞。2.8%2.8%的高倍體率，的高倍體率，12121414條標(biāo)記染色體。單條條標(biāo)記染色體。單條X X，無(wú)，無(wú)Y Y。培養(yǎng)基為。培養(yǎng)基為RPMI 1640RPMI 1640，添加，添加7%7%胎牛血清。用于生產(chǎn)胎牛血清。用于生產(chǎn)干干擾素。擾素

16、。 Sf-9 Sf-9： 19831983年從親代年從親代IPLBSF21AEIPLBSF21AE中克中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲(chóng)的蛹卵組織中分隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲(chóng)的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒和其離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。它桿狀病毒高度敏感。 通常用的培養(yǎng)基為通常用的培養(yǎng)基為GraceGrace培養(yǎng)基，添加培養(yǎng)基，添加3.3g/L 3.3g/L 水解乳蛋白和水解乳蛋白和3.3g/L3.3g/L酵母浸液酵母浸液, 10%, 10%胎牛血清。用于高效表達(dá)外來(lái)蛋白制品。胎牛血清。用于高效表達(dá)外來(lái)蛋白制品。 Vero Vero： 從正常成年非洲綠

17、猴腎臟分離的。從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。 為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=602n=60； 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基為199199培養(yǎng)基，加培養(yǎng)基，加5%5%胎牛血清；胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒?；屹|(zhì)炎、狂犬病毒。 W1-38 W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。 核型為核型為2n=462n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用原，培養(yǎng)基用BMEBME（Eagle Basal mediumEagle Basal medium）10%10%小牛血清，小牛

18、血清，pH7.2,pH7.2,同工酶為同工酶為G6PD BG6PD B型。型。倍增時(shí)間為倍增時(shí)間為24h24h，有限壽命有限壽命5050代。代。安全，用于制備疫苗。安全，用于制備疫苗。 SP2/0-Ag14 SP2/0-Ag14：通過(guò)融合的方法，從有羊抗紅：通過(guò)融合的方法，從有羊抗紅細(xì)胞活性的細(xì)胞活性的BALB/c BALB/c 小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系胞系P3X63Ag8P3X63Ag8融合雜交瘤融合雜交瘤SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag 亞克隆亞克隆中分離獲得，中分離獲得， 能耐受能耐受8 8氮鳥(niǎo)嘌呤氮鳥(niǎo)嘌呤 20g/ml20g/ml但在含但在含HAT HAT

19、 選選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEMDMEM，添加添加10%10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。和抗體。 五、細(xì)胞庫(kù)的建立五、細(xì)胞庫(kù)的建立 生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)： 原始細(xì)胞庫(kù)原始細(xì)胞庫(kù) 生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)原始細(xì)胞庫(kù)原始細(xì)胞庫(kù) 貯存時(shí)須有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括：貯存時(shí)須有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括： 該細(xì)胞系的歷史該細(xì)胞系的歷史 該細(xì)胞系的特性該細(xì)胞系的特性 對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果 生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù) 從原始細(xì)胞庫(kù)來(lái)的，或從單

20、一安瓶來(lái)，從原始細(xì)胞庫(kù)來(lái)的，或從單一安瓶來(lái)，或從多個(gè)安瓶來(lái)即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增再或從多個(gè)安瓶來(lái)即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增再分裝儲(chǔ)存形成細(xì)胞庫(kù)。分裝儲(chǔ)存形成細(xì)胞庫(kù)。 需建擋案，進(jìn)行無(wú)菌性無(wú)細(xì)胞交叉污染需建擋案，進(jìn)行無(wú)菌性無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法一、動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法v優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單；培養(yǎng)條件比較均一；傳質(zhì)和操作簡(jiǎn)單；培養(yǎng)條件比較均一；傳質(zhì)和傳氧較好等。傳氧較好等。v缺點(diǎn)：難采用灌流培養(yǎng)。缺點(diǎn)：難采用灌流培養(yǎng)。v2.貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)v優(yōu)點(diǎn)：容易采用灌流培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：容易采用灌流培

21、養(yǎng)。v缺點(diǎn)：操作麻煩；需要合適的貼壁材料和足缺點(diǎn)：操作麻煩；需要合適的貼壁材料和足夠的面積；培養(yǎng)條件不易均一；傳質(zhì)和傳氧夠的面積；培養(yǎng)條件不易均一；傳質(zhì)和傳氧較差等。較差等。v3.貼壁貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）v（1）微載體培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)v60-250um的顆粒，創(chuàng)造大面積供細(xì)胞貼附生的顆粒，創(chuàng)造大面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)長(zhǎng) v載體體積小，比重輕，在輕度攪拌下即可攜載體體積小，比重輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基 v20世紀(jì)世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)各種疫苗年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)各種疫苗和細(xì)胞產(chǎn)品和細(xì)胞產(chǎn)品v理想的微載體具備的條件：微載體表面性

22、質(zhì)理想的微載體具備的條件：微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性，適于細(xì)胞附著、伸與細(xì)胞有良好的相容性，適于細(xì)胞附著、伸展和增殖；微載體的材料無(wú)毒性；微載體的展和增殖；微載體的材料無(wú)毒性；微載體的材料是惰性的；微載體的比重為材料是惰性的；微載體的比重為1.030-1.045g/ml；直徑在；直徑在60-250m，大小均一；，大小均一；具有良好的光學(xué)透明性；基質(zhì)的性質(zhì)最好是具有良好的光學(xué)透明性；基質(zhì)的性質(zhì)最好是軟性的；可耐軟性的；可耐120高溫，便于滅菌；經(jīng)簡(jiǎn)高溫，便于滅菌；經(jīng)簡(jiǎn)單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)使用；原料充分，單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)使用；原料充分，制作簡(jiǎn)便，廉價(jià)。制作簡(jiǎn)便，廉價(jià)。v第一代微載體

23、：固體微載體第一代微載體：固體微載體v第二代微載體：多孔微載體第二代微載體：多孔微載體v多孔微載體分類(lèi)：加鈦；不加鈦多孔微載體分類(lèi)：加鈦；不加鈦v（2）包埋和微囊培養(yǎng)）包埋和微囊培養(yǎng)v載體材料分類(lèi)：載體材料分類(lèi)：v人工合成的高分子聚合物；人工合成的高分子聚合物；v糖類(lèi)；糖類(lèi)；v蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。v包埋或微囊培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：包埋或微囊培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)： 保護(hù)細(xì)胞，避免了保護(hù)細(xì)胞，避免了剪切力的損害；剪切力的損害；可以獲得較高的細(xì)胞密度；可以獲得較高的細(xì)胞密度；有利于下游產(chǎn)物的純化；有利于下游產(chǎn)物的純化；可以采用多種可以采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。v（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)v原理：

24、細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再原理：細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。用懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。v（4）.多空載體培養(yǎng)法多空載體培養(yǎng)法 v近年發(fā)展的大規(guī)模高密度的培養(yǎng)方法近年發(fā)展的大規(guī)模高密度的培養(yǎng)方法 v多空載體是一種支撐材料，內(nèi)部有網(wǎng)狀小孔，細(xì)胞多空載體是一種支撐材料，內(nèi)部有網(wǎng)狀小孔，細(xì)胞可以在里面生長(zhǎng)可以在里面生長(zhǎng) v即可用于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)，又可用即可用于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)，又可用于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)于內(nèi)部，可免受攪拌于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)于內(nèi)部，可免受攪拌等機(jī)械損傷等機(jī)械損傷 v常用：陶瓷，明膠，纖維素及衍生物，聚苯乙烯等常用

25、：陶瓷，明膠，纖維素及衍生物，聚苯乙烯等材料材料v（5）.中空纖維培養(yǎng)法中空纖維培養(yǎng)法 v模擬體內(nèi)的三維培養(yǎng)狀態(tài)，模擬體內(nèi)的三維培養(yǎng)狀態(tài)，細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬人工毛細(xì)利用中空纖維模擬人工毛細(xì)血管供給營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞高密血管供給營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞高密度生長(zhǎng)度生長(zhǎng) v材料有硅膠，聚砜，聚丙烯材料有硅膠，聚砜，聚丙烯等，為半透膜等，為半透膜二 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器v理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器具備的基本要求：理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器具備的基本要求：v制造生物反應(yīng)器所用的所有材料必須無(wú)毒；制造生物反應(yīng)器所用的所有材料必須無(wú)毒；具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；密封性能良好；。密封性能良好；。v最早于最早于1984年由英國(guó)科學(xué)家年由英國(guó)科學(xué)家Spier發(fā)明。發(fā)明。 v將細(xì)菌發(fā)酵罐進(jìn)行改進(jìn)。將細(xì)菌發(fā)酵罐進(jìn)行改進(jìn)。v該裝置的主要特點(diǎn)是可以避免在向培養(yǎng)基中該裝置的主要特點(diǎn)是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時(shí)氣泡直接損傷細(xì)胞。通氣時(shí)氣泡直接損傷細(xì)胞。 v同時(shí)在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)同時(shí)在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中。被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中