本科畢業(yè)論文標(biāo)準(zhǔn)定稿格式規(guī)范

1、欽 州 學(xué) 院本科畢業(yè)論文(設(shè)計高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留院 系 海洋學(xué)院專 業(yè) 食品科學(xué)與工程 (食品科學(xué)方向 學(xué) 生 班 級 食品本 081姓 名 潘珍鳳學(xué) 號 0811402124指導(dǎo)教師單位 欽州學(xué)院指導(dǎo)教師姓名 蔡秋杏指導(dǎo)教師職稱 講師2012年 4月高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留 食品科學(xué)與工程 2008級 潘珍鳳指導(dǎo)教師 蔡秋杏摘要本研究采用高效液相色譜法測定蝦肉中 4種硝基呋喃類藥物代謝物 SEM 、 AHD 、 AOZ 、 AMOZ 。樣品加入三氯乙酸 -甲醇和鄰氯苯甲醛在 40水浴條件下 振蕩提取同時進(jìn)行衍生化 12h ,然后離心,將提取液 pH

2、 值調(diào)節(jié)至 7.0左右,用 2倍 體積乙酸乙酯萃取衍生物,氮?dú)獯蹈扇軇┖笤儆?1 mL50%乙腈水溶液溶解殘?jiān)? 高效液相色譜法檢測,外標(biāo)法定量。本方法簡化了操作步驟,穩(wěn)定性好,添加量 在 0.220nmol 范圍時, 4種硝基呋喃類代謝物回收率在 77.8%98.8%之間, 相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 15%。 SEM 、 AHD 、 AOZ 、 AMOZ 的檢測限分別為 0.93ng/g、 1.40ng/g、 0.84ng/g、 1.90ng/g。關(guān)鍵詞 :硝基呋喃類藥物;高效液相色譜法;殘留High performance liquid chromatographic method for de

3、tection of nitrofurans drugs residue in the shrimpsFood Science and Engineering 2008 Pan ZhenfengInstructor Cai QiuxingAbstractIn this study, the HPLC method was used for the determination of four nitro furan drugs metabolites SEM, AHD, AOZ, AMOZ in the shrimps. The different samples with acetic aci

4、d-methanol and adjacent chlorobenzene formaldehyde were bathed in 40 water conditions at the same time the oscillation extraction for 12h,then centrifuged, adjusted the pH 7.0, with 2 times the volume of ethyl acetate extracted derivatives, and then with 1 mL50% acetonitrile solution dissolved the r

5、esidue after nitrogen blowed solvent dry, and high performance liquid chromatography (HPLC was used for the determination, external standard method was used for quotation. The method simplified the procedures, had good stability, with the addition amount in 0.220nmol range, four nitro furan kinds of

6、 metabolites' recovery range were between 77.8% and 98.8%, the relative standard deviation were less than 15%. The limit of detections for SEM, AHD, AOZ, AMOZ were 0.93ng/g and 1.40ng/g and 0.84ng/g and 1.90ng/g.Key words: Nitrofurans, HPLC , Residues目錄1.8 課題研究目的及意義 . 63 結(jié)果與分析 . 9 3.1 衍生溫度的確定 .

7、9 3.2 提取方式的影響 . 11 3.3 提取時間的影響 . 13 3.4 線性關(guān)系、線性范圍的確定 . 14 3.5 檢測限的確定 . 163.6 加標(biāo)回收率和精密度 . 164 討論 . 195 小結(jié)與展望 . 20 致謝 . 21 參考文獻(xiàn) . 22欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計1前言1.1 選題研究背景我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)與出口大國 , 自 20世紀(jì) 80年代以來 , 我國的水產(chǎn)品產(chǎn)量一 直居世界首位,然而制約我國水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的突出問題 , 其中之一便是水產(chǎn)品的質(zhì) 量安全問題, 其中就包括藥物殘留超標(biāo)。 目前常見的因殘留超標(biāo)引起水產(chǎn)品質(zhì)量 安全事件的藥物主要有氯霉素、孔雀石綠、硝基呋喃類代謝

8、物和甲醛等 , 當(dāng)人們 食用了殘留超標(biāo)的水產(chǎn)品后 , 會出現(xiàn)不同程度的中毒反應(yīng) , 輕者影響健康 , 重者危 及生命。 而硝基呋喃類藥物在水產(chǎn)品中的殘留問題是近年來我國水產(chǎn)品出口中重 點(diǎn)監(jiān)控的項(xiàng)目 1。中國是對蝦養(yǎng)殖大國, 但是近年來, 硝基呋喃類藥物殘留超標(biāo)事件仍時有發(fā) 生。 2008年 1月 22日,我國產(chǎn)速食蝦就因檢測出含有硝基呋喃而被歐盟食品和飼 料委員會通報。在 2010年度水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全監(jiān)督抽查結(jié)果中,廣東、海南、福 建等地部分生產(chǎn)單位的蝦苗、羅非魚苗中檢測出硝基呋喃類代謝物。硝基呋喃類藥物是人工合成的具有 5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物, 常 用于治療和預(yù)防沙門菌、大腸埃希

9、菌感染引起的豬、魚、禽類消化系統(tǒng)感染 2, 但是長時間或大劑量應(yīng)用硝基呋喃類藥物及其代謝物均能使動物體產(chǎn)生毒性作 用,還有致畸致癌致突變的副作用。1.2 硝基呋喃類藥物的應(yīng)用情況在我國, 硝基呋喃類藥物曾經(jīng)得到廣泛使用。呋喃唑酮在畜禽養(yǎng)殖、 水產(chǎn)養(yǎng) 殖上應(yīng)用非常廣泛,曾廣泛用于防治畜禽腸道感染、防治水生動物疾病。作為醫(yī) 藥,呋喃唑酮用于治療細(xì)菌和原蟲引起的腹瀉、結(jié)腸炎和霍亂等 3。呋喃西林一 般用作外用消毒藥物,也有拌餌投喂防治水生動物疾病的報道 4。從藻類中提取 的卡拉膠 (食品增稠劑 中也存在呋喃西林 5。此外,硝基呋喃類藥物也有可能添 加到化妝品種以實(shí)現(xiàn)某些功效。由于硝基呋喃類藥物及其代

10、謝物具有毒性, 目前國內(nèi)外都對該類物質(zhì)的使用 控制相當(dāng)嚴(yán)格。美國 21CFR530.41規(guī)定:食源性動物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥 因。 韓國 2002年版 食品公典 規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮。 歐盟 EEC2377/90潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留規(guī)定動物源性食品中不得檢出硝基呋喃 (包括呋喃唑酮 6。我國農(nóng)業(yè)部于 2002年 將硝基呋喃類抗生素列入食品動物禁用的獸藥及其化合物清單 (農(nóng)業(yè)部公告 193號 ,從 2003年開始,將硝基呋喃納入殘留監(jiān)控計劃中。1.3 硝基呋喃藥物的簡介硝基呋喃類藥物主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮,是人 工合成的具有 5-硝

11、基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物, 這類藥物具有以下共同化學(xué) 結(jié)構(gòu) 7 :硝基呋喃類藥物常用于治療和預(yù)防沙門菌、大腸埃希菌感染引起的豬、魚、 禽類消化系統(tǒng)感染,具有高效抗菌作用和促生長作用。硝基呋喃類藥物對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、 某些真菌和原蟲均 有作用, 在低濃度下對上述病原體有抑制作用, 高濃度則有殺滅作用, 其抗菌作 用機(jī)理是干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng),使細(xì)菌代謝紊亂 8。1.4 硝基呋喃類藥物的特性呋喃西林,亮黃色結(jié)晶性粉末,難溶于水,微溶于乙醇,屬于抗感染常用的 藥物, 能干擾細(xì)菌的糖代謝過程和氧化酶系統(tǒng)而發(fā)揮抑菌或殺菌作用, 其抗菌譜 較廣,對多種革蘭氏陽性和陰性菌有抗菌

12、作用, 對綠膿桿菌抗菌力弱, 對假單孢 菌屬及變形桿菌屬有耐藥性。呋喃妥因,難溶于水,微溶于乙醇,具有廣譜抗菌性質(zhì),主要用于水產(chǎn)中疾 病預(yù)防和治療,對葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌等有良好的抗菌作用;對變形 桿菌、沙雷桿菌等作用較弱;對綠膿桿菌無效。呋喃妥因內(nèi)服吸收較快,體內(nèi)消 除快,此藥由尿的排出量大,故主要用于治療尿道感染。呋喃唑酮, 幾乎不溶于水和乙醇,其抗菌譜類似呋喃妥因,對消化道的多數(shù) 菌有抗菌作用,此外對梨形鞭毛蟲、滴蟲也有抑制作用。該藥具有性質(zhì)穩(wěn)定、價 格低廉、 不易產(chǎn)生耐藥性、 抗菌效力不受膿汁影響等特點(diǎn)。 呋喃唑酮內(nèi)服后難吸 收,腸中濃度高而血中濃度低,故適用于各種腸道感染的治

13、療。欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計1.5 硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝呋喃西林、 呋喃妥因、 呋喃它酮、 呋喃唑酮的代謝產(chǎn)物分別是氨基脲 (SEM、 1-氨基 -乙內(nèi)酰脲 (AHD、 5-甲基嗎啉 -3-氨基 -2-噁唑烷基酮 (AMOZ、 3-氨基 -2-噁 唑烷基酮 (AOZ。硝基呋喃類藥物半衰期很短,在動物體內(nèi)能迅速代謝 9。但是它的代謝產(chǎn)物 卻能與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成比原藥化合物更穩(wěn)定的結(jié)合態(tài),很難進(jìn)一步降解, 常用 的食品烹飪方法如蒸煮、 烘烤和微波加熱等均無法使代謝物降解, 清養(yǎng)數(shù)周后仍 可在體內(nèi)檢測到,所以檢測硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物,更能起到監(jiān)控作用 10。 呋喃唑酮進(jìn)入體內(nèi)后,代謝非常迅

14、速。呋喃唑酮停藥后 12小時從組織中消 失,而其代謝物 AOZ 在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在,在體內(nèi)可殘 留數(shù)周,在停藥后至少 6周內(nèi) AOZ 在豬肌肉組織中繼續(xù)存在。動物肝臟為主要 的藥物代謝器官, 蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)的殘留藥物主要累積在肝臟, 呋喃唑酮?dú)埩粞芯?常以肝臟作為殘留靶組織進(jìn)行檢測。1.6 硝基呋喃類藥物及其代謝物的危害硝基呋喃類藥物及其代謝物具有相當(dāng)大的毒性和副作用, 能誘導(dǎo)有機(jī)體基因 突變,有致畸胎的誘導(dǎo)作用, 且能誘發(fā)癌癥。 硝基呋喃類藥物的代謝物可以在弱 酸性條件下 (如人類胃液的酸性條件 從蛋白質(zhì)中釋放出來, 因此當(dāng)人類吃了含有 硝基呋喃類抗生素殘留的食品, 這些代

15、謝物就可以在人類胃液的酸性條件下從蛋 白質(zhì)中釋放出來被人體吸收而對人類健康造成危害 11。 呋喃西林在該類藥物中毒 性最大, 而呋喃唑酮是該類藥物中最具代表性的一種。研究表明:蛋白結(jié)合態(tài)的 呋喃唑酮?dú)埩粑锖蟹Q為 3-氨基 -2-唑酮(AOZ 的完整側(cè)鏈,在人胃的弱酸性 條件下,側(cè)鏈可以從蛋白結(jié)合態(tài)的母體分子上解離下來, AOZ 可以代謝成為 -羥乙基肼, 該代謝物是致突變和致癌化合物。 同樣硝基呋喃類物質(zhì)的其他代謝 物 SEM 、 AHD 、 AMOZ 也能在體內(nèi)與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合態(tài)長期存 在,對人體產(chǎn)生毒副作用 12。 3-氨基 -2-噁唑烷基酮(AOZ 作為呋喃唑酮的代 謝物

16、,其致畸致突變毒性已被證明,更重要的是 AOZ 不但能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合后 很難消除,而且釋放一種誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì) 13。潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留1.7 硝基呋喃類藥物殘留的檢測方法及其研究進(jìn)展現(xiàn)有動物體內(nèi)硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法主要有液相色譜法, 液相色 譜 _質(zhì)譜法, 液相色譜 _串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法, 以及很少報道的高效毛細(xì)管電 泳安培法 14。高效液相色譜法是以液體為流動相, 采用高壓輸液系統(tǒng), 將具有不同極性的 單一溶劑或不同比例的混合溶劑、 緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱, 在 柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測,從而對試樣進(jìn)行分析。高效

17、液相色譜法具備分離效能高、 選擇性高、檢測靈敏度高、檢測器的重復(fù) 性好、線性范圍寬、分析速度快、操作自動化等特點(diǎn),可用于分離高沸點(diǎn)、相對 分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物,還可用于各種離子的分離分析。高效液相色譜儀的主要部件有:貯液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢 測器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。 其基本的工作流程是:貯液罐中的流動相被高壓 泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相, 被流動相載入色譜柱內(nèi), 由于樣品 溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對運(yùn)動時, 經(jīng)過反 復(fù)多次的吸附 -解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離 成單個組分依次從柱內(nèi)流出, 通

18、過檢測器時, 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記 錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來 15。葛寶坤 12等采用高效液相色譜法快速測定雞肉、 魚、 蝦中硝基呋喃類藥物殘 留量,得到 4種硝基呋喃類藥物在 3個不同水平的添加回收率為 87%102%,檢 出限分別為 5µg/kg、 2µg/kg、 3µg/kg、 2µg/kg。景立新 16等采用高效液相色譜法, 檢測海蝦中呋喃唑酮?dú)埩袅? 得到檢測下限為 1.0µg/kg, 回收率為 89.7%94.7%。欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計耿金培 17等用高效液相色譜法檢測飼料中的四種硝基呋喃類藥物,得到呋喃它 酮、

19、呋喃西林、呋喃妥因檢出限為 0.25mg/kg,呋喃唑酮的檢出限 0.12mg/kg,在 添加濃度 0.55mg/kg水平時平均回收率大于 70%。刁石強(qiáng) 18等用高效液相色譜 法測定水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥中呋喃唑酮?dú)埩袅?得到回收率 88.2%92.6%,檢出限為 1.0µg/mL。 王蕾 19等采用乙腈提取飼料中 4種呋喃類藥物, 結(jié)果表明 4種硝基呋喃 類藥物加標(biāo)回收率大于 70%98%,呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮 的檢測限依次為 0.020、 0.020、 0.020和 0.100µg/mL。據(jù)文獻(xiàn)報道,一般飼料中硝基呋喃類藥物的分析方法主要局限于液相色譜 法,高

20、效液相色譜法耗時較長并且消耗的溶劑量大,經(jīng)濟(jì)效益不高。 超高效液相 色譜法, 可以補(bǔ)充高效液相色譜法的不足, 還可以改善峰型, 達(dá)到更低的檢出限。 彭鶯 20等人經(jīng) MCX 固相萃取小柱凈化后用超高效液相色譜法測定, 4種硝基 呋喃類藥物在 0.125mg/L均與對應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系,添加質(zhì)量濃度為 0.25mg/kg、 5mg/kg和 100mg/kg時,回收率在 79.6%85.5%之間,檢出限為 0.25mg/kg。李耀平 21等采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測烤鰻蝦中硝基呋喃 類代謝物殘留,設(shè)計了 4個添加水平,即 0.2g/kg、 0.5g/kg、 1.0g/kg、 2.0g/k

21、g, 得到四種硝基呋喃類代謝物的檢測限均為 0.2g/kg。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法由于靈敏度高、 可同時進(jìn)行檢測和確證, 已被應(yīng)用到 各種食品中硝基呋喃類代謝物的殘留測定。該方法操作簡單,成本低廉, 結(jié)果比 較穩(wěn)定。潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留尹江偉 23等用高效液相色譜 _電噴霧三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測 , 4種硝基呋喃 代謝物的線性范圍為 0.2525µg/kg,線性相關(guān)系數(shù)均在 0.9985以上, 4種化合物的 檢出限為 0.03µg/kg。 郭德華 24等用液相色譜 -四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀定性 , 同位素內(nèi)標(biāo) 法定量測定動物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘

22、留量,檢出限均為 0.3µg/kg。孫 言春 25等人用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留 量,在 2、 20、 100g/kg3個添加水平上,平均回收率在 76.3%90.3%之間,相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差低于 15%,最低檢測限和定量限分別為 0. 25g/kg和 0. 5g/kg。酶聯(lián)免疫檢測分析具有經(jīng)濟(jì)、快速、技術(shù)要求低,高度敏感性、特異性強(qiáng)、 儀器設(shè)備要求不高,測定成本低等特點(diǎn)。沈美芳 26等人利用酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物 AOZ 的殘留, 最低檢測限為 0.3µg/kg,平均回收率超過 96%。丁鍇 27利用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸 附法測定水

23、產(chǎn)品中呋喃唑酮和呋喃妥因的殘留量, 最低檢測限為 0.01ng/mL, IC 50是 0.8ng/mL,批間回收率在 83103%之間,批內(nèi)回收率在 78113%之間。 1.8 課題研究目的及意義硝基呋喃類藥物具有廣譜抗菌的作用, 但是也有致畸致突變致癌和生物鏈傳 遞等潛在危害。 雖然我國以及國際上都已經(jīng)禁止在食用動物中使用硝基呋喃類藥 物, 然而由于科學(xué)知識的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使, 養(yǎng)殖業(yè)中濫用藥物的現(xiàn)象還是 普遍存在。因此建立并完善我國食品中 4種硝基呋喃代謝物的分析方法,加強(qiáng)對 我國進(jìn)出口水產(chǎn)品的檢驗(yàn),開發(fā)該類藥物在食品中的靈敏、穩(wěn)定、 可靠的檢測方 法就顯得非常必要。本研究以對蝦為研究

24、對象,參考了農(nóng)業(yè)部 1077號公告 -2-2008水產(chǎn)品中硝 基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜法中的標(biāo)準(zhǔn)及方法,針對蝦的特 點(diǎn)對樣品前處理進(jìn)行了一些改進(jìn),用高效液相色譜法紫外檢測器,外標(biāo)法定量, 方法回收率好,精密度高,適用于該類藥物殘留監(jiān)控。欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 實(shí)驗(yàn)材料基圍蝦,購于廣州華潤萬家超市(客村店 ,實(shí)驗(yàn)前用勻漿機(jī)將蝦肉搗碎, 用塑料袋包裝,置于 -20 冰箱中冷凍備用。2.2 儀器與試劑高效液相色譜儀:配紫外檢測器(Agilent1100型,美國安捷倫公司超聲波清洗儀(Transonic TI-H 10,德國恒溫水浴搖床振蕩器(MMV 1000W

25、, 日本產(chǎn) 氮吹儀(N-EV AP TM 112,美國勻漿機(jī)(東莞市塘廈興萬電子廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1000, 日本超純水器(Millipore 中國有限公司離心機(jī):4500r/min(TDZ5-WS ,湖南湘儀儀器公司移液槍、分析天平、電子天平三氯乙酸、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸銨均是分析純,鄰氯苯甲醛、乙腈、 冰乙酸、甲醇均為色譜純。標(biāo)準(zhǔn)品:呋喃西林代謝物(SEM 、呋喃妥因代謝物(AHD 、呋喃它酮代 謝物(AMOZ 、呋喃唑酮代謝物(AOZ ,純度 99.5%(Sigma 公司出品 。 提取劑 (三氯乙酸 -甲醇試劑 :稱取 11g 三氯乙酸溶于 100mL 水中, 加入 100mL 甲醇

26、混合。衍生化試劑:吸取 200uL 鄰氯苯甲醛, 溶解于 5mL 冰乙酸和 20mL 甲醇混合液 中。10mol/L NaOH溶液:稱取 400g 氫氧化鈉固體 , 溶于 1000mL 蒸餾水中。 5mol/L 乙酸銨緩沖液:稱取 78g 乙酸銨溶于 100mL 蒸餾水中。潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留50%乙腈溶解:量取 50mL 乙腈于 100mL 超純水中。標(biāo)準(zhǔn)儲備液(200nm/mL :準(zhǔn)確稱取硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 SEM 1.5mg、 AHD 2.30mg、 AMOZ 4.02mg、 AOZ 2.04mg,用甲醇分別定容于 100mL 棕色容量 瓶中,配成 20

27、0nm/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。 -18 冰箱中保存。2.3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟準(zhǔn)確稱取勻漿后的蝦肉樣品 5g 于 50mL 離心管中, 加入 20mL 三氯乙酸 -甲醇提 取劑和 0.5mL 鄰氯苯甲醛衍生劑,漩渦振蕩混勻后進(jìn)行提取,經(jīng)一段時間后于 4500r/min離心 5min ,取上清液。加入一定量 10mol/L氫氧化鈉和 5mL 乙酸銨緩沖 液,加入 50mL 乙酸乙酯充分振蕩萃取,靜置分層后放出下層,上層液加入 20mL 蒸餾水, 充分振蕩, 靜置分層。 取上層液體 (乙酸乙酯層 在氮吹儀上氮?dú)獯蹈? 加入 1mL 50%的乙腈溶液溶解殘?jiān)?用 0.22µm 濾膜過濾,供高效液相

28、儀器測定。在相同實(shí)驗(yàn)條件下, 加入相同質(zhì)量的樣品,相同體積的提取液和衍生劑,用 超聲波振蕩 4h ,探討了溫度在 40 、 50 、 60 的衍生效果,本試驗(yàn)通過比較三 個溫度分別和 4種硝基呋喃類代謝物的含量的關(guān)系,確定最佳的衍生溫度。在相同實(shí)驗(yàn)條件下, 加入相同質(zhì)量的樣品,相同體積的提取液和衍生劑,在 衍生溫度 40 提取 4h 的提取條件下,探討了超聲波提取和水浴振蕩提取 2種方法 的提取效果,試驗(yàn)根據(jù)提取率的高低確定最佳的提取方式。在相同實(shí)驗(yàn)條件下, 加入相同質(zhì)量的樣品,相同體積的提取液和衍生劑,利 用水浴振蕩提取方法在 40 進(jìn)行提取,探討了不同時間:2h 、 4h 、 8h 、 1

29、2h 、 16h 、 20h 、 24h 的提取效果,根據(jù)提取率的高低確定最佳的提取時間。欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計色譜柱:Agilent SB-CN柱, 250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑 ,粒度 5µm ;(美國安 捷倫公司;流動相:乙腈 (A-磷酸二氫銨(B , V (A :V (B =3:7;將硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別取 0.2、 0.5、 2.0、 10.0和 20.0nmol 的量加入 20mL 提取液和 0.5mL 衍生劑,每濃度做 3個平行。 40 水浴振蕩衍生反 應(yīng) 12h , 加入氫氧化鈉和 5mL 乙酸銨緩沖液調(diào)節(jié) pH 至中性, 以 50mL

30、 乙酸乙酯萃取, 靜置分層后放出下層,上層液加入 20mL 蒸餾水,充分振蕩進(jìn)行洗滌,靜置分層。 取上層液體(乙酸乙酯層在氮吹儀上把氮?dú)獯蹈?加入 1mL50%的乙腈水溶液 溶解殘?jiān)? 用 0.22µm 濾膜過濾, 供高效液相儀器測定。 計算各濃度對應(yīng)峰面積的 平均值,以平均峰面積為縱坐標(biāo) y ,濃度為橫坐標(biāo) x ,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出相關(guān)系數(shù) 和確定線性范圍。取 5g 蝦肉樣品,分別添加 0.2nmol 、 2.0nmol 、 20.0nmol 三個不同水平的硝基 呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。3 結(jié)果與分析3.1 衍生溫度的確定不同溫度下呋喃西林(SEM 、呋喃妥因 (AH

31、D、呋喃它酮 (AMOZ、呋喃唑 酮 (AOZ的衍生效果分別如圖 3.1、圖 3.2、圖 3.3、圖 3.4 :潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留 圖 3.1 不同溫度反應(yīng)對 SEM 衍生物含量的影響 圖 3. 2 不同溫度反應(yīng)對 AHD 衍生物含量的影響欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計 圖 3. 3 不同溫度反應(yīng)對 AMOZ 衍生物含量的影響 圖 3. 4 不同溫度反應(yīng)對 AOZ 衍生物含量的影響3.2 提取方式的影響在相同條件下分別采用振蕩法和超聲波法進(jìn)行提取, 四種代謝物的提取結(jié)果 分別如圖 3.5、圖 3.6、圖 3.7、圖 3.8 :11潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基

32、呋喃類藥物殘留 120.420406080100t/minS E M 含 量 /n m o l圖 3.5 不同提取方式對 SEM 提取能力的比較0.420406080100t/minA H D 含 量 /n m o l圖 3.6 不同提取方式對 AHD 提取能力的比較0.420406080100t/minA M O Z 含 量 /n m o l圖 3.7 不同提取方式對 AMOZ 提取能力的比較欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計 130.420406080100t/minA O Z 含 量 /n m o l圖 3.8 不同提取方式對 AOZ 提取能力的比較從圖 3.5、 圖 3.6、 圖 3.7、 圖

33、 3.8四個圖形可以看出, 采用兩種提取方法時, SEM 、 AHD 、 AMOZ 的提取含量都相差不大,采用振蕩提取 AOZ 時,提取效率則明顯 比采用超聲波時的高。 由于采用超聲波提取時, 一方面超聲作用會造成發(fā)熱而使 溫度不斷升高造成衍生物的降解, 另一方面長時間作用會對超聲波儀器本身有較 大的損壞。綜合上述因素,本實(shí)驗(yàn)選用振蕩提取方式。 3.3 提取時間的影響在相同條件下,四種硝基呋喃類代謝物在不同提取時間的提取效果如下圖 3.9:潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留 圖 3. 9提取時間與 SEM 、 AHD 、 AMOZ 、 AOZ 含量的關(guān)系結(jié)果表明四種硝基呋喃類代

34、謝物在 12h 左右都能達(dá)到較高的提取含量,隨后 提取量基本上保持不變,為了節(jié)省時間,本實(shí)驗(yàn)選用的提取時間是 12h 。3.4 線性關(guān)系、線性范圍的確定通過分別做 5種不同濃度的呋喃西林代謝物 (SEM、呋喃妥因代謝物 (AHD、 呋喃它酮代謝物 (AMOZ、呋喃唑酮代謝物 (AOZ的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到以下 4種 硝基呋喃類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別如圖 3.10、圖 3.11、圖 3.12、圖 3.13四個圖形, 4種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍列于表 3.1。圖 3.10 SEM的標(biāo)準(zhǔn)曲線14欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留表 3. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

35、的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table3.1 The regression equations、 the correlation coefficient and linear range of standard curve組分 回歸方程 相關(guān)系數(shù)(R 線性范圍SEM y=19.869x-3.702 0.9984 0.220.0AHD y=20.17x-4.238 0.9976 0.220.0AMOZ y=28.855x-4.4610.99920.220.0AOZ y=32.979x-2.747 0.9993 0.220.03.5 檢測限的確定實(shí)驗(yàn)采用 5.00g 蝦肉樣品,最后定容到 1mL

36、 ,以 3倍信噪比來計算,得到 4種硝基呋喃類藥物的代謝物的最低檢測限分別為:SEM 為 0.9ng/g、 AHD 為 1.4ng/g、 AMOZ 為 1.9ng/g、 AOZ 為 0.8ng/g。3.6 加標(biāo)回收率和精密度采用標(biāo)準(zhǔn)添加法, 在蝦肉中添加 3個不同濃度的 4種硝基呋喃類代謝物進(jìn)行回 收率試驗(yàn),每個組分做三組平行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表 3.2欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計表 3.2 添加回收率 Table3.2 The add recovery組分添加濃度 (nmol 回收率(% 精密度 (% 1 2 3SEM 0.20 84.5 90.1 98.8 7.90 2.00 96.6 90.

37、1 89.5 2.25 20.00 82.7 92.1 82.8 6.28AHD 0.20 85.7 77.8 89.2 6.93 2.00 92.3 89.9 91.9 1.41 20.00 82.3 84.5 78.9 3.44AMOZ 0.20 86.2 81.4 79.7 4.08 2.00 98.3 87.7 85.4 7.60 20.00 83.2 84.2 81.9 1.38AOZ 0.20 85.1 92.5 97.5 6.80 2.00 92.4 87.6 96.4 4.76 20.00 85.2 88.6 86.7 0.87從結(jié)果看出平均回收率在 77.8%98.8%, 3

38、次平行測定的精密度在 0.87% 7.9%之間。按照以上加標(biāo)回收率的方法, 利用高效液相色譜儀得到硝基呋喃類代謝物混 合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、空白蝦色譜圖、空白蝦樣品添加 20nmol/mL硝基呋喃類代 謝物色譜圖分別如圖 3.14、圖 3.15、圖 3.16所示:其中四種硝基呋喃類代謝物 的出峰順序依次是 SEM 、 AHD 、 AMOZ 、 AHZ 。圖 3.15 蝦肉空白色譜圖 4 討論硝基呋喃類藥物對光敏感, 在生物體內(nèi)代謝迅速, 數(shù)小時內(nèi)降解, 無法檢測, 但是硝基呋喃類代謝物以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中 , 只有在適當(dāng)酸性條 件下 , 通過水解才能釋放出來。鹽酸可以提供酸性環(huán)境,使其

39、中的蛋白質(zhì)結(jié)合物 水解,得到代謝物,但是在提取過程中浸出雜質(zhì)較多,不易排除基質(zhì)干擾,且回 收率不高。 三氯乙酸作為蛋白質(zhì)的沉淀劑, 不但能使代謝物從蛋白質(zhì)中解離出來, 還可以沉淀蛋白,降低提取液雜質(zhì)的含量,減少干擾。 使用三氯乙酸作為提取劑 比鹽酸效果好,回收率更高。為了去除提取物中的水溶性雜質(zhì), 采取液液萃取的方法, 將被測物萃取到有 機(jī)相中, 進(jìn)行初步凈化。 將衍生之后的上清液調(diào)至 PH 約 7.0左右, 然后用 2倍體積 乙酸乙酯萃取 1次,該方法操作簡單方便,不但可以節(jié)約費(fèi)用,還可以得到較好 的凈化效果和回收率。在調(diào)節(jié) PH 值時加入乙酸銨緩沖溶液,可以使溶液的 PH 保 持在 7.0

40、且操作更加簡便。樣品經(jīng)提取衍生后,離心取上清,沉淀中再加入少量三氯乙酸 -甲醇溶液洗 滌一次,合并提取液,回收率可提高 10%左右。在利用氮?dú)獍岩宜嵋阴ゴ蹈傻倪^程中, 由于液體的不斷蒸發(fā)帶走熱量, 會造潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留成樣液溫度下降,從而使蒸發(fā)速度變慢,使操作時間延長很多。因此,為加快吹 干速度, 一般在水浴中進(jìn)行, 但水浴溫度不能太高 (上文實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表明溫度高 會造成衍生物的降解 ,綜合考慮水浴溫度設(shè)為 40 。5 小結(jié)與展望本實(shí)驗(yàn)研究了高效液相色譜法測定蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留的提取和分 析方法,采用三氯乙酸 -甲醇作為提取劑和振蕩提取方式,建立了合適的

41、蝦肉樣 品提取、 濃縮的前處理方法, 取得測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留量較好的高 效液相色譜條件。 該方法在 0.220nmol/mL定量范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系, 檢測限 為 1.0ng/g左右,樣品回收率在 78%98%之間。該方法操作簡便,準(zhǔn)確性高、重 復(fù)性強(qiáng), 可檢測出蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留, 適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物 殘留的測定,具有一定的研究意義。目前,國內(nèi)外對硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測大多采用液相色譜及 其聯(lián)用技術(shù),但是由于這種方法存在儀器設(shè)備昂貴、操作技術(shù)要求高、 樣品處理 復(fù)雜和檢測成本高等缺點(diǎn), 從而使其難以成為大規(guī)?？焖俸Y選方法。 然而國內(nèi)外 關(guān)于免疫分析法在硝

42、基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物領(lǐng)域的研究應(yīng)用報道相對較少, 現(xiàn)有文獻(xiàn)也主要局限于酶聯(lián)免疫分析法。 ELISA 具有檢測過程快速靈敏、操作簡 便、方法種類多和運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn),還能達(dá)到當(dāng)前國內(nèi)外規(guī)定的最低檢測限。 因此在今后的研究中, 免疫分析方法將會是研究者的熱點(diǎn), 它也是硝基呋喃類藥 物殘留檢測的快速可行的辦法之一, 相信酶聯(lián)免疫分析法將會在食品安全分析檢 測中得到迅速發(fā)展和廣泛運(yùn)用。欽州學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計致謝轉(zhuǎn)眼之間, 四年的大學(xué)學(xué)習(xí)生活就要結(jié)束了, 回首往事, 有太多的美好回憶, 值得我一輩子去珍藏。我的畢業(yè)論文能順利完成, 首先要真誠地感謝我的論文指導(dǎo)老師蔡秋杏老師 的關(guān)懷與幫助, 因?yàn)?/p>

43、她的用心與盡力, 我們才有機(jī)會到廣州南海水產(chǎn)所實(shí)習(xí)并完 成畢業(yè)論文,而且蔡老師還在忙碌的教學(xué)工作中擠出時間來審查及修改我的論 文。蔡老師不僅是我們的良師,還是我們的姐姐,她為人親切善良,時刻為我們 著想。在此,謹(jǐn)向她表示我最衷心的感謝的崇高的敬意!另外, 我還要特別感謝南海水產(chǎn)研究所的老師以及師兄師姐們, 尤其是鄧建 朝博士和辛少平師兄。鄧?yán)蠋煆淖畛醯亩},收集資料, 到實(shí)驗(yàn)完成都給了我耐 心的指導(dǎo)和無私的幫助。 辛師兄積極幫我解決實(shí)驗(yàn)過程中遇到的各種困難, 在論 文的修改方面也給予了我較大的幫助, 他對知識的渴望以及做事情的認(rèn)真與耐心 的態(tài)度深深地感染了我。最后, 感謝我的班主任熊拯老師和戴

44、梓茹老師, 以及付滿老師、 陳美花老師、 苗建銀老師、鐘秋平老師等等, 他們在我的學(xué)習(xí)中都給予了莫大的幫助。 還要感 謝我的同學(xué)朋友們,尤其是曾祥震、唐玉鳳、姚玉華、林娜、龍玉玲等同學(xué),他 們在我的論文完成過程中也給予了一定的幫助。感謝所有關(guān)心和幫助過我的老師們,同學(xué)們,朋友們!潘珍風(fēng) 高效液相色譜法檢測蝦肉中硝基呋喃類藥物殘留參考文獻(xiàn)1張清 . 水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題值得重視 J. 山東政報, 2009, (5 :46-47. 2 祝偉霞,劉亞風(fēng),梁煒 . 動物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測研究進(jìn) 展 J. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(2:99-102.3 郭楨, 連瑾, 吳淑君. 動物源

45、性食品中呋喃唑酮及其代謝物的檢測 J. 廣 東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005,(5:57-59.4 Lilianne Abramsson-Zetterberg,Kettil Svensson.Semicarbazide is not genotoxic in the flow cytometry-based micronucleus assay in vivoJ. Toxicology Letters , 2005, (155 :211-217.5 祝偉霞,楊冀州,魏蔚等 . 高效液相色譜 _串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物性食品中 硝基呋喃類代謝物殘留 J. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) , 2008, (1 :47-50.6 宋凱 , 肖桂英 , 姜橋 . 高效液相色譜法同步測定飼料及獸藥中 4種硝基呋 喃類藥物 J. 糧食與飼料工業(yè) , 2010, (3 :49-51.7 丘建華 . 高效液相色譜 _串連質(zhì)譜法測定鰻魚中硝基呋喃類代謝物殘留研 究 D. 江蘇:揚(yáng)州大學(xué), 2006.8 張 仲 秋 , 鄭 明 . 畜 禽 藥