臘腸中羅丹明B的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法

1、223分析檢測(cè)食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 04臘腸中羅丹明B 的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法程 慧,李 兵,占春瑞(江西出入境檢驗(yàn)檢疫局,江西 南昌 330002摘 要:建立臘腸中羅丹明B(rhodamine B殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。試樣中殘留的羅丹明B 用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V 提取,經(jīng)凝膠色譜凈化系統(tǒng)凈化并濃縮后,用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定,外標(biāo)峰面積法定量。羅丹明B 在5100ng/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,3個(gè)水平(5.0、10.0、25.0g/kg添加羅丹明B 的回收率為79.8%110.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD為10.0%10.3

2、%,檢出限為5g/kg 。本方法簡(jiǎn)單、快速,適用于臘制品中殘留羅丹明B 的檢測(cè)。關(guān)鍵詞:臘腸;羅丹明B ;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜HPLC-MS/MS Determination of Rhodamine B Residue in Chinese Preserved SausagesCHENG Hui ,LI Bing ,ZHAN Chun-rui(Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanchang 330002, ChinaAbstract :A high-performance liquid chromatography-ta

3、ndem mass spectrometric (HPLC-MS/MS method was developed for the determination of rhodamine B residue in Chinese preserved sausages. The whole determination procedure consisted of extraction with a mixture of ethyl acetate and cyclohexane (1:1, V/V , cleanup with an Accuprep gel filtration chromatog

4、raphic system, rotary evaporation concentration, filtration through 0.22 m membrane, HPLC-MS/MS analysis, and quantitation by external standard method. The developed method showed a good linearity over the wide range of 5-100 ng/mL. Average recoveries of rhodamine B in spiked samples at three levels

5、 varied from 79.8% to 110.3%, with relative standard deviations between 10.0%and 10.3%. The limit of detection was 5 g/kg. Therefore, this method, thanks to its simplicity and rapidity, has a good applicability to the determination of rhodamine B residue in Chinese preserved sausages.Key words :saus

6、age ;rhodamine B ;high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS中圖分類號(hào):O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1002-6630(201004-0223-03收稿日期:2009-03-30羅丹明B(rhodamine B,俗稱花粉紅,是一種堿性熒光染料,作為熒光試劑已被廣泛用于食品、環(huán)保、礦業(yè)和鋼鐵等領(lǐng)域,是熒光分析方法上的常用分析試劑,對(duì)于它的光譜機(jī)理已有相關(guān)研究1-2。由于其具有持久鮮艷的顏色特性,于是有商販在加工臘腸時(shí)使用羅丹明B 改善臘腸的品相。而有關(guān)研究3

7、-5表明,羅丹明B 會(huì)引致老鼠皮下組織生肉瘤,半數(shù)致死量(大鼠,經(jīng)口500mg/kg ,美國(guó)曾對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行研究,顯示其具有致癌性,1993年起在歐美等國(guó)家和地區(qū)就已明令禁止用于食品加工中,日本也禁止使用該物質(zhì)。目前,對(duì)于臘腸中羅丹明B 測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道有液相色譜法6,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用有機(jī)溶劑提取,經(jīng)凝膠色譜凈化系統(tǒng)凈化并濃縮后,用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定,外標(biāo)峰面積法定量,以建立適用于臘腸中羅丹明B 的檢測(cè)方法。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器臘腸(以廣式臘腸為代表 市售。羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)品(Rhodamine B ,CAS 號(hào):81-88-9,C 28H 31Cl

8、N 2O 3,純度99.0%;乙酸乙酯、環(huán)己烷(均為分析純;甲醇、甲酸、乙腈(均為色譜純 Fisher 公司。Waters Quattro Premier 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(配超高效液相色譜系統(tǒng),包括四流路二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子源(ESI、三重四級(jí)桿質(zhì)量分2010, Vol. 31, No. 04食品科學(xué)分析檢測(cè)224析器 美國(guó)Waters公司;Accuprep MPS GPC凝膠色譜凈化系統(tǒng)美國(guó)J2 Scientific公司;DS-1組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;Vortex Genie 2渦旋振蕩器美國(guó)Scien-tific Industries公司;LD4-2A離心機(jī)北

9、京醫(yī)用離心機(jī)廠;KQ-600B超聲波清洗器江蘇昆山舒美超聲波儀器廠;R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器瑞士Buchi公司。1.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制準(zhǔn)確稱取適量羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此溶液在04避光保存,可使用3個(gè)月。根據(jù)需要用空白樣品提取液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成5、10、20、50、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。置于04避光保存,可使用3d?？瞻讟悠诽崛∫?用不含羅丹明B殘留的樣品,按照1.5節(jié)樣品前處理方法制備空白樣品提取液。1.3液相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱:Acquity UPLC TM BEH C18柱(2.1mm×100mm,1.7m;柱溫:3

10、5;流動(dòng)相:甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸溶液,梯度洗脫程序?yàn)榧状?0.2%甲酸(30:70,V/V維持1min,在2min內(nèi)甲醇體積分?jǐn)?shù)由70%線性遞增至90%,維持2mi n,再在1mi n內(nèi)線性遞減至30%;流速:0.20mL/min;進(jìn)樣量:10L;離子源:電噴霧離子源(E S I;掃描方式:正離子;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(M R M;毛細(xì)管電壓:1.0k V;離子源溫度:110;脫溶劑氣溫度:400;錐孔氣流量(氮?dú)?45L/h;脫溶劑氣流量(氮?dú)?600L/h;碰撞氣壓力(氬氣:0.22mL/min;碰撞室壓力(氬氣:0.003Pa;定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間見(jiàn)

11、表1。化合物母離子(m/z子離子(m/z錐孔電壓/V碰撞能量/eV駐留時(shí)間/s表1待測(cè)物定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間Table 1 MS/MS operating conditions for rhodamine B analysis注:*.定量離子。1.4凝膠色譜凈化系統(tǒng)(GPC條件凝膠色譜凈化系統(tǒng):A c c u p r e p(J2;柱子規(guī)格: 400mm×25mm;色譜柱填料:Bio-Beads S-X3(3875m;流動(dòng)相:乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V;流速: 5mL/min;收集時(shí)間:1121min。1.5樣品前處理稱取2.0g樣品(精確至0.

12、1mg于50mL離心管中,準(zhǔn)確加入25mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V,于旋渦混勻器上混合提取2min,再超聲提取15min后,于4000r/min 離心5m i n,上清液過(guò)0.22m微孔濾膜后作待凈化液。取10mL待凈化液于GPC樣品管中,用GPC進(jìn)行凈化,收集1121min洗脫液,于40條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,殘?jiān)?.0mL甲醇溶解后,過(guò)0.22m微孔濾膜,用HPLC-MS/MS測(cè)定,外標(biāo)峰面積法定量。2結(jié)果與分析2.1提取條件的選擇根據(jù)有關(guān)資料介紹羅丹明B鹽酸鹽溶解于水、甲醇和乙腈。研究中選擇了甲醇、不同比例的甲醇溶液、乙腈以及乙酸乙酯-環(huán)己烷提取。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),甲醇、甲醇溶液(甲醇體積

13、分?jǐn)?shù)60%以上、乙腈以及乙酸乙酯-環(huán)己烷均能完全提取樣品中的羅丹明B?？紤]到采用GPC 體系進(jìn)行凈化,因此,選用G P C體系的乙酸乙酯-環(huán)己烷溶劑作為提取溶劑。液-液分配和SPE小柱凈化是實(shí)驗(yàn)室常用凈化手段。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和乙腈提取樣品中的羅丹明B,乙酸鉛沉淀蛋白質(zhì),提取液經(jīng)正己烷脫脂后,再用C18、H R-X、氧化鋁及離子交換柱4種SPE小柱凈化,其回收率為67%130%,非常不穩(wěn)定,且操作步驟繁瑣。本研究采用GPC作為凈化手段,樣品中的羅丹明B經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷提取后直接用GPC凈化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)G P C凈化的樣品雜質(zhì)少,且操作步驟簡(jiǎn)單。2.2液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化比較了甲醇-甲

14、酸溶液體系、乙腈-甲酸溶液體系、甲醇-乙酸銨溶液體系、乙腈-乙酸銨溶液體系作流動(dòng)相對(duì)羅丹明B進(jìn)行分離分析,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇-甲酸溶液體系作流動(dòng)相梯度洗脫羅丹明B峰形較好,甲酸的體積分?jǐn)?shù)在0.1%0.5%范圍檢測(cè)靈敏度都沒(méi)有太大變化,因此最終選擇用甲醇-0.2%甲酸溶液體系作流動(dòng)相,梯度洗脫。對(duì)質(zhì)譜離子源及質(zhì)量分析器參數(shù)毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、錐孔氣流量、脫溶劑氣流量(氮?dú)狻⑴鲎矚鈮毫?、碰撞室壓力、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,確定了各參數(shù)的條件。在1.3節(jié)色譜條件下,羅丹明B的質(zhì)譜峰保留時(shí)間約為4.33min。標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1。225分

15、析檢測(cè)食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 042.3離子產(chǎn)生機(jī)理化合物加標(biāo)量/(g/kg回收率/%平均回收率/%80.7107.391.410.0表2 本方法回收率及精密度測(cè)定結(jié)果(n =8Table 2 Results of recovery and precision test for the method (n = 8為443.5的母離子,該母離子脫羧,形成一個(gè)質(zhì)荷比為399的子離子,脫羧脫甲基乙基得到一個(gè)質(zhì)荷比355的子離子,可能的裂解方式見(jiàn)圖2。2.4線性范圍、檢出限及回收率配制羅丹明B 質(zhì)量濃度均為5、10、20、50、100ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定峰面積,以質(zhì)量濃度

16、為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),繪制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線,在5100ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積值均有良好的線性關(guān)系。本方法的檢測(cè)低限采用添加法進(jìn)行實(shí)際測(cè)定得到,羅丹明B 在臘腸中的測(cè)定低限為5g /k g 。采用添加回收的方法,在不含分析物本底的臘腸樣品基質(zhì)中測(cè)定回收率。分別添加3個(gè)不同水平(5.0、10.0、25.0g/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液,上述每添加水平做8次平行樣品,回收率和室內(nèi)精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明,方法回收率在79.8%110.3%之間,總體平均回收率為91.4%96.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD為10.0%10.3%,精密度符合小于25%的要求。2.5樣品檢測(cè)收集了

17、17個(gè)超市銷售的臘腸樣品采用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行羅丹明B 殘留檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。參考文獻(xiàn):1魏永巨, 康志敏, 劉翠格, 等. 羅丹明B 的共振散射光譜研究J. 光譜學(xué)與光譜分析, 2004, 24(12: 1659-1662.2黃保軍, 李建軍, 屈凌波. 羅丹明B 熒光光譜機(jī)理的研究J. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 25(3: 8-10.3吳云龍, 熊玉峰, 房暉. 一種潛在的激光制冷介質(zhì)-羅丹明B 摻雜PMMAJ. 功能材料與器件學(xué)報(bào), 2004, 10(2: 383-396.4王雅娜, 崔勵(lì), 馬杰, 等. 羅丹明B 的三維熒光光譜研究J. 染料與染色, 2007, 4

18、4(5: 57-59.5劉鳳志, 江洪流, 羅楊合, 等. 四苯硼鈉-羅丹明類熒光染料體系的共振散射光譜研究J. 廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 21(4: 287-288.6王傳現(xiàn), 韓麗, 方曉明, 等. 食品中羅丹明的高效液相色譜熒光檢測(cè)J. 分析儀器, 2008(1: 27-30.圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM離子色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of rhodamine B standard inthe MRM mode4.34相對(duì)豐度/%時(shí)間/min0.51 1.52 2.53 3.544.55B. m/z 443.2>m/z 355.074.33相對(duì)豐度/%時(shí)間/min0.51 1.52 2.53 3.544.55A. m/z