細(xì)菌的簡單染色法和革蘭氏染色法

1、實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的簡單染色法和革蘭氏染色法一、目的要求1. 學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，并掌握革蘭氏染色的方法。2. 初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征，掌握無菌操作技術(shù)。3. 了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理1. 簡單染色法：用單一染料進(jìn)行細(xì)菌染色，操作簡便，適于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用 堿性染料 進(jìn)行簡單染色，這是因?yàn)椋涸谥行浴A性或弱堿性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷 ， 而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷(酸性染料電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷)， 因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色，經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下

2、易于識(shí)別。常用作簡單染色的染料有：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。2. 革蘭氏染色法革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884 年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法(Gram stain)不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)特征而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)的稱為革蘭氏染色陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同造成的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)

3、胞內(nèi)而不易著色，因此， 呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液(番紅)的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料(basic dye)初染液；媒染劑 (mordant)；脫色齊1J ( decolorising agent 和復(fù)染液(counterstain)。堿性染料的 作用象在細(xì)菌的簡單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crystal violet)。 媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和力或附著力， 即

4、以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95%的7S精(ethanol)。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。三、器材大腸桿菌(Escherichia coli)， 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)s， 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis),藤黃微球菌(Micrococcus luteus),蠟樣芽抱桿菌(B. cereu91220h斜面培

5、養(yǎng)物；革蘭氏染液，載玻片，顯微鏡等。四、操作步驟1. 涂片 取兩塊載玻片，各滴一小滴蒸餾水于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作分別從培養(yǎng)1416h的枯草芽抱桿菌和培養(yǎng)24h的大腸桿菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。載玻片要潔凈無油跡；滴蒸餾水和取菌不宜過多；涂片要均勻，不宜過厚。2. 干燥 室溫自然干燥。3. 固定 固定時(shí)通過火焰23次即可。此過程稱熱固定，其目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。熱固定溫度不易過高，以載玻片背面不燙手為宜，否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。4. 染色5. 1）簡單染色法： 染色滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。呂氏堿性美

6、藍(lán)染色12min；石炭酸復(fù)紅或草酸錢結(jié)晶紫染色約 1min。 水洗傾去染液，用自來水沖洗，直至涂片上流下的水無色為止。水洗時(shí)，不要直接沖洗液面，而應(yīng)使水從載玻片的一段流下，水流不易過急過大，以免涂片薄膜脫落。 干燥自然干燥或用電吹風(fēng)吹干，也可用吸水紙吸干。 鏡檢涂片干燥后鏡檢。 2）革蘭氏染色法： 初染加草酸錢結(jié)晶紫一滴，約12min,水洗。 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min,水洗。 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)為止，約 2030s,立即用水沖凈酒精。復(fù)染用番紅液染12min,水洗。 鏡檢 干燥后， 置油鏡下觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色

7、，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。（3） 混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果， 如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的芽孢和莢膜染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)并掌握芽孢和莢膜染色法2. 初步了解芽孢和莢膜的形態(tài)。二、基本原理芽孢又叫內(nèi)生孢子(endosopre)， 是某些細(xì)菌生長到一定階段

8、在菌體內(nèi)形成的休眠體， 通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低， 著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用弱堿性染料，如孔雀綠( malachite green或堿性 品紅(basic fuchsin)在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可進(jìn)入菌體，而且也可進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液(如番紅液)或襯托溶液(如黑色素溶液)處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。

9、莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外面的一層粘液性物質(zhì)，其主要成分是多糖類，不易染色， 故常用襯托染色法，即將菌體和背景著色，而把不著色且透明的莢膜襯托出來。莢膜很薄，易變形，因此，制片時(shí)一般不用熱固定。三、器材枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，臘樣芽抱桿菌(B. cereuS),球形芽抱桿菌(B. sphaericus)， 生孢梭菌 ( Clostridium sporogenes) ； 圓褐固氮菌( Azotobacterchroococcum)或膠質(zhì)芽抱桿菌(B. mucilaginosu9約2d無氮培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物；孔雀綠染液，番紅水溶液，苯酚品紅溶液，黑色素溶液。莢膜染色液：

10、繪圖墨水，1甲基紫水溶液，1結(jié)晶紫水溶液，6葡萄糖水溶液，20硫酸銅水溶液，純甲醇等。四、操作步驟(一)莢膜染色技術(shù)方法一：( 1)將培養(yǎng)24h 左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。(2)滴加35滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。( 3)用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算約45min。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液染10min。( 4)傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止。(5)用番紅水溶液復(fù)染1min,水洗。( 6)待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。方法二：（

11、1）取兩支潔凈的小試管，分別加入0.2mL 無菌水，再往一管中加入23接種環(huán)的臘樣芽孢桿菌的菌苔，另一管中加入23 接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔，兩管中各自充分混合成濃厚的菌懸液。（2）在菌懸液中分別加入0.2mL苯酚品紅溶液，充分混合后，于沸水浴中加熱 35min。（ 3）用接種環(huán)分別取上述混合液23 環(huán)于兩載玻片上，涂薄，風(fēng)干后，將載玻片稍傾斜于燒杯上，用95乙醇沖洗至無紅色液流出。（ 4）再用自來水沖洗，濾紙吸干。（ 5）取12 接種環(huán)黑色素溶液于涂片處，立即展開涂薄，自然風(fēng)干后，油鏡觀察，在淡紫色背景的襯托下，菌體為白色，菌體內(nèi)的芽孢為紅色。（二）莢膜染色技術(shù)1. 濕墨水法（ 1）制備菌和墨

12、水混合液加一滴水于潔凈的載玻片上，然后挑取少量菌體與其混合均勻。（ 2）加蓋玻片將一潔凈的蓋玻片蓋在混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液。（ 3）鏡檢用低倍鏡和高倍鏡觀察，若用相差顯微鏡觀察，效果更好。背景灰色，菌體較暗，在菌體周圍呈現(xiàn)明亮的透明圈即為莢膜。2. 干墨水法（ 1）在載玻片一端滴一滴6葡萄糖水溶液，取少許培養(yǎng)了72h 的圓褐固氮菌在水滴中制成菌懸液，充分混勻。（ 2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用繪圖墨水）與菌懸液混合，另取一塊載玻片作為推片，將推片一端平整的邊緣與菌懸液以30°角接觸后，順勢(shì)將菌懸液推向前方，使其成勻薄的一層，風(fēng)干。（ 3）

13、用純甲醇固定1min。（4）加番紅液數(shù)滴于涂片上，沖去殘余的甲醇，并染 30s,以細(xì)水流適當(dāng)沖洗，吸干后油鏡檢查，背景黑色，莢膜無色，細(xì)胞紅色。3. Anthony 法（ 1）涂片按常規(guī)取菌涂片。（ 2）固定空氣中自然干燥。不可加熱干燥固定。（ 3）染色用1結(jié)晶紫水溶液染色2min。（ 4）脫色以20硫酸銅水溶液沖洗，用吸水紙吸干殘液。（ 5）鏡檢干后用油鏡觀察菌體染成深紫色，菌體周圍的莢膜呈淡紫色。實(shí)驗(yàn)三 鞭毛染色法及活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察一、目的要求1 .學(xué) 習(xí) 并 初 步 掌 握 鞭 毛 染 色 法 ， 觀 察 細(xì) 菌 鞭 毛 的 形 態(tài) 特 征 。2 . 學(xué) 習(xí) 用 壓 滴 法 和 懸 滴

14、 法 觀 察 細(xì) 菌 的 運(yùn) 動(dòng) 性 。二、基本原理鞭 毛 是 細(xì) 菌 的 運(yùn) 動(dòng) “器 官 ”， 細(xì) 菌 是 否 具 有 鞭 毛 ， 以 及 鞭 毛 著 生 的 位 置 和 數(shù) 目 是 細(xì) 菌 的 一 項(xiàng)這要形態(tài)特征。細(xì)菌的鞭毛f艮纖細(xì)，其直徑通常為0.0k0.02W所以，除了很少數(shù)t鄒成鞭 毛 束 （由 許 多 根 鞭 毛 構(gòu) 成 ）的 細(xì) 菌 可 以 用 相 差 顯 微 鏡 直 接 觀 察 到 鞭 毛 束 的 存 在 外 ， 一 般 細(xì) 菌 的 鞭 毛 均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普 通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的鞭 毛，必須用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理，是在染

15、色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗， 然后再進(jìn)行染色。單便毛染色方法很多，本實(shí)驗(yàn)介紹硝酸銀染色法和改良白LeifsoriOfe法，前 一種方法更容易掌握，但染色劑配制后保存期較短。在顯微鏡下觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，也可以初步判斷細(xì)菌是否有鞭毛。細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察可用 壓滴法和懸滴法。觀察時(shí)，要適當(dāng)減弱光強(qiáng)度以增強(qiáng)反差，若光線太強(qiáng)，細(xì)菌和周圍的液體難以 區(qū)分。三、器材蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringierjgs圈單胞菌（Pseudomona$ ,sp.黃色葡萄球菌；硝酸 銀鞭包色液，LeifsoriOfe色液，0.0以美藍(lán)水溶液；載ft片，蓋玻片，凹載ft片，無菌水，凡

16、 士林，顯微鏡等。四、操作步驟（一）鞭毛染色技術(shù)1 .硝 酸 銀 染 色 法（ 1） 菌 種 的 準(zhǔn) 備 要 求 用 活 躍 生 長 期 菌 種 作 鞭 毛 染 色 和 運(yùn) 動(dòng) 性 的 觀 察 。 對(duì) 于 冰 箱 保 存 的 菌 種，通常要連續(xù)移種12次，然后可選用下列方法接種培養(yǎng)作染色用菌種：a取新配制的營養(yǎng)瓊 月制面（表面較濕潤、基部有冷凝水）接種，2832培養(yǎng)1830h讓菌種擴(kuò)散生長，取菌落邊緣 的 菌 苔 （不 要 取 菌 落 中 央 的 菌 苔 ）作 染 色 觀 察 的 菌 種 材 料 。良好的培養(yǎng)物，是鞭毛染色成功的基本條件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培養(yǎng)物作鞭毛染色 的菌種材料，因

17、為老齡細(xì)菌鞭毛容易脫落。（ 2） 載 玻片的 準(zhǔn) 備 將載 玻 片 在 含 適 量 洗 衣 粉 的 水 中 煮 約 20min，取 出 用 清 水 充 分 洗 凈 ，瀝 干 后 置95乙醇 中 ， 用 時(shí)取 出 在 火 焰 上 燒 去 酒 精 及 可 能 殘 留 的 油 跡 。玻片要求光滑、潔凈，尤其忌用帶油跡的玻片（將水滴在玻片上，無油跡玻片水能均勻散開）（3）菌液的制備取斜面或平板即"物數(shù)環(huán)于盛有12m比菌水的試管中，制成輕度 混濁的菌懸液用于制片。也可用培養(yǎng)物直接制片，但效果往往不如先制備菌液。挑菌時(shí)，盡可能不帶培養(yǎng)基。（ 4） 制 片 取 一 滴 菌 液 于 載 玻 片 上

18、的 一 端 ， 然 后 將 玻 片 傾 斜 ， 使 菌 液 緩 緩 流 向 另 一 端 ， 用 吸 水 紙 吸 去 玻 片 下 端 多 余 菌 液 ， 室 溫 （ 或 37） 自 然 干 燥 。干后應(yīng)盡快染色，不宜放置時(shí)間過長。（5）染色 涂片干燥后，滴加石幗艮染色A液覆蓋3-5min用蒸儲(chǔ)水充分洗去A液。用B 液沖去殘水后，再加B液覆蓋涂片染色約數(shù)秒至1min當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸儲(chǔ)水 沖洗。若加B液后顯色較慢，可用微火力咖，直至顯褐色時(shí)立即水洗。自然干燥。配制合格的染色劑（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌眥？B液的染色時(shí)間均是 鞭毛染色成敗的重要環(huán)節(jié)。（ 6） 鏡 檢 干 后

19、 用 油 鏡 觀 察 。 觀 察 時(shí) ， 可 從 玻 片 的 一 端 逐 漸 移 至 另 一 端 ， 有 時(shí) 只 在 涂 片 的 一定部位觀察到鞭毛。菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色、通常呈波浪形。2 .改良白Leifsorft染色法（ 1） 載 玻 片 的 準(zhǔn) 備 、 菌 種 材 料 的 準(zhǔn) 備 用 硝 酸 銀 染 色 法 。（ 2） 制 片 用 記 號(hào) 筆 在 載 玻 片 反 面 將 玻 片 分 成 3-4個(gè) 等 分 區(qū) ， 在 每 一 小 區(qū) 的 一 端 放 一 小 滴 菌 液 。 將 玻 片 傾 斜 ， 讓 菌 液 流 到 小 區(qū) 的 另 一 端 ， 用 濾 紙 吸 去 多 余 的 菌 液 。

20、 室 溫 或 37自 然 干 燥 。（3）染色力口 LeifsoriO色液覆蓋第一區(qū)的涂面，隔數(shù)min后，加染液于第二涂面，如此 繼續(xù)染第三、四區(qū)。間隔時(shí)間自行議定，其目的是為了確定最佳染色時(shí)間。在染色過程中仔細(xì)觀 察，當(dāng)整個(gè)玻片都出現(xiàn)鐵銹色沉淀、染料表面現(xiàn)出金色膜時(shí)，即直接用水輕輕沖洗（不要先傾去 染 料 再 沖 洗 ， 否 則 背 景 不 清 ） 。 染 色 時(shí) 間 大 約 10min。 自 然 干 燥 。（ 4） 鏡 檢 干 后 用 油 鏡 觀 察 。菌體和鞭毛均呈紅色。（二）運(yùn)動(dòng)性觀察玻片的準(zhǔn)備、菌種材料的準(zhǔn)備同鞭毛染色法。1. 壓 滴 法（ 1） 制 片 在 潔 凈 載 玻 片 上

21、加 一 滴 無 菌 水 ， 挑 取 一 環(huán) 菌 液 與 水 混 合 ， 再 加 一 環(huán) 0.01 的 美 藍(lán) 水溶液與其混合均勻。用鑷子取一潔凈的蓋玻片，使其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片慢慢 放下蓋在菌液上。觀察專性好氧菌時(shí)，可在放蓋玻片時(shí)壓入小氣泡，以防止細(xì)菌因缺氧而停止運(yùn) 動(dòng)。（ 2） 鏡 檢 先 用 低 倍 鏡 找 到 標(biāo) 本 ， 再 用 高 倍 鏡 觀 察 。 也 可 用 油 鏡 觀 察 ， 用 油 鏡 時(shí) ， 蓋 玻 片 厚 度 不 能 超 過 0.17nm。 觀 察 時(shí) ， 要 用 略 暗 光 線 。有鞭毛細(xì)菌可作直線、波浪式或翻滾運(yùn)動(dòng)，兩個(gè)細(xì)菌之間出現(xiàn)明顯的位移而與布朗運(yùn)動(dòng)或

22、隨 水流運(yùn)動(dòng)區(qū)別。2. 懸 滴 法（ 1） 涂 凡 士 林 取 潔 凈 凹 載 玻 片 ， 在 其 四 周 涂 少 許 凡 士 林 。（ 2） 加 菌 液 在 蓋 玻 片 中 央 滴 一 小 滴 菌 液 。 為 便 于 觀 察 時(shí) 尋 找 菌 液 位 置 ， 可 用 記 號(hào) 筆 在 菌 液周 圍畫上記號(hào)。菌液不能加得太多，為了便于 觀察，也 可用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液 于蓋玻片中央。（ 3） 蓋 凹 玻 片 將 凹 玻 片 得 凹 槽 對(duì) 準(zhǔn) 蓋 玻 片 中 心 得 菌 液 ， 并 輕 輕 蓋 在 蓋 玻 片 上 。 輕 輕 按 壓 使蓋玻片與凹玻片粘合在一起，把液滴封閉在小室中。翻轉(zhuǎn)凹玻片，使菌

23、液滴懸在蓋玻片下并位 于凹槽中央。若菌液加得過多，此時(shí)菌液就會(huì)流到凹玻片上面影響觀察。（ 4） 鏡 檢 先 用 低 倍 鏡 找 到 標(biāo) 本 ， 并 將 液 滴 移 至 視 野 中 央 ， 然 后 用 高 倍 鏡 觀 察 。 若 用 油 鏡觀 察 ， 蓋 玻 片 厚 度 不 能 超 過 0.17nm， 并 要 十 分 細(xì) 心 ， 以 免 壓 碎 蓋 玻 片 、 損 傷 鏡 頭 。觀察過程要在略暗的光線下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)四 酵母菌的形態(tài)觀察及死、活細(xì)胞的鑒別實(shí)驗(yàn)要求1. 觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死、活細(xì)胞的染色方法。2. 掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。二、基本原理酵母菌

24、是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，其大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍。繁殖方式也比較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。 本實(shí)驗(yàn)通過用美藍(lán)染色制成水浸片和水碘水浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的， 用它來對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對(duì)于 死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此， 用

25、美藍(lán)水浸片不僅可以觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。但美藍(lán)的濃度、作用時(shí)間等均有影響，應(yīng)加注意。三、器材釀酒酵母（Saccharomyces cervisia娥卡爾酵母（S. calsbergensiS ； 0.05%, 0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，革蘭氏染色用的碘液；顯微鏡，載玻片，蓋玻片等。四、操作步驟1. 美藍(lán)浸片觀察（ 1）在載玻片中央滴加1 滴 0.1呂氏堿性美藍(lán)染液，液滴不可過多或過少，以免蓋上蓋玻片時(shí)，溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在豆芽汁瓊脂斜面上培養(yǎng) 48h 的釀酒酵母少許，放在呂氏堿性美藍(lán)染液中，使菌體與染液均勻混合。（ 2）用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。蓋片

26、時(shí)應(yīng)注意，不能將蓋玻片平放上去，應(yīng)先將蓋玻片地一邊與液滴接觸，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，這樣可以避免產(chǎn)生氣泡。（ 3） 將制好地水浸片放置3min 后鏡檢。 先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察釀酒酵母的形態(tài)和出芽情況，同時(shí)可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細(xì)胞。（4）染色0.5h后，再觀察一下死細(xì)胞數(shù)目是否增加。（ 5）用0.05呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述的操作。2. 水碘浸片觀察在載玻片中央滴一滴革蘭氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取釀酒酵母少許，放在水碘液滴中，使菌體與溶液混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌、 放線菌、 酵母及其它真菌菌落的比較及微觀形態(tài)觀察、目的要求1. 觀察細(xì)菌、放

27、線菌、酵母、青霉和平菇菌絲等代表種類的菌落形態(tài)特征。2. 觀察細(xì)菌、放線菌、酵母、青霉和平菇菌絲等代表種類的菌體的微觀特征。3. 學(xué)習(xí)描述菌落特征的方法。二、基本原理菌落形態(tài)是指某種微生物在一定的培養(yǎng)基上由單個(gè)菌體形成的群體形態(tài)。細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌和食用菌，每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對(duì)的特征，利用觀察這些特征，來區(qū)分各大類微生物及初步識(shí)別、鑒定微生物，方法簡便快速，在科研和生產(chǎn)中常被應(yīng)用。微觀特征是鑒定微生物種類的主要依據(jù)，通過顯微觀察可以了解四大類微生物的主要特征。三、器材圓褐固氮菌或大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉或其它霉菌，平菇或其它食用

28、菌菌絲體。載玻片，蓋玻片，無菌水滴瓶，酒精燈，接種環(huán)、接種鉤、顯微鏡等。四、操作步驟1. 菌落形態(tài)觀察觀察比較圓褐固氮菌或大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌絲體在平板培養(yǎng)基上形成的菌落特征，按照下列菌落描述的方法記錄結(jié)果。（ 1）大小：大、中、小。或用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。（ 2）形態(tài)：圓形、不規(guī)則形。（ 3）干濕：干燥、濕潤、粘稠。（ 4）高度：扁平、隆起、凹下。（ 5）透明度：透明、半透明、不透明。（ 6）顏色：白色、 乳白色、 黃色、 金黃色、 綠色、 紅色、 褐色等。 中間與邊緣有無區(qū)別。（ 7）邊緣：整齊、不整齊。2. 菌落微觀形態(tài)觀察

29、（ 1）取細(xì)菌固定玻片，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。（ 2）取放線菌固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察放線菌的形態(tài)。（ 3）取酵母菌固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察放線菌的形態(tài)。（ 4） 取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察其菌絲和分生孢子梗的形態(tài)。（ 5） 挑取少量平菇或其它食用菌的菌絲體，用低倍鏡和高倍鏡觀察其形態(tài)，觀察有無鎖狀聯(lián)合。邊觀察，邊用鉛筆繪圖。左眼觀察視野，右眼觀察圖紙。實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究目的不同，所

30、以培養(yǎng)基種類很多。培養(yǎng)基可以為微生物生長、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽和生長因子等， 不同微生物對(duì)pH 要求不同，酵母和霉菌一般的培養(yǎng)基一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基一般是偏堿性的，所以配制培養(yǎng)基時(shí)需要調(diào)整pH 值。根據(jù)培養(yǎng)基的成分不同，培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基； 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可以分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基； 根據(jù)培養(yǎng)基的用途可以分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)制備培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌的2 種培養(yǎng)基。一、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）（一）目的要求1. 明確培養(yǎng)基的配制原理。 養(yǎng)基的配制原理

31、。2. 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。（二）基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中的牛肉膏主要為微生物生長提供碳源、能源、 磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl 提供無機(jī)鹽，瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下（1.5%2%）下 96時(shí)溶化，在45時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH 調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20g水1000mLpH7

32、.4 7.6（三）器材1、溶液或試劑：牛肉膏，蛋白陳，NaCl,瓊脂，1mol/LNaOH , 1mol/LHCl。2、儀器或其它用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝裝置，天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0）,棉花，報(bào)紙或牛皮紙，記號(hào)筆，線繩或尼龍繩，紗布等。（四）操作步驟1 . 稱量 按照培養(yǎng)基配方比例依次稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入燒杯中。注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或培養(yǎng)皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯；蛋白胨易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速；嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈插干，再稱取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2 . 溶化

33、 在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然好在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需總體積，將稱好的瓊脂加入后，再加熱溶化。加熱時(shí)要用玻棒不斷攪拌，防止糊鍋或溢出。最后補(bǔ)足所損失的水分。如果是制備三角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，可以先將一定量的液體培養(yǎng)基裝入三角瓶，再按比例加入瓊脂，不必加熱溶化，而是加熱和溶化同步進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。3 .調(diào)pH先用精密試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始 pH,如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基 中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)市pH試紙測(cè)其pH,直至pH達(dá) 到7.6。反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于有些要求pH較精確的微

34、生物或?qū)嶒?yàn)，其pH的調(diào)節(jié)可以用酸度計(jì)進(jìn)行。4 .過濾趁熱用4層紗布過濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。一般沒有特殊要 求的情況下，這一步可以省去（本實(shí)驗(yàn)不需過濾）。5 .分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基裝入三角瓶或試管內(nèi)。 分裝試管時(shí)， 分裝量為試管總長的1/51/4,滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的量以不超過三角 瓶容積的一半為宜。注意分裝速度要迅速，防止培養(yǎng)基凝固；不要將培養(yǎng)基濺到 管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。6 .加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料 塞及試管帽等）。棉塞要求松緊適度，既能阻止外界微生物進(jìn)入而引起污染，又 能夠保證有良好的通氣性能。正確地棉塞要

35、求形狀、大小、 松緊與試管口（或三角瓶口）完 全適合，過緊則妨礙空氣流通， 操作也不便；過松則達(dá)不到濾菌 的目的。加塞時(shí)，大頭朝外，試 管內(nèi)塞入2/3,試管外留1/3。手 提棉塞，試管不下落為不松，拔 掉棉塞時(shí)不發(fā)出較大聲響為不 緊。棉塞制作過程如圖2.1所示。三角瓶封口可以用棉塞，也可以用8層紗布重疊而成。7 .包扎 加塞后，取7支同樣規(guī)圖2.1棉塞的制作過程示意圖格的試管，棉塞頂端用雙層報(bào)紙或1層牛皮紙覆蓋，再用線純或尼龍繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期 等。三角瓶加塞后直接覆蓋雙層報(bào)紙或 1層牛皮紙，用同樣的方法扎好。8 .滅菌 將上述培養(yǎng)基在在壓力0.11MPa,溫度121c

36、條件下滅菌2030min。 如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。9 .擺放斜面 滅菌結(jié)束后，應(yīng)使壓力自然降低至 0時(shí)，打開鍋蓋，將鍋蓋錯(cuò) 開一條10幾cm的縫隙，利用鍋體余熱將報(bào)紙和棉塞烘干，然后去掉鍋蓋，當(dāng) 培養(yǎng)基溫度降至5060c時(shí)取出，擺放斜面。將有棉塞的一端擱在玻棒或小木條 上，斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。10 .無菌檢查隨機(jī)抽取幾把冷卻凝固后的培養(yǎng)基，放在 37c的溫箱中培養(yǎng) 2448h,以檢查滅菌是否徹底。二、高氏（Gause）1號(hào)培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）（一）目的要求11 明確培養(yǎng)基的配制原理。12 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。（-）基本原理高氏1號(hào)培養(yǎng)基是分

37、離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。 這種培養(yǎng)基是 由可溶性 淀粉（作為碳源）,KNO3 （作為氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2。、MgSO4?7H2O（作為無機(jī)鹽，提供鈉、鉀、磷、鎂、硫等離子）和FeSd?7H20（作為微量元素，提供鐵離子）等組成。由于磷酸鹽和鎂鹽相混合時(shí)產(chǎn)生沉淀，因此，在混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分。對(duì)于象FeS04?7H20 這樣的微量成分，則可預(yù)先配成高濃度的貯備液，在配制培養(yǎng)基時(shí)按需要加入一定的量。高氏 1 號(hào)培養(yǎng)基配方如下：可溶性淀粉20gKN031gNaCl0.5gK2HP04?3H200.5gMgS04?7H200.5gFeS04?7H20

38、0.01g瓊脂20g水1000mLpH7.4 7.6（三）器材可溶性淀粉，KNO3, NaCl, K2HPO4?3H2O, MgS04?7H2O 和 FeS04?7H2O,瓊脂， 1mol/LNa0H， 1mol/LHCl 。試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝裝置，天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0）,棉花，報(bào)紙或牛皮紙，記號(hào)筆，線繩或尼龍繩，紗布等。（四）操作步驟1. 稱量和溶化按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。再稱取其它各成分依次逐一溶化。對(duì)微量成分FeSO4?7H2O

39、可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4?7H2。配成0.01g/mL,再在1000mL培養(yǎng)基中加入1mL 的 0.01g/mL 的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，則先加入瓊脂溶化后再加其它物質(zhì)。2. pH 調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同前。實(shí)驗(yàn)七 真菌分離和培養(yǎng)用培養(yǎng)基的制備一、馬丁氏（Martin ）培養(yǎng)基（分離真菌用）（一）目的要求通過對(duì)分離真菌用的馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基配制，掌握對(duì)選擇培養(yǎng)基的配 制方法，并明確選擇的原理。（二）基本原理馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是由葡

40、萄糖、一種用來分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是 由葡萄糖、蛋白陳、KH2PO4、MgSO4?7H2O、孟加拉紅（玫瑰紅，Rose BengaJ）和鏈霉素 等組成。其中葡萄糖主要作為碳源，蛋白陳主要作為氮源，KH2PO4和MgSO4?7H2O 作為無機(jī)鹽，為微生物提供鉀、磷、鎂離子。而孟加拉紅和鏈霉素主要是細(xì)菌和放線菌的抑制劑，對(duì)真菌無抑制作用，因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以達(dá)到優(yōu)勢(shì)生長，從而達(dá)到分離真菌的目的。馬丁氏培養(yǎng)基配方如下：KH2PO41gMgSO4?7H2O0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g瓊脂15-20g水1000mLpH自然此培養(yǎng)液1000mL加1%孟加拉紅1%水溶液3.3mL。臨用時(shí)

41、每100mL培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素液0.3mL。（三）器材KH2P。4、MgSO4?7H2。、蛋白陳、葡萄糖、瓊脂、孟加拉紅、鏈霉素。試管、玻棒、鋁鍋、量筒、培養(yǎng)基分裝裝置、天平、藥匙、高壓滅菌鍋等。（四）操作步驟1、 稱量和溶化按培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各成分，并將各成分依次溶化在少于所需要的水量中。待各成分完全溶化后，補(bǔ)足水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000mL培養(yǎng)液中加入1%的孟加拉紅溶液303mL,混勻后加入瓊脂加熱溶化。2、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同實(shí)驗(yàn)六。3、 鏈霉素加入由于鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)將培養(yǎng)基溶化后待溫度降至45左右時(shí)才能加入。可先將鏈霉素配成

42、1%的溶液，在100mL 培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL,使每mL培養(yǎng)基中含鏈霉素30微g。二、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（簡稱PDA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌用）（一）目的要求通過對(duì)培養(yǎng)真菌用的PDA 培養(yǎng)基配制，掌握對(duì)半合成培養(yǎng)基的配制方法，并明確選擇的原理。（二）基本原理馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來培養(yǎng)真菌的半合成培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是由馬鈴薯、一種用來培養(yǎng)真菌的半合成培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是 由馬鈴薯、葡萄糖、 瓊脂等組成。其中馬鈴薯煮汁可以提供碳源、氮源、 無機(jī)鹽和維生素等，葡萄糖主要作為碳源，瓊脂為凝固劑。馬鈴薯的表皮中含有龍葵堿的化學(xué)成分，對(duì)菌絲生長有抑制作用，所以馬鈴薯在使用時(shí)要去皮。在PDA 培養(yǎng)基上大多

43、數(shù)真菌都可良好生長。在PDA 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，可以添加一些其它物質(zhì)，使培養(yǎng)基營養(yǎng)更為豐富和全面，真菌菌絲可以生長的更好。如綜合 PDA 培養(yǎng)基就是在PDA基礎(chǔ)上添加0.3%的KH 2P。4和0.15%的MgSO4?7H2。以及微量的維生素B1而配制而成的。由于多數(shù)真菌喜歡偏酸性環(huán)境，而培養(yǎng)基滅菌過程中部分糖類會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，所以一般不需要調(diào)pH 值。如果是培養(yǎng)對(duì)酸堿度有特殊要求的真菌，可以用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)。PDA 培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯（去皮）200g葡萄糖20g瓊脂15-20g水1000mLpH自然（三）器材馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。小刀，試管、玻棒、鋁鍋、量筒、培養(yǎng)基分裝裝置、天平、藥匙、

44、紗布、高 壓滅菌鍋等。（四）操作步驟1. 馬鈴薯煮汁的制備將馬鈴薯洗凈去皮，稱量200g,用小刀切成長、寬為2cm,厚度為35mm 的土豆片，要求大小厚薄均勻。在 1000mL水中煮沸1520min,煮至無白心為 止。用 46 層紗布過濾，補(bǔ)充水分至1000mL。2. 葡萄糖和瓊脂的稱量與溶化稱取1520g瓊脂，加入土豆汁中，繼續(xù)加熱，并不斷攪拌，當(dāng)瓊脂充分溶化后，加入葡萄糖，攪拌直至完全溶化。3. 分裝、加棉塞、捆把、滅菌及滅菌同前。實(shí)驗(yàn)八 微生物的液體培養(yǎng)一、基本要求1. 掌握微生物液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法。2. 了解常見微生物液體培養(yǎng)的原理和方法二、基本原理固體發(fā)酵生產(chǎn)是將原料及菌體吸附

45、在疏松的固體支持物上，通過微生物的代謝活動(dòng)， 使發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單，不需要結(jié)構(gòu)復(fù)雜的發(fā)酵罐； 方法簡單，類似傳統(tǒng)的制曲法；能耗低， 不需要大量通氣和攪拌；原料粗放，可用很多種其它發(fā)酵工藝無法利用的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作原料；不易染菌，因霉菌能在水分較低的基質(zhì)表面增殖而細(xì)菌不易生長；產(chǎn)物回收所消耗溶劑和所產(chǎn)生廢水較少。其缺點(diǎn)是：設(shè)備占地面積多，勞動(dòng)強(qiáng)度大，傳質(zhì)和傳熱困難，產(chǎn)率和收率低，副產(chǎn)物多，培養(yǎng)過程進(jìn)行檢測(cè)困難。液體發(fā)酵生產(chǎn)是將發(fā)酵原料制成液體培養(yǎng)基，接種微生物，通過其代謝活動(dòng)， 使發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)品。液體發(fā)酵有表面發(fā)酵和深層發(fā)酵兩種方式，其中深層發(fā)酵是發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式。表

46、面發(fā)酵是在缺乏通氣裝置的情況下，對(duì)一些生長快速的微生物進(jìn)行好氧靜置培養(yǎng)。這種發(fā)酵通常在表面形成菌膜層。表面 發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單，能耗低，原料粗放；具缺點(diǎn)是占地面積多，勞動(dòng)強(qiáng)度大， 發(fā)酵時(shí)間長。深層發(fā)酵是微生物的菌體或菌絲均勻分散在液體培養(yǎng)基中，通過向培養(yǎng)液強(qiáng)制通氣或不通氣進(jìn)行產(chǎn)物合成的發(fā)酵。 深層發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)如下：占地面積小少，生 產(chǎn)規(guī)模大；發(fā)酵速度快，生產(chǎn)效率高；生產(chǎn)機(jī)械化，易于自動(dòng)控制，勞動(dòng)生產(chǎn)率 高；發(fā)酵設(shè)備密閉，傳熱傳質(zhì)好，生產(chǎn)便于管理；有利于產(chǎn)品提取，所得產(chǎn)品質(zhì) 量高。其缺點(diǎn)是設(shè)備條件要求較高。搖瓶培養(yǎng)是一種在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行制種、菌種篩選、性能鑒定、培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)最常用到的一種試驗(yàn)方法。特

47、別是在菌種的生產(chǎn)中，液體發(fā)酵 菌種有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，菌齡一致，延滯期短，便于接種等優(yōu) 點(diǎn)。三、器材黑曲霉、裂褶菌、大腸桿菌 ；PDA液體培養(yǎng)基、肉膏蛋白陳液體培養(yǎng)基；250mL三角瓶；無菌水；搖床；超凈工 作臺(tái)；紗布等。四、操作步驟1 .菌種的活化：將斜面保存菌種活化12次，黑曲霉培養(yǎng)25d,使其產(chǎn)生抱子。方法一：將裂褶菌斜面菌種活化23次，取培養(yǎng)4d的斜面菌種刮取菌苔，用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋成菌懸液，備用。圖2.2液體接種操作示意圖方法二：將活化菌種接種子液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 3d,再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)6do2 .黑曲霉菌懸液的制備：用無菌水洗下黑曲霉的抱子制成菌懸液。然后吸取2mL如圖2.

48、2所示接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。3 .搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)各組實(shí)當(dāng)均取250mL錐形瓶若干，編號(hào)后，分別加入上述搖瓶培養(yǎng)基80mL 于0.8 kg/cm2滅菌20min,冷卻后分別接種種子液5mL;培養(yǎng)溫度24C ;靜置培 養(yǎng)1d后，振蕩培養(yǎng)68d,搖床轉(zhuǎn)速180rpm/min.4 .觀察與測(cè)定(1)菌絲體干重的測(cè)定 收取的發(fā)酵醪以2500rpm離心或過濾獲得菌絲球， 70c烘干至恒重，以每100mL發(fā)酵醪中菌絲體干重(g/100mL)計(jì)。(2)菌絲和菌絲球的觀察觀察菌絲球生長情況，大小、質(zhì)地、顏色、內(nèi)部情況。挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲生長情況。(3)染菌檢測(cè) 觀察發(fā)酵液的色澤、氣味、固液相狀況；培養(yǎng)液

49、涂片，Loffler 堿性美藍(lán)單染色，鏡檢。同時(shí)，用牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48h檢查染菌菌 落。實(shí)驗(yàn)九 微生物的分離與純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆盏蛊桨宓姆椒ê蛶追N分離純化微生物的基本操作技術(shù)二、基本原理在土壤、 水、 空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰

50、其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合倒平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論是數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。三、器材高氏 1 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，盛9mL 無菌水的試管，盛90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接 種環(huán)，10酚，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素，土樣等。四、操作步驟1. 稀釋涂布平板法（ 1） 倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏 1 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷

51、至5560時(shí)，向高氏1 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10酚數(shù)滴，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液，使每mL培養(yǎng)基中含鏈霉素30仙且然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基 制三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶 ）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15mL,加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板

52、， 最好是將平板放室溫23d， 或 23培養(yǎng)24h， 檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。（2）制備土壤稀釋液 稱取土樣10g,放入盛90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角 燒瓶中，振搖約20min,使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1mL無菌吸管從中 吸取 1mL 土壤菌懸液注入盛有9mL 無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1mL無菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無菌水的試管中，以此類推制成10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6各種稀釋度的土壤溶液。（ 3）涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-4、 10-5、 10-6三

53、種稀釋度，然后用三支1mL 無菌吸管分別由10-4、 10-5、 10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.2mL對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕的涂布均勻，如圖2.3所示。圖 2.3 從土壤中分離微生物的操作過程示意圖（ 4） 培養(yǎng) 將高氏 1 號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23d。（ 5）挑菌將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28 和 37溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純

54、培養(yǎng)。整個(gè)分離過程見圖2. 稀釋混合平板法此法與稀釋涂布平板法基本相同，無菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取 0.5mLlO4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對(duì)號(hào)放入平皿，然后再倒入溶化后冷卻到45c 左右的培養(yǎng)基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，待冷凝成平板 后，分別倒置于28c和37c溫室中培養(yǎng)后，再挑取單菌落，直至獲得純培養(yǎng)。3. 平板劃線分離法(1)按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。(2)劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述101的土壤懸液 一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將 樣品在平板上進(jìn)行稀

55、釋，使形成單個(gè)菌落。常用的劃線方法有下列兩種：用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行 劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次 劃線的部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線的部分作第三次平行劃 線和通過第三次平行劃線的部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于 溫室培養(yǎng)。將挑取有樣品的接種環(huán)再平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫 室培養(yǎng)。(3)挑菌同稀釋涂布平板法，一直到菌分純?yōu)橹?。?shí)驗(yàn)十微生物大小測(cè)定及直接計(jì)數(shù)一、基本要求1 .掌握利用顯微測(cè)微尺測(cè)量微生物大小的基本方法。2 .掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的基本方法。二、基本原理1 .大小測(cè)定的基本原理微生物細(xì)胞大小，是微生物的基本形態(tài)特征之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測(cè)量。用來測(cè)定微生物大小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺(圖2.4)。鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格(或2mm等分為200格)，每格長度圖2.4鏡臺(tái)測(cè)微尺等于0.01mm (即