醫(yī)學微生物學實驗：實驗9

1、實驗九實驗九病毒包涵體觀察（示教）病毒CPE觀察（示教）登革病毒的抗體檢測（示教）病例六2總結 HIV感染初篩與確證實驗（結果示教）流感病毒血凝試驗（操作，每組一份）血凝抑制試驗（示教）病毒病毒CPE（cytopathic effect ）CPE 有些病毒在細胞內增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應.常見變化：細胞融合、變圓、壞死、溶解、脫落Monolayer of intact Vero cells未形成蝕斑的正常細胞未形成蝕斑的正常細胞形成蝕斑的病變細胞形成蝕斑的病變細胞登革病毒蝕斑試驗登革病毒蝕斑試驗結果分析與用途結果計算:l計數(shù)空斑形成數(shù)，計算病毒空斑形成單位（PFU）；lPF

2、U/mL=稀釋倍數(shù)該稀釋度計數(shù)的平均空斑數(shù)/病毒液體積 用途：檢查和準確滴定感染性病毒數(shù)量登革熱病毒抗體檢測登革熱病毒抗體檢測操作步驟l加10 L 全血/血清/血漿于環(huán)形孔l2 滴Buffer于方形孔l15 min讀結果結果分析結果分析初次感染：IgM和質控區(qū)域出現(xiàn)粉紅色條帶再次感染：IgM，IgG和質控區(qū)域出現(xiàn)粉紅色條帶再次感染：IgG和質控區(qū)域出現(xiàn)粉紅色條帶陰性： 僅質控區(qū)域出現(xiàn)粉紅色條帶無效： 質控區(qū)域沒有出現(xiàn)粉紅色條帶病例六病例六2討論討論入院后進行檢查（含感染性疾病篩查），確診為“帶狀皰疹”，同時也發(fā)現(xiàn)HIV-1抗體（ELISA）呈陽性，并經(jīng)市疾控中心進行Western blot檢測

3、證實為HIV-1感染。后追問病史，患者否認冶游史，但在2013年底發(fā)現(xiàn)丈夫為同性戀，并與之離異。經(jīng)檢測，患者目前CD4+ T淋巴細胞數(shù)目為214個/l，HIV-1病毒載量為5228拷貝/ml。 病例六病例六2討論討論討論患者的治療策略。 擴展討論：HIV感染的途徑有哪些？HIV感染的疾病分期有哪些？HIV感染發(fā)展到艾滋病期可能出現(xiàn)的癥狀有哪些？ 擴展討論：試述HIV感染的治療原則。 病例六病例六2分析分析抗病毒治療、HAART治療 可能癥狀：原因不明的持續(xù)不規(guī)則發(fā)熱、慢性腹瀉、體重減輕、機會性感染、機會性腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、癡呆等HAART治療HIV初篩初篩檢測Ab方法： ELISA：雙抗

4、原夾心法 明膠顆粒凝集法 快速檢測方法：膠體硒法、膠體金法膠體硒法（免疫層析法）膠體硒法（免疫層析法）血清/血漿樣品： 加50ul樣品于反應塹中 1560min讀取結果全血樣品： 加50ul樣品于反應塹中 樣品吸收后加入一滴Chase緩沖液 1560min讀取結果結果判斷結果判斷1.1.陽性陽性: : 病人條帶病人條帶 質控線質控線2.2.陰性陰性: : 一條紅線一條紅線( (質控線質控線) )3.3.無效無效: : 沒有紅線沒有紅線 或或 一條紅線一條紅線( (病人條帶病人條帶) )二條紅線二條紅線陰性陰性陽性陽性HIV確證試驗確證試驗（ WB法）法）1.1.電泳：電泳：HIV-蛋白成分分開

5、蛋白成分分開2.2.蛋白印跡在硝酸纖維膜蛋白印跡在硝酸纖維膜3.3.血清滴到硝酸纖維膜進行孵育，漂洗血清滴到硝酸纖維膜進行孵育，漂洗4.4.滴加酶標記的羊抗人滴加酶標記的羊抗人IgG進行孵育，漂洗進行孵育，漂洗5.5.加底物顯色加底物顯色6.6.觀察結果：觀察結果： 有抗體結合處出現(xiàn)紫藍色條帶有抗體結合處出現(xiàn)紫藍色條帶病毒學診斷病毒學診斷血清學試血清學試 驗驗檢測病毒及檢測病毒及 組分組分檢測抗原檢測抗原 檢測核酸檢測核酸 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)與鑒定與鑒定電鏡檢查電鏡檢查 病毒血凝試驗病毒血凝試驗病毒表面病毒表面的糖蛋白的糖蛋白 HAHARBCRBC表面的表面的糖蛋白受體糖蛋白受體凝集凝集原理：原

6、理：操操 作作19孔加生理鹽水孔加生理鹽水200l18孔倍比稀釋流感病毒尿囊液孔倍比稀釋流感病毒尿囊液200l91孔加入雞紅細胞孔加入雞紅細胞200l搖勻室溫靜置搖勻室溫靜置45min，觀察結果，觀察結果注意事項注意事項吹吸過程避免產生氣泡；紅細胞從最后加起；光滑臺面上慢慢劃圈搖勻，防止濺出；觀察時減少移動；時間延長凝集的紅細胞可能再解離。 結果分析結果分析l +l呈呈+凝集的最高病毒稀釋度為病毒的紅細凝集的最高病毒稀釋度為病毒的紅細胞凝集滴度（即胞凝集滴度（即一個血凝單位一個血凝單位）l粗略估計病毒顆粒的數(shù)量粗略估計病毒顆粒的數(shù)量（一個血凝單位（一個血凝單位106病毒顆粒病毒顆粒/ml）用途

7、和意義用途和意義檢測某些病毒的存在滴定病毒血凝效價，粗略估計病毒顆粒的數(shù)量血凝抑制試驗血凝抑制試驗血凝抑制抗體血凝抑制抗體病毒的血凝素病毒的血凝素RBC中和中和不凝不凝集集某些病毒感染的輔助診斷某些病毒感染的輔助診斷原理：原理：生理鹽水 加入量 稀釋度方方 法法1 2 3 4 5 6 7 8 9 101:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.1病 人 血 清4U流感病毒液1%雞紅細胞 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.0

8、5 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05搖勻，置室溫45min 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 棄去加液方向加液方向病毒對照RBC對照29孔加生理鹽水孔加生理鹽水50 l ，10孔加孔加100 l1孔加病人血清孔加病人血清50 l2孔加病人血清孔加病人血清50 l，28孔倍比稀釋孔倍比稀釋91孔加孔加4U病毒液病毒液50 l靜置靜置10min101孔加雞紅細胞孔加雞紅細胞靜止靜止45min，觀察結果，觀察結果操操 作作紅細胞凝集抑制效價紅細胞凝集抑制效價完全抑制紅細胞凝集的最高血清稀釋度用用 途途檢測抗體的存在，滴定抗體效價， 用于某些病毒感染的輔助診斷。已知已知待測待測外毒素外毒素-抗毒素抗毒素破傷風毒素破傷風毒素破傷風毒素抗體破傷風毒素抗體小鼠小鼠抗抗o試驗試驗溶血素溶血素O-膠乳膠乳顆粒顆粒抗體抗體200IU，白色，白色凝集凝集RPR試驗試驗類脂質抗原類脂質抗原-炭炭粒粒梅毒螺旋體反應梅毒螺旋體反應素素黑色凝集黑色凝集可能感染可能感染肥達試驗肥達試驗傷寒副傷寒沙傷寒副傷寒沙門菌門菌O/H抗原抗原抗體抗體凝集凝集+效價，雙份血清效價，雙份血清糞標本玻片凝集糞標本玻片凝集多價血清抗體多價血清抗體致病菌菌