胃舒散對消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護作用

1、胃舒散對消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護作用    【摘要】  目的： 研究胃舒散對消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護作用及機制。方法： 皮下注射消炎痛(10mg/kg)制作大鼠小腸損傷模型。用光鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察不同劑量30、15、075g/(kg·d)胃舒散對小腸損傷的影響,同時檢測小腸黏膜髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以及血清NO含量。結(jié)果：消炎痛引起明顯的小腸黏膜損傷，伴有NO、MPO、MDA含量增加及SOD活性下降(P<005,P<001)。

2、胃舒散劑量依賴性地減少小腸黏膜損傷指數(shù), 提高了胃組織SOD活性(P<005)、 降低了MPO、 MDA含量(P<005)， 但對血清NO水平無明顯影響(P>005)。結(jié)論：氧自由基及NO參與了消炎痛所致小腸黏膜的損傷，胃舒散對此病變有明顯保護作用，其機制與抗氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  小腸損傷 消炎痛 胃舒散 一氧化氮 超氧化物歧化酶 丙二醛  AbstractObjective:To study the 

3、;protective effect of Weishusan on small intestinal lesions induced by indomethacin in rats. Methods: Wistar rats were injected indomethacin(suspension 10 mg/kg)subcutaneously, and the 

4、small intestine was examined for lesions 24 hours later. The different doses30、15、075 g/(kg·d)of Weishusan were administered i.g. twice, intestinal mucosal changes were observed by

5、 quantitative histology，scanning electron microscopy and transmisson electron microscopy.  Superoxide dismutase(SOD)、myeloperoxidase(MPO)activities and malondialdehyde(MDA)levels in intestinal tissues and nitri

6、c oxide(NO)levels in serum were determined. Results: Severe lesions in the jejunum and ileum were caused by indomethacinand the NO、MPO and MDA contents were markedly increased

7、(P<005). Weishusan dose_dependently prevented the intestinal lesions(P<005), enhanced SOD activities(P<005)and decreased MPO and MDA levels(P<005) but not affected NO levels(P>005). Con

8、clusion: Oxygen free radicals and NO may play important roles in intestinal lesions induced by indomethacin. Weishusan can protect the small intestine by antioxidation mechanism.&#

9、160;   Key Wordsintestinal lesion; indomethacin; Weishusan; nitric oxide; superoxide dismutase; malondialdehyde   近年，隨著老年人口的增多，非甾體類消炎藥(NSAID)在防治冠心病、風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎等疾病中應(yīng)用愈來愈廣泛，其導(dǎo)致的胃腸疾病亦逐年增多。胃舒散是我院自行研制的中西藥復(fù)方散劑，多年臨床應(yīng)用顯示對胃炎、消化性潰瘍及胃腸功能紊亂等

10、有良好的療效1，2，但是否對藥物引起的小腸損傷有治療作用尚不清楚。本項目通過檢測有關(guān)生化指標(biāo)并借助光鏡、電鏡、生化技術(shù)觀察胃舒散的保護作用，旨在探討消炎痛致小腸損傷的機理并為臨床尋找新的治療方案。    1材料與方法    11 動物與藥物Wistar大鼠汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。體質(zhì)量(220±35)g，雌雄各半40只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水(過濾除菌的自來水)。胃舒散由我院藥劑科生產(chǎn)(批號：粵藥制字H03050164)。    12 模型制

11、備及實驗分組實驗前大鼠禁食、水2h。模型制作：將消炎痛粉溶于質(zhì)量分數(shù)5%碳酸氫鈉溶液內(nèi)，按10mg/mL濃度配成細混懸液，實驗時按10mg/kg的劑量1次皮下注射，24h后斷頸處死動物。分組：胃舒散治療組(在注射消炎痛前30min及注射后8h分別給予不同濃度但容量相同的胃舒散溶液，分2次灌胃)，胃舒散中劑量組(15g/kg，即按成人劑量15倍給藥)，胃舒散高劑量組30g/(kg·d)和胃舒散低劑量組075g/(kg·d)。模型對照組用等量的體積分數(shù)085%的NS灌胃，正常對照組皮下注射NS，亦給等量的085% NS灌胃。注射消炎痛后大鼠禁食不禁水，在第2次灌胃前仍

12、需禁水2h。    13光鏡檢查大鼠處死后剖腹，沿腸系膜附著的對側(cè)剪開小腸，在回腸中段6cm處取組織，用4等滲NS沖凈腸內(nèi)容物及黏液，體積分數(shù)10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精_伊紅染色，光鏡下觀察，按NEC法進行小腸損傷評分3。    14電鏡觀察掃描電鏡：將大鼠小腸組織放入含透明質(zhì)酸酶和_糜蛋白酶(pH 56)溶液中，在振蕩器上持續(xù)振蕩，去除黏膜面表層黏液，體積分數(shù)25%的戊二醛和體積分數(shù)2%的四氧化鋨雙重固定，常規(guī)乙醇系列脫水，醋酸異戊脂過渡，在HCP_2型臨界點干燥儀(

13、日立公司，日本)上干燥，噴金后在JSM_6360LA掃描電鏡(JEOL公司，日本)下觀察。透射電鏡：將小腸在冷的4%的戊二醛_磷酸鹽(pH 74)中切成小塊，預(yù)固定2h，1%的鋨酸后固定1h，環(huán)氧樹脂包埋，LKB_2088型超薄切片機(LKB公司，瑞典)切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色后，在H_800型電鏡(日立公司，日本)下觀察。    15生化指標(biāo)檢測取回腸中段組織，制成勻漿并離心，取上清液進行檢測。SOD測定采用改良的亞硝酸鹽法，在DU650型分光光度計(Beckman公司，美國)上測定，使空白管OD值下降50%的SOD量定為酶活力1個亞硝酸

14、鹽單位(NU/mg)。NO測定用NO酶法，設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，測定管內(nèi)加入03mL待測血清，各管混勻放置10min，(35004000)r/min離心10min，取上清液08mL，加入顯色劑04mL，混勻，15min后測其吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相應(yīng)NO濃度(NU/mL)。MPO測定見參考文獻4(U/g)。MDA測定按硫代巴比妥酸縮合法，試劑盒由南京聚力生物有限公司提供。蛋白質(zhì)測定采用Lowry法。    16統(tǒng)計學(xué)處理計量資料及損傷指數(shù)用±s表示，用SPSS115統(tǒng)計軟件，行單側(cè)ANOVAE及t檢驗分析。  

15、0; 2 結(jié)果    21光學(xué)顯微鏡觀察正常對照組上皮細胞排列整齊，形態(tài)基本正常，未見細胞明顯損傷，少數(shù)炎性細胞浸潤，損傷指數(shù)017±005。模型對照組小腸黏膜固有層水腫并伴有腸系膜緣炎性細胞浸潤，小腸絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，呈廣泛黏膜炎癥并伴縱向潰瘍(深淺不一、點狀、線狀)，沿小腸壁環(huán)周圍走向的潰瘍少見，尤以中段及遠端小腸病變明顯，損傷指數(shù)231±075，明顯高于正常對照組(P<001)。胃舒散高、中劑量組小腸黏膜損傷指數(shù)分別為128±047和135±050，與模型組比有統(tǒng)計學(xué)意義(

16、P<001，P<005)。胃舒散小劑量組損傷指數(shù)為165±058，與模型組比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>005)，表明高、中劑量胃舒散對小腸損傷具有保護作用。    22掃描電鏡觀察正常對照組小腸黏膜絨毛約150m×50m，呈條柱狀排列，表面光滑、完整，有片狀皺折(圖1A，封3)。模型對照組小腸上皮表面破損明顯，有縱向潰瘍(圖1B，封3)。胃舒散中、高劑量組小腸黏膜損傷明顯減輕，僅見點狀潰瘍，周邊上皮結(jié)構(gòu)完整(圖1C，封3)。    23 透射電鏡觀察正常對照組小腸黏膜為單層柱

17、狀上皮，其間夾有少量杯狀細胞，上皮游離面有豐富的微絨毛，上皮細胞間除游離端為緊密連接外，多數(shù)為中間連接和相嵌連接，胞質(zhì)豐富，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多。模型對照組上皮細胞極性消失，杯狀細胞顯著增多，黏膜柱狀上皮細胞體積縮小，可見細胞凋亡小體，核有固縮、溶解現(xiàn)象，異染色質(zhì)邊集成半月狀。胞質(zhì)內(nèi)線粒體斷脊、空泡變性，溶解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，血管普遍擴張，毛細血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)破裂(圖2A，封3)。胃舒散中、高劑量組小腸黏膜上述損傷則較輕，無核膜斷裂溶解，線粒體斷脊，溶解少見(圖2B，封3)。    24胃舒散對大鼠血液NO、 小腸組織MPO、 S

18、OD、MDA水平的影響從表中可見，模型對照組NO、MPO、MDA水平均明顯升高(P<005)，胃舒散中、高劑量組可顯著降低MPO、MDA的含量(P<005)，但對NO活性無明顯影響(P>005)；模型對照組SOD含量顯著低于正常對照組(P<001)，胃舒散中、高劑量組則可增加SOD活性，與模型對照組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)。表1胃舒散對大鼠血液NO、小腸組織MPO、SOD、MDA水平的影響    3討論    全球有約3500萬人/d使用NSAID，美國約有因NSAID引發(fā)的不良胃

19、腸反應(yīng)而住院者12萬人/d5。NSAID大部分呈脂溶形式，極易吸收，可直接破壞黏膜屏障，造成細胞內(nèi)pH下降，滲透壓上升，細胞腫脹乃至死亡。與此同時，它還可抑制前列腺素的產(chǎn)生，使受損傷的胃腸黏膜不能及時修復(fù)，最終出現(xiàn)組織損傷。本實驗結(jié)果表明，消炎痛能引起明顯的小腸黏膜損傷，上皮表面呈現(xiàn)深淺不一的縱向潰瘍，與文獻報道結(jié)果一致6。中、高劑量組胃舒散能顯著降低腸黏膜的損傷指數(shù)，證實胃舒散對消炎痛引起的急性小腸損傷具有治療作用。氧自由基在阿斯匹林、乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷中的作用已得到證實，然而，消炎痛致小腸損傷的研究國內(nèi)資料甚少。研究表明，在炎癥產(chǎn)生過程中，炎性細胞可通過“呼吸爆發(fā)”而產(chǎn)生大量氧自由基。M

20、PO存在于吞噬細胞顆粒中，有弱的過氧化氫酶活性，可產(chǎn)生自由基7。組織中SOD則具有清除超氧陰離子自由基的能力，一旦自由基產(chǎn)生過多或組織抗氧化能力減退，細胞則易發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷并伴隨其代謝產(chǎn)物MDA增加，因此，MPO、SOD與MDA常被用作衡量組織氧化代謝的相關(guān)指標(biāo)3，8。在腸缺血_再灌注損傷過程中常引起SOD活性下降，MDA水平增高9。消炎痛可誘導(dǎo)中性粒細胞在微血管內(nèi)皮粘附，使局部血流減少，并引起血管收縮，而供血不足是產(chǎn)生自由基的主要原因之一10。我們觀察到模型對照組小腸黏膜毛細血管充血、水腫及破裂，黏膜固有層有大量中性粒細胞浸潤，血管損傷明顯部位的組織病變較嚴(yán)重，并伴有MPO活性增加及MD

21、A水平增高，說明自由基參與了此病變的過程，與文獻報道一致710。高、中劑量胃舒散可降低MPO活性及MDA水平，阻遏小腸組織SOD水平的下降，說明胃舒散具有清除自由基的功能。NO在胃腸黏膜損傷中的作用近年較受關(guān)注。在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中呈現(xiàn)“雙刃”作用，即生理狀態(tài)下它可作為一種內(nèi)源性活性物質(zhì)發(fā)揮保護作用，如介導(dǎo)胃腸平滑肌的舒張，維持腸黏膜微循環(huán)屏障功能，降低微循環(huán)阻力，減輕血小板活化因子引起的腸損害，對WBC粘附和滲出起化學(xué)屏障作用，減少腸上皮通透性及促進急性損傷后上皮修復(fù)。病理情況下，NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)，又具有細胞殺傷毒性與促炎作用11。一般認為，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)主要分布

22、于巨噬細胞、內(nèi)皮細胞中，生理狀態(tài)下并不表達，在內(nèi)毒素和某些細胞因子的刺激下它才進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，催化生成大量NO。NO可直接引起細胞毒作用或通過氧自由基氧化生成毒性更大的ONOO-，而后者作為一種強氧化劑具有強烈地抑制細胞線粒體氧化呼吸作用，導(dǎo)致能量代謝障礙而致細胞死亡12。Chen等13觀察到消炎痛可引起腸黏膜MPO增加及損傷加重，同時伴有誘導(dǎo)型iNOS表達增加。給予NG_硝基_L_精氨酸甲基酯(L_NAME)抑制內(nèi)源性NO合成則顯著減少MPO活性并緩解小腸損傷。作者認為消炎痛引起腸黏膜損傷的機理與NO有關(guān)。研究還證實NO與超氧自由基O2均起損傷作用，而且具有相加的效果14。本文模型對照組MP

23、O及NO水平增高，黏膜損傷加重，與上述作者的研究結(jié)果一致。胃舒散組NO水平雖有改變但與模型對照組比無統(tǒng)計學(xué)意義，提示在消炎痛引起的小腸損傷中，NO只起部分作用，胃舒散的治療作用與NO無明顯關(guān)系。由于我們檢測的是血液中而非組織中的NO含量，這種升高的NO究竟是產(chǎn)生保護作用還是起到損傷作用有待進一步研究。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治胃腸損傷方面有重要價值，如大黃具有清熱、抗炎、通便的特性，常用于治療腸道疾患。李新宇等9在研究中發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制iNOS基因表達，調(diào)節(jié)NO的釋放，防治大鼠缺血再灌注所致的肺損傷并減輕腸損傷。文獻報道，具有健脾、活血功能的中藥，可改善微循環(huán)狀態(tài)15。我們在實驗中觀察到，有效劑量的胃舒

24、散組小腸病損輕，尤其是毛細血管結(jié)構(gòu)較完整，細胞線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器腫脹、脫顆粒少見。據(jù)推測胃舒散具有細胞保護作用，其制劑中木香、大黃、石菖蒲、雞骨香、甘草等健脾理氣、活血解毒之成分，可能通過改善黏膜微循環(huán)狀態(tài)，增加局部組織供氧和改善能量代謝以及抗氧化作用而減少腸損傷。 【參考文獻】  1吳靈飛， 王炳周， 馮家琳， 等. 根除幽門螺桿菌對消化性潰瘍合并的胃炎及胃泌素的影響J. 臨床消化病雜志， 2004， 16(6): 250-252.2吳靈飛， 鄭宗茂， 李

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