pcr實驗室檢查要點()教學(xué)內(nèi)容

1、PCR 實 驗 室 檢 查 要 點( 2016)精品資料聚合酶鏈反應(yīng)（PCR檢驗實驗室檢查要點指南（2016版）聚合酶鏈反應(yīng)檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的 DN堿RNA勺檢驗實驗室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction , PCR是一種在體外特異性擴增靶 DNAff列的技術(shù)，其 基本過程為模板雙鏈DNA勺變性、引物與模板DNA勺退火和在DNA 聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的 擴增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴增產(chǎn)物量呈指數(shù) 形式上升，即經(jīng)過n個循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。PCR式劑操作 簡單，短時間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百

2、萬個特異靶 DNAff列的復(fù)制，為 臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估提供了一種極有幫助的實驗 室輔助手段。PCR僉驗實9室是PCR式劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗過程中不可缺 少的工作環(huán)境，具環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn) 品是否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，醫(yī)療器械生 產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī) 范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則條款中，明確對PCR式劑的生產(chǎn)和檢驗環(huán)境做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān) 文獻中對于PCR僉驗實驗室均作出規(guī)定，主要涉及全國臨床檢驗 規(guī)程（第三版）、醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī) 政發(fā)2010194號）、醫(yī)

3、療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則及臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR技術(shù)的應(yīng)用（WS/T 230-2002）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強對 PCR 僉驗 相關(guān)過程的認知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對 PCR僉驗實 驗室設(shè)計建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時，為 PCR式劑生產(chǎn) 企業(yè)在PCR僉驗實驗室的設(shè)計建造和管理要求提供參考。當(dāng)國家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時，應(yīng)當(dāng)重新討論 以確保本檢查指南持續(xù)符合要求。一、適用范圍本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、實施的體 外診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可 證現(xiàn)場核查、醫(yī)療

4、器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等各項涉及 PCR僉驗實驗室 檢查的參考資料?；驕y序檢驗實驗室等涉及PCR式劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢 查指南執(zhí)行。二、檢查要點（一）現(xiàn)場查看生產(chǎn)企業(yè)PCR僉驗實驗室布局生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供PCR僉驗實驗室設(shè)計方案和/或平面設(shè)計圖 （應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度）。1 .PCR檢驗實驗室與PCR式劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨立的建筑 物或空間內(nèi)，保證空氣不直接聯(lián)通，防止擴增時形成的氣溶膠造成 交叉污染。2 .原則上PCR僉驗實驗室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲存和準(zhǔn)備 區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功 能，區(qū)域可適當(dāng)合并。若使用實時熒光定量 PCR：且不需要進行后 續(xù)產(chǎn)物分析

5、工作，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處 理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、 擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。3 .各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空 間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當(dāng)只是形 式上的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。4 .各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接相通。擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū) 各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機組方式的，PCR僉驗實驗室應(yīng)當(dāng)具備獨立空調(diào)機組；同時應(yīng)當(dāng)考慮停機后各房間空氣連 通的可能性，采取必要的控制措施。5 .按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的

6、方式進行，使得PCR僉驗實驗室的空氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增 產(chǎn)物分析區(qū)方向進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū) 域?？諝饬飨驊?yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓 差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不 宜低于5帕。6 .設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實驗室和走廊的門應(yīng)當(dāng)安裝 連鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個門同時打開的情況。7 .各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開門，要求密封嚴實，并 且兩側(cè)的門應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施保證兩側(cè)門不會同時開 啟。(二)現(xiàn)場查看儀器設(shè)施配置1.試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)的功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝

7、和 擴增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn) 備。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：(1)溫度調(diào)控范圍為2c8c和(或)-20 C以下冰箱；(2)混勻器；(3)微量加樣器；(4)紫外消毒設(shè)備；(5)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；(6)專用工作服和工作鞋(套)；(7)專用辦公用品。2 .標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸(RNA DNA提取、貯存及加樣 配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：(1)溫度調(diào)控范圍為2c8c和(或)-20 C以下冰箱；(2)高速離心機；(3)混勻器；(4)水浴箱或加熱模塊；(5)微量加樣器；(6)紫外消毒設(shè)備；(7)生物安全柜；(8)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心

8、管和加樣器吸頭(帶濾芯)；(9)專用工作服和工作鞋(套)；(10)專用辦公用品；(11)如需處理大分子DNA應(yīng)當(dāng)具有超聲波儀。3 .擴增區(qū)的功能：cDN的成、DNAT增及檢測。配套用品一般 應(yīng)當(dāng)包括：(1)核酸擴增儀；(2)微量加樣器；(3)紫外消毒設(shè)備；(4)消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；(5)專用工作服和工作鞋；(6)專用辦公用品。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴增片段的進一步分析測定。視檢驗僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝5精品資料方法不同而定，基本配置如下：(1)微量加樣器；(2)紫外消毒設(shè)備；(3)消耗品：一次性手套、一次性帽子、加

9、樣器吸頭(帶濾芯)；(4)專用工作服和工作鞋；(5)專用辦公用品。5.設(shè)備的維護保養(yǎng)應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護保養(yǎng)規(guī)程，計量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定。例如核 酸擴增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機應(yīng)當(dāng)每年進行檢定或 校準(zhǔn)工作。(三)現(xiàn)場檢查工作流程及注意事項1 .進入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和 準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)。2 .各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物 品不得混用。3 .不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分，不得混用(例如可以 采用不同顏色)。4 .實驗室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴 增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域

10、應(yīng)當(dāng)有其各自 的清潔用具并防止交叉污染。實驗垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照醫(yī)療廢物管理條例相關(guān)規(guī)定進行處理。5 .工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對工作區(qū)進行清潔及消毒。6 .貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運送至試 劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)。應(yīng)當(dāng)對加樣吸頭、PCRS應(yīng)管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品應(yīng) 當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。試劑應(yīng)當(dāng)使用分子生物學(xué)級別試劑，使用的 純化水應(yīng)當(dāng)高壓滅菌。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗用的 PC皈應(yīng)試劑應(yīng)當(dāng)有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作程序。7 .為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，應(yīng)當(dāng)蓋好含反 應(yīng)混合液的反應(yīng)管。應(yīng)當(dāng)注意 PC皈應(yīng)液加樣的

11、順序，應(yīng)當(dāng)為空白 樣品-陰性對照一樣品一陽性對照。對具有潛在傳染危險性的材 料，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。8 .應(yīng)當(dāng)避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴增區(qū)內(nèi)的走動， 擴增反應(yīng)管不得在擴增區(qū)打開。9 .擴增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如 澳化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應(yīng)當(dāng)注意實驗人員的 安全防護。（四）現(xiàn)場檢查人員培訓(xùn)情況參與PCR僉驗的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識和技能，包 括能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個工作的流程，掌握出現(xiàn)污染情況的 處理方法以及實驗室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋。檢查人員可以通過詢問或要求人員實際操作對其進行評價，也

12、 可以通過查閱人員培訓(xùn)記錄，對其進行評價。（五）現(xiàn)場檢查文件情況在檢查過程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場查看、詢問、記錄的實際情況 與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝9附件:理想的PCR僉驗實驗室設(shè)計產(chǎn)物分析區(qū)獷增區(qū)耐沐制備區(qū)忒劑推備區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向?qū)Ｓ米呃?7韁沖取一3線沖間緩沖間I:作流向0-圖A緩沖間為負壓的理想PCR僉驗實驗室設(shè)置模式產(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向T緩沖問緩沖間緩沖間.匚作流向?qū)Ｓ米呃??圖B緩沖間為正壓的理想PCR僉驗實驗室設(shè)置模式圖A和圖B所給出的PCR僉驗實驗室設(shè)置圖是較為理

13、想的設(shè)置模式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計并建立實驗室。精品資料參考資料：1 .關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告（國家食品 藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號）2 .關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的 公告（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號）3 .關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則等4個指導(dǎo)原則的通知（食藥監(jiān)械監(jiān)2015218號）4 .生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范（GB50346-20045 .實驗室生物安全通用要求（GB19489-20086 .臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR技術(shù)的應(yīng)用（WS/T203- 2002）7 .全國臨床檢驗操作規(guī)程第3版,中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī) 政司，2006年11月2日8 .Setting Up a PCR Laboratory-Theodore E