級121221研究生免疫學實驗指導最終版

1、2012級研究生免疫學實驗指導 東南大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學系目的：掌握常見的免疫功能測定方法。內(nèi)容：一、NK細胞殺傷活性檢測（鼠脾細胞）二、外周血中淋巴細胞的分離和T細胞檢測（人PBMC） 三、直接免疫熒光法測定T細胞亞群（鼠脾細胞） 四、ELISA測定特異性抗體（人血清）概述: 免疫功能是機體重要的生理功能，機體通過免疫系統(tǒng)可以識別和排除抗原性異物，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，免疫功能可分為天然免疫和獲得性免疫。天然免疫(innate immunity)是機體在種系發(fā)育和進化過程中形成的防御功能，它由屏障結(jié)構(gòu)、免疫細胞(單核-巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞等)和體液中抗微生物的分子(補體、溶

2、菌酶、干擾素等)構(gòu)成，它們是機體的第一道防線，在抵抗病原體的侵入和感染早期中執(zhí)行防衛(wèi)功能。獲得性免疫(acquired/adaptive immunity)是指出生后通過與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能，具有特異性和記憶性，又稱為特異性免疫。特異性免疫可分為體液免疫和細胞免疫，其中體液免疫的效應產(chǎn)物為抗體，抗體在清除細胞外的病原菌及其產(chǎn)生的毒素等抗原方面發(fā)揮重要作用；而細胞免疫的效應產(chǎn)物為效應T細胞(CD8+CTL和CD4+Th1細胞)，效應T細胞在清除胞內(nèi)的病原體感染，排斥異體移植物及抗腫瘤免疫中起重要的作用。通過檢測免疫功能, 不僅可以了解機體的正常免疫功能狀態(tài)，而且可以研究實驗條件

3、下和病理狀態(tài)的免疫功能變化及其各種影響免疫功能的因素，目前免疫功能的檢測方法已廣泛應用于醫(yī)學和生物學領(lǐng)域的研究。實驗課流程安排第一天8：00開始，上午和下午NK實驗和人外周血中PBMC分離及E-花環(huán)實驗同時進行1份/組，5人/組1.每組安排3名同學做NK實驗，每個實驗室分有2個超凈臺，每次2個小組進行實驗，輪流進行；另外每組安排2名同學做PBMC分離及E花環(huán)。2.每個組取1只小鼠，選2人在超凈臺中（無菌環(huán)境下）殺鼠取脾細胞，計數(shù)后將細胞用1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整脾細胞濃度為2.5×106脾細胞/ml,每組需2 ml細胞懸液，加入1支無菌試管中備用，進行NK實驗。3.每個實驗室邀1名同學

4、采血5ml,加入5 ml Hanks液混勻，而后每組分得2ml抗凝血自行進行PBMC分離和隨后的E-花環(huán)實驗。4.下午試驗結(jié)束前包被酶標條板，為第二天的ELISA實驗做準備。第二天8:00開始，上午T細胞亞群熒光染色和ELISA實驗同時進行，1份/組，5人/組1.每室取1只小鼠，選2人在實驗室中（有菌環(huán)境下）殺鼠取脾細胞，計數(shù)后將細胞分至每個小組：用0.5BSAPBS調(diào)整細胞濃度為5×106脾細胞/ml,每組得2 ml，分別加入2支玻璃小試管中（1ml/管），離心后棄上清，細胞沉淀分別進行CD4和CD8熒光染色。 2. 每組選部分同學進行酶聯(lián)免疫吸附實驗實驗一 NK細胞殺腫瘤細胞活性

5、檢測原理： NK細胞是天然免疫反應中的一類主要的效應細胞，對機體的靶細胞（如腫瘤細胞、病毒感染細胞等）進行非特異性殺傷，作用機制包括分泌穿孔素、顆粒酶等。NK細胞殺傷活性的檢測和分析能充分反應機體的天然細胞免疫功能狀態(tài)，有助于了解疾病進程和治療效果等方面的情況。本實驗取未免疫鼠的脾細胞群作為NK細胞的來源，使之與Yac-1腫瘤細胞共孵育。后者是小鼠NK細胞最敏感的靶細胞。MTT(甲臢)能參入活細胞的胞漿中，當細胞被殺破裂后，MTT從胞漿中釋放出來，可離心去除。剩余活細胞被DMSO破壞后MTT被溶解顯色，顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與活細胞的數(shù)量呈正比。MTT摻入法是區(qū)分死活細胞的常用方法之一。主要試

6、劑：1.小鼠脾細胞：來源于昆明鼠，每組1只小鼠。2.Yac-1腫瘤細胞株：1×105/ml，2ml/組3.10%FCS-1640細胞培養(yǎng)液4無菌Hanks平衡鹽溶液5.無菌細胞離心管6.無菌吸管和滴管7.MTT (5mg/ml in 1640 medium，2.5ml/室)8.DMSO 原液（200 ml/室）9. 96孔U形底細胞培養(yǎng)板10.血球計數(shù)器、96孔板離心機、酶標儀、顯微鏡等分組：5人/組操作步驟：（在超凈臺中進行）1. 脾細胞懸液的制備：將已采取血液的小鼠進行頸椎脫位，處死的小鼠置70%乙醇中浸泡5-7 min，采取小鼠脾臟置于含有Hanks液的平皿中，金屬網(wǎng)上研壓，收

7、集小鼠脾細胞懸液于一無菌離心管中。2. 脾細胞的洗滌：加入Hanks使脾細胞懸液至6mL，離心1200r/min、12min，一次性棄上清，彈起細胞沉淀后再加入Hanks液至6mL，混勻后進行細胞計數(shù)。離心1200r/min，12min，棄去上清。3細胞計數(shù)：取0.1ml于另一小試管（注：不是無菌離心管），補加1.9ml白細胞稀釋液，在血細胞計數(shù)板上于低倍鏡計數(shù)，根據(jù)以下公式求出每毫升細胞數(shù)。細胞數(shù)/ml = 4個大方格細胞總數(shù) ×104×稀釋倍數(shù)（20）44.每只小鼠取1×107脾細胞的Hanks液懸液于另一試管中，離心1200r/min，12min，棄去上清。

8、5.細胞沉淀重懸于4 ml 10%FCS-1640細胞培養(yǎng)液中，細胞濃度為2.5×106細胞ml，置370C溫箱備用。6.收集培養(yǎng)中的Yac-1腫瘤細胞株，用10%FCS-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×105/ml，2ml/組，置無菌離心管中，置370C備用。7.接種細胞：效靶比為25：1E/T孔: 0.1mlYac-1/孔 + 0.1ml脾細胞/孔，6個復孔E對照孔：0.1ml培養(yǎng)液/孔 + 0.1ml脾細胞/孔，6個復孔T對照孔：0.1ml培養(yǎng)液/孔 + 0.1mlYac-1/孔，6個復孔然后，所有孔中加入MTT溶液，20ul/孔。8.將96孔細胞培養(yǎng)板（1塊/室）置5%

9、CO2，370C細胞培養(yǎng)箱孵育4小時。9.將96孔細胞培養(yǎng)板（1塊/室）置離心機中，離心1200r/min, 12min10.輕輕取出細胞培養(yǎng)板，每孔從上層輕輕吸去150ul培養(yǎng)液，然后每孔加入200ulDMSO，室溫充分振蕩10min。而后置酶標儀450nm光波處比色，讀取各孔OD值，每板的H12孔用DMSO做空白對照。11.按下式計算NK細胞殺傷比率：NK殺傷活性（%）= 1- E/T孔平均OD值 - E對照孔平均OD值4 T對照孔平均OD值實驗二 人外周血單個核細胞的分離和T細胞檢查一、單個核細胞（PBMC）的分離原理： 本實驗采用細胞比重的不同，進行淋巴細胞的分離，實驗材料來源于人類的

10、外周血，其中人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包含淋巴細胞和單核細胞。 PBMC（淋巴細胞和單核細胞）的比重為1.070，而紅細胞與粒細胞比重為1.092左右。利用比重1.077±0.001g/L近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液(稱為淋巴細胞分層液)作密度梯度離心時,各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集。血漿和血小板由于密度較低,故懸浮于分層液的上部；紅細胞與粒細胞由于密度較大,故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液,故位于分層液和血漿的之間,吸取該交界面的液體，就可獲得PBMC。主要試劑： 1

11、肝素溶液：用生理鹽水將肝素配制成125250U/ml的溶液,置4下保存?zhèn)溆谩?2淋巴細胞分層液：市售,20時密度應為1.077±0.001g/L。 3Hanks平衡鹽溶液,pH7.27.4。 4錐底離心管、水平離心機、顯微鏡等。操作步驟： 1每室采集靜脈血5ml（隨需要而定），注入盛有肝素的無菌試管中，立即輕輕搖勻,使血液抗凝，然后補加5 ml Hanks液，混勻，使血液等倍稀釋,可降低紅細胞的凝聚,提高分離效果。2每組取一潔凈離心管，加入2ml淋巴細胞分層液,然后吸取2ml稀釋后的血液沿試管壁緩慢加至分層液表面,應注意保持兩者界面清晰,勿使血液混入分層液內(nèi)。3將離心管置水平式離心機

12、內(nèi),以2000rpm/min、離心20min。離心后,管內(nèi)可分為以下四層:上層為血漿、血液稀釋液及絕大部分血小板;下層為紅細胞及粒細胞;中層為細胞分離液;分離液與血漿交界部位混濁的灰白色層即為單個核細胞層。4用毛細吸管輕輕插入灰白色層,沿管壁輕輕吸出灰白色的單個核細胞,置于另一支干凈離心管中。6加入Hanks液至8ml，離心1200rpm/min、14min,一次性棄上清，去除大部分混雜的血小板等成份。7同上重復洗滌一次，棄上清，彈起細胞沉淀，置370C備用。注意事項： 1操作應輕柔,細胞懸液應充分混勻,避免損傷細胞活性及細胞丟失。2細胞離心后一次性棄上清時，在保證不丟失細胞的前提下應注意盡量

13、將試管口的液體棄去，使細胞沉淀的體積減少，尤其是進行抗體染色時。二、T淋巴細胞的檢測E花環(huán)試驗原理：T淋巴細胞膜表面有E受體綿羊紅細胞 (SRBC)受體，E受體就是CD2抗原。當人淋巴細胞與綿羊紅細胞混合，在一定條件下，綿羊紅細胞可作為配體結(jié)合到T淋巴細胞周圍，形成光學顯微鏡下可見的E花環(huán)。在上個世紀，本試驗多用于人外周血T細胞的鑒定和計數(shù)，正常成人外周血淋巴細胞的E花環(huán)形成率約為60%-70%。主要試劑：10.5%SRBC懸液：將脫纖維的綿羊血用Hanks平衡鹽溶液洗滌三次，再用Hanks平衡鹽溶液配制成8×107/ml懸液。2Hanks平衡鹽溶液、胎牛血清、瑞氏染液。3潔凈試管、

14、水平離心機、顯微鏡等。操作步驟： 1.在上述離心后的細胞沉淀中加入0.1ml胎牛血清，再加0.2ml的0.5%SRBC懸液，混勻，置37溫箱5min，低速離心500rpm/min，5min,然后置4冰箱2小時。2取出試管，輕輕旋轉(zhuǎn)，使沉淀的細胞重新懸浮，用尖頭滴管取出一滴置于栽玻片上，蓋上已滴加半滴瑞氏染液的蓋玻片，于高倍鏡下觀察和計數(shù)。結(jié)果判斷：淋巴細胞（淺藍色）周圍粘附有3個以上SRBC（淺黃色）者即為花環(huán)陽性細胞。共計數(shù)100個藍色的淋巴細胞,可計算出花環(huán)形成細胞的百分率，即為T細胞在淋巴細胞群中的比例。實驗三 T細胞亞群的分析原理：T淋巴細胞是不均一的細胞群，他們在功能和表面標志上各不

15、相同。根據(jù)T細胞膜表面的CD分子不同，可將其分為CD4亞群和CD8亞群，它們在免疫應答和免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。目前檢測T細胞亞群的主要方法是免疫熒光染色和流式細胞術(shù)等。本試驗采用直接免疫熒光法檢測T細胞亞群，即已知熒光素標記的抗小鼠CD4抗體或抗小鼠CD8抗體與小鼠T淋巴細胞表面的相應CD分子結(jié)合，在熒光顯微鏡下計數(shù)熒光陽性細胞，從而確定T細胞亞群的百分率。檢測T細胞亞群的比值和百分率有助于了解機體的免疫狀態(tài)和某些疾病的輔助診斷以及T細胞在發(fā)病機制中的作用。主要試劑：1. 小鼠脾細胞：來源于昆明鼠，每室2只小鼠。2. 熒光素FITC標記的抗小鼠CD4抗體：0.25g/5x106/100l3

16、. 熒光素PE標記的抗小鼠CD8抗體： 0.5g/5x106/100l4. 冰凍載玻片、血球計數(shù)器、水平離心機、顯微鏡等。5. 無菌Hanks平衡鹽溶液6. 洗滌液和稀釋液：0.5BSAPBS。7. 1:1 PBS甘油8. 無菌細胞離心管分組：5人/組操作步驟：1. 每室取1只小鼠，選2人在實驗室中（有菌環(huán)境下）殺鼠取脾細胞，計數(shù)后將細胞分至每個小組。2. 脾細胞懸液的制備：將已采取血液的小鼠進行頸椎脫位，處死的小鼠置70%乙醇中浸泡5-7 min，采取小鼠脾臟置于含有Hanks液的平皿中，金屬網(wǎng)上研壓，收集小鼠脾細胞懸液于一無菌離心管中。3. 脾細胞的洗滌：加入Hanks使脾細胞懸液至6mL

17、，離心1200r/min、12min，一次性棄上清，彈起細胞沉淀后再加入Hanks液至6mL，混勻后離心1200r/min，12min，棄去上清。4細胞計數(shù)：用0.5BSA-PBS 恰當定容細胞至8mL，混勻后取0.1ml于另一小試管（注：不是無菌離心管），補加1.9ml白細胞稀釋液，在血細胞計數(shù)板上于低倍鏡計數(shù)5. 用0.5BSA-PBS 調(diào)整脾細胞濃度為5×106脾細胞/ml,每組得2 ml，分別加入2支玻璃小試管中（1ml/管），標記為A、B兩管，離心1200r/min,12min，棄上清，彈起細胞沉淀。6. 熒光抗體染色：（避光條件下進行）A管：加入PE標記的抗小鼠CD8抗體

18、100µl。B管：加入FITC標記的抗小鼠CD4抗體100µl。用微量移液器混勻細胞懸液，置冰箱40 min，期間將試管搖勻2次。7. 各管補加0.5BSA-PBS至3ml，離心1200r/min,12min，棄上清，再重復洗滌一次。8熒光顯微鏡的檢查：（暗室條件下進行）彈起各管細胞沉淀，每管加入50µl 甘油-PBS，用微量移液器輕輕吹打細胞，吸取50µl懸液滴至載玻片上，覆加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察（以組為單位，依次觀察）。結(jié)果判斷： 觀察熒光染色陽性細胞的特征。實驗四 ELISA測定特異性抗體原理： ELISA是一種將抗原抗體反應的特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)，與經(jīng)典的體液免疫方法相比較，ELISA具有高特異性、高敏感性、簡單快速等特點。主要試劑：1乙型肝炎病毒重組蛋白（HBsAg）2待檢血清：由實驗室提供。3已知陽性血清和陰性血清（已稀釋100倍）。4包被液：0.05M、pH9.6碳酸鹽緩沖液。5洗滌液：pH7.4 磷酸鹽吐溫緩沖液。6稀釋液：10% FCS-PBS。7底物液：含有TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。8終止液：2M