熒光定量PCR詳細流程和問題解析

1、熒光定量PCR羊細流程和問題解析普通PCRt熒光定量PC曲術(shù)區(qū)別？簡單的講PC曲術(shù)最早是用于擴增一段特異的PCRt段，用于克隆、測序等實驗，后來也將其用于樣本中特異的PCRt段有無或非很粗的相對定量，而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測定樣本中特異的PCRt段相對及絕對量，是一種測定特異的PCR片段含量的方式。如測定病人樣本中病原體的含量、實驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人講過普通PCRt,通過電泳也可以進行定量，其實是將PCFT物的定量與PCR羊本中模板定量相混了。近兩年沒有人再講這類的話了。SybrGreen、TaqmanMolecularbeacon、LUX這些方法如何選擇？從實

2、驗成本來講，SybrGreen是最好的，基本上就是普通PC劭口上一點SybrGreenI熒光染料即可，其信號強度也很好，還可以進行融解曲線分析等，但缺點是只能在一個反應(yīng)管內(nèi)進行一種PC阪應(yīng)的檢測，另一個問題是非特異性擴增會影響實驗結(jié)果，當然也有一些技術(shù)解決這些問題，后面會講到。對于研究人員來講，如果需要檢測的基因很多，而每個反應(yīng)管中進行一種PC網(wǎng)應(yīng)的檢測可以滿足實驗要求，則SybrGreen是最好的選擇。如果需要進行多通道實驗，即在一個反應(yīng)管中進行2種或以上的反應(yīng)，則要選擇其他的方法，最常用的是TaqmanMolecularbeacon,這兩種都是探針的方式，由于增加了探針的特異性，因此其擴增

3、曲線反映的就是特異性產(chǎn)物的擴增曲線，不含有非特異性擴增的成分。因此商業(yè)用途的檢測試劑盒大都采用這一技術(shù)，以減少非特異性產(chǎn)物造成錯誤結(jié)論的可能性。具缺點在于探針成本較高，有時設(shè)計的探針并不合適，有造成損失的可能性。并且要進行較多的實驗條件的優(yōu)化。這兩種探針技術(shù)用于商業(yè)目的時都有專利問題，據(jù)說取得Molecularbeacon的許可權(quán)的成本相對較低，但只是據(jù)說。另一種值得一提的是LUX探針，它也可進行多通道實驗，但它沒有Taqman和Molecularbeacon方法的增加探針特異性的功能，因此只能是一種折中的方案，如果不考慮多通道實驗，則不如SybrGreen法選擇單通道實驗還是多通道實驗？這是

4、要根據(jù)實驗需要來選擇的，如果有一個、兩個或是三個基因要進行比較，并用看家基因進行對照，可以考慮選擇多通道實驗。多通道實驗的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應(yīng)以及探針要在同一個反應(yīng)條件下進行，并且效率都要比較高，另一個困難是要求相互之間沒有干擾，因為干擾會影響到實驗結(jié)果。還有一個困難是當一個基因的模板數(shù)顯著大于其他基因時，因為共用核甘酸等資源的原因，會讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱?。因此一般兩通道的實驗比較多些，即一個基因進行多樣本比較，用看家基因進行對照?？梢钥闯?，如果單通道實驗可以解決問題，就不要選擇多通道實驗了。三個以上的基

5、因進行比較時就最好用單通道。因為一般的儀器最多也只有四個通道，就是有更多的通道，實驗條件的優(yōu)化也是足夠麻煩了。雙通道實驗時如何克服反應(yīng)條件、干擾以及模板數(shù)差別很大等困難？對于反應(yīng)條件的優(yōu)化，可通過兩個單獨實驗的標準曲線來優(yōu)化，主要是復(fù)性溫度,可用PCRZ的溫度梯度功能來選擇，然后找到一個合適的復(fù)性溫度。對于如何確定是否存在相互干擾，則要通過兩個獨立的單通道實驗與雙通道實驗的結(jié)果進行比較，如果差別不大，則表明沒有干擾。至于模板數(shù)差別很大的問題，可以通過降低引物濃度的方法來實現(xiàn)，即primerlimited,在一般的PCR5應(yīng)中，引物的濃度是足夠高的，基本上可以將反應(yīng)液中的核甘酸全部消耗盡，在優(yōu)化

6、引物濃度時，用不同的引物濃度進行實驗，找到不影響反應(yīng)的C值的最低引物濃度。這樣在實際反應(yīng)中，模板數(shù)高的基因在引物耗盡后，反應(yīng)液中仍然有足夠的核甘酸等用于另一個基因的反應(yīng)。引物設(shè)計中的幾個注意事項1、引物設(shè)計最好用相關(guān)的軟件來進行設(shè)計，考慮引物自身回折、錯配、引物二聚體、復(fù)性溫度、產(chǎn)物變性溫度等問題，其中產(chǎn)物的變性溫度是大家不太關(guān)心的問題，但有些產(chǎn)物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會嚴重影響實驗結(jié)果。2、引物所設(shè)計的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，最好到互聯(lián)網(wǎng)中進行相關(guān)的搜索，看在樣本的基因組有沒有相擬的基因以及假基因等，如果有，則可選擇特異性更高的區(qū)域。3、在進行mRNAft達量的定

7、量，可以在引物設(shè)計時考慮基因組的污染問題，即在引物設(shè)計時讓兩個引物跨一個內(nèi)含子，這樣基因組污染所造成的擴增可以區(qū)別出來，或因為片段過大而不能擴增4、由于mRNA1達量的定量有一個逆轉(zhuǎn)錄白過程，如果逆轉(zhuǎn)錄是用poly(T)作引物，則設(shè)計的片段盡量靠近poly(A),以免逆轉(zhuǎn)錄的效率影響到實驗結(jié)果。如果用特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄，則要考慮引物區(qū)是否存在RNAZ級結(jié)構(gòu)的問題5、產(chǎn)物片段的大小：定量PCR-般產(chǎn)生片段都不大，不會超過600bp。SybrGreen法一般選擇250-600bp,過大會影響到PCRT增的效率，過小則很難通過融解曲線與引物二聚體分開，但并不是絕對的。Taqmanfe的擴增片段都很

8、小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecularbeacon法對片段大小的要求不高，只要不是太長即可。SybrGreen法的實驗策略：實驗可分為三個階段，即實驗條件的優(yōu)化、預(yù)實驗和正式實驗。一、實驗條件的優(yōu)化階段，這一階段是最花時間的，1、要找到一個陽性的模板，可以是克隆有基因質(zhì)粒、強陽性樣本或純化的PCR產(chǎn)物等。有了陽性的模板才能進行最基本的定量擴增實驗，如果有普通PCR勺實驗條件，也可以此為基礎(chǔ)進行實驗。2、擴增出的產(chǎn)物要通過電泳方法確定其大小，以確認定量PCFT增的產(chǎn)物是你的目的基因，有些用戶就發(fā)生過優(yōu)化了幾天的條件才發(fā)現(xiàn)擴增片段的大小不對，不是自己想要的基因。當然，能測個序什

9、么的最好。并通過融解曲線實驗來確定產(chǎn)生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經(jīng)足夠，個別情況下會出來解鍵不充分的現(xiàn)象。3、有了基本的PCR條件后，要將陽性模板進行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對照，分成多份進行溫度梯度實驗，對復(fù)性溫度進行優(yōu)化，以找出復(fù)性溫度范圍，復(fù)性溫度最好能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCFT增效率都很高、陰性模板沒有擴增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實驗的穩(wěn)定性，不會因為樣本管在加熱模塊中的位置不同而影響實驗結(jié)果。4、如果找不到合適的條件，如引物二聚體過多，可對引物濃度、Mg2nffi子濃度、DMS尊量等進行優(yōu)化，然后再進行復(fù)性溫度梯度實驗。其中Mg

10、2喀子濃度、DMSO含量都會影響Tm值以及所用的變性溫度。二、預(yù)實驗階段按照優(yōu)化的條件對所需要分析的樣本做一個沒有重復(fù)的實驗，每個樣本做一個10倍和100倍稀釋的實驗，預(yù)實驗的目的主要有兩個，一是了解樣本的模板濃度范圍，如果有樣本的模板濃度在標準曲線之外，如過高或過低，則可能要對標準曲線進行重新優(yōu)化，當然，如果過高和過低不影響你的實驗結(jié)論則可定為高于多少或低于多少，直接進行外推是不科學的。另一個目的看樣本中是否有PCR卬制物的影響，如果每個樣本的定量結(jié)果與其10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果相同，則表明沒有抑制物的影響，如果不同，如原倍結(jié)果為零，而10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果為陽性，則表明樣

11、本中PCF卬制物濃度較高?？捎镁?0及100倍稀釋后的樣本進行定量。有幾個用戶發(fā)現(xiàn)過實驗為陰性的樣本在其10及100倍稀釋后的樣本為陽性的，也許有更多用戶沒有進行這樣的實驗，得到了錯誤的結(jié)論。因為樣本RNA勺提取試劑中經(jīng)常有抑制PCFK應(yīng)的物質(zhì)，清洗不干凈就會影響到定量PC就應(yīng)。三、正式實驗階段然后就可以進行正式實驗了，只需要將每個樣本作三個或更多的重復(fù)即可以了。有抑制物的樣本先進行稀釋，計算濃度時不要忘記就行了。最后就可以進行實驗結(jié)果分析了，個別樣本中離群的數(shù)值可以刪除。SybrGreen法的注意事項1、最好按照上面提到策略進行實驗，以免造成不必要重復(fù)實驗，從而降低實驗成本2、SybrGre

12、enI一般是先將母液用DMS(行稀釋100倍，最終的使用濃度為4000-10000分之一?？赡懿煌腟ybrGreenI母液的稀釋倍數(shù)不同，可通過實驗來證明，但高濃度的SybrGreenI肯定會影響PCR應(yīng)。另外用水稀釋后的SybrGreenI保存的時間很短，一般1周后就不能用了。DMSOZ乎反復(fù)凍融會影響性能，但原因不明。3、在對引物濃度、Mg2+5子濃度、DMSO量等進行優(yōu)化后仍得不到滿意的結(jié)果，特別是引物二聚體很多時，可以考慮更換引物，因為引物成本低，而優(yōu)化實驗成本很高。4、當有少量引物二聚體影響熒光結(jié)果時，可以提高熒光讀板時的溫度來消除引物二聚體的影響，如將讀板時的溫度提高到82度，此

13、時引物二聚體已經(jīng)解鏈而產(chǎn)物沒有解鏈。但引物二聚體濃度很高時會嚴重影響PCR5應(yīng)，消除引物二聚體的影響也沒有用。5、大家都知道進行絕對定量需要標準曲線，有些用戶認為進行相對定量時就不需要標準曲線了，可以通過2AAC(t)來計算，但這一計算是有條件的，即所有熒光定量PCRT增的效率都接近于100%可以通過實驗來證明。但大多數(shù)用戶并沒有進行這樣的實驗就直接用2AAC(t)來計算了。這是錯誤的，會得到錯誤結(jié)論。6、無論是使用自配的試劑還是用商業(yè)的熒光定量試劑盒，最好買夠試劑，以免進行預(yù)實驗或正式實驗時沒有試劑而必需采用其他試劑，由于不同試劑的緩沖液成份有較大差別，如有的試劑中含有DMSCRMg2+5子

14、等，可能會影響到實驗結(jié)果，甚至要重新進行實驗條件的優(yōu)化。7、不要在管蓋上寫字，原因很明顯，但有些用戶習慣了寫字，后來再擦掉，也會對實驗有些影響。8、最好使用高質(zhì)量的PCRt,低質(zhì)量管的管間差可能會很大。9、每次實驗一定要有陽性對照和陰性對照，以免出現(xiàn)問題時找不到原因。10、在樣本很珍貴時可以采用對樣本進行稀釋的方式進行定量。只要濃度不是太低，理論來講對稀釋是不會影響實驗結(jié)果的。其他方法也可以采用類擬的策略，以節(jié)約成本，提高效率想到的內(nèi)容就這些了，希望大家多批評指正反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化來源：作者：發(fā)布時間：2008-10-171. SG濃度：終濃度1:5,000-1:100,000,一般為1:1

15、0,0001:70,0002. Primer濃度：終濃度50nlVk300nM固定摸板濃度的梯度實驗不加摸板的對照實驗（NTC有無非特異信號熔解曲線的分析一一是否單峰建議使用HPLCM化的引物3. MgCl2濃度降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物最低可至1.5nM同時做梯度實驗和NTC對照4. 反應(yīng)溫度和時間參數(shù)反應(yīng)溫度參考所用酶的種類退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化反應(yīng)時間與常規(guī)PC戲似，擴增片斷一般為200300bp5. TaqMan探針引物、探針設(shè)計：首先選擇探針序列探針的Tm值為68-70度，長度不應(yīng)超過30堿基探針的5端不應(yīng)是G,G有可能會淬滅熒光素引物應(yīng)盡量靠近探針，擴增片斷不超過4

16、00bp,通常為80-150bp引物的Tm值為5960度，長度約20堿基避免引物、探針之間的二級結(jié)構(gòu)委托合成公司設(shè)計使用輔助軟件確定反應(yīng)參數(shù)一般為兩步法，94度1020s60度3060s（Taq酶的5外切酶活性在60度最強）通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度三步法，72度45s優(yōu)化引物探針濃度目標：最高的信號/背景比最小的Ct值引物濃度：50nM-900nM探針濃度：50nM-250nM通過多次實驗確定各自的濃度和比例RealtimePCR經(jīng)驗從RNA的提取到PCR一：引物的設(shè)計引物的設(shè)計對于這個實驗至關(guān)重要，因為realtimepcr的檢測靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。普通的要求規(guī)則

17、大家都知道，還有幾點必須注意：1,引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR&樣能嵌入進去，結(jié)果導致實驗結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）。2,引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。realtimePCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結(jié)果誤差很大，不可信）。3,引物設(shè)計要跨內(nèi)含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA虧染的話，因為DNAk含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。4,引物設(shè)計的時候要盡可能設(shè)計在同一退火溫度

18、，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設(shè)計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。5,注意引物設(shè)計好后的產(chǎn)物長度。REALTIMEPCR的最佳產(chǎn)物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實驗誤差，但是我對這個說法持懷疑態(tài)度。產(chǎn)物長度越大，SYB敬入的越多，這樣才能夠保證最后的熒光值比較可信）。6,不同的管家基因擴增效率不同。所以在做整個實驗之前應(yīng)該做一次檢測擴增效率的實驗。如果擴增效率相差太大，就不能使用delt,deltCt法來比較基因表達量的高低。二：模板的要求歸根

19、到底，REALTIMEpcr想要檢測的是目的基因表達量的高低，所以對整個實驗過程中模板的質(zhì)量要求必然很高，我以自己的一些經(jīng)驗說一下操作過程中的一些關(guān)鍵點：1,用TRIZOL提取RNAt范圍要求。細胞數(shù)必須在一個范圍之內(nèi)才能提取出高質(zhì)量的RNA所以我們在提取前必須知道細胞數(shù)（一般6孔板中兩個孔就可以提取出RNA。2,加入氯仿抽提過程中盡可能不要吸到中間層（中間層為基因組DNA對上機做REALTIMEPCRf艮不利，會導致起始熒光值很高，無法跑出完整的擴增曲線）。3,提取完后用乙醇溶解要盡可能使得乙醇揮發(fā)掉，但是不要過分揮發(fā)。（乙醇沒有揮發(fā)干凈會對后續(xù)的擴增效率有影響。在乙醇存在的情況下，DNA更

20、加難溶，這就是醇沉的道理。但是過分揮發(fā)，RNA又不溶于水，會造成后續(xù)反轉(zhuǎn)錄量不圖）04,反轉(zhuǎn)錄過程的操作盡可能在冰上。我們用的是OLIGODT18為了盡可能的消除RNAi間的二聚體，我們將RNAF口OLIGODT18在一起70度變性10分鐘后，馬上冰浴2分鐘，再加入后續(xù)的MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITORSLV后在37-40度下一個小時完成延伸過程（也有的步驟上將RNAfe70度變性10分鐘,再力口入OLIGODT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASHIBITOR,MLV但是在變性完再力口OLIGCDT18時，加的比較晚的管子有很大的可能RNAR重新形成二聚體，導致前面的變性沒有意義）。5,反轉(zhuǎn)錄完后將cDNA-20度保存，盡可能不要反復(fù)凍融（可以以10UL為一個單位來分裝cDNA。6,在加樣的過程中需要特別注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，這樣可以消除不同管之間引物濃度的差異。（2）最后加模板的時候需要一把很準確的移液器，以便確保每次加進去的樣一致，注意不要沾管壁（大部分人說需要混勻，