實(shí)驗(yàn)碘標(biāo)記物純化和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)碘標(biāo)記物純化和鑒定 內(nèi)容內(nèi)容 一、抗體滴度的確定二、碘化標(biāo)記物游離碘鑒定方法三、碘化標(biāo)記物放化純度一、抗體滴度的確定一、抗體滴度的確定通過本次實(shí)驗(yàn)了解設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法的思路及全過程通過本次實(shí)驗(yàn)了解設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法的思路及全過程1了解放射免疫分析系統(tǒng)中抗體滴度選擇了解放射免疫分析系統(tǒng)中抗體滴度選擇的方法，設(shè)計(jì)確定抗體滴度方法的實(shí)驗(yàn)的方法，設(shè)計(jì)確定抗體滴度方法的實(shí)驗(yàn)2掌握倍比稀釋的操作步驟掌握倍比稀釋的操作步驟3實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 濃縮抗血清用適當(dāng)緩沖液稀后，與定量的標(biāo)濃縮抗血清用適當(dāng)緩沖液稀后，與定量的標(biāo)記抗原反應(yīng)至平衡，分離結(jié)合部分，記抗原反應(yīng)至平衡，分離結(jié)合部分， 測(cè)不同稀釋度抗體

2、與標(biāo)記抗原結(jié)合率。測(cè)不同稀釋度抗體與標(biāo)記抗原結(jié)合率。 B/T=30-50%的抗體滴度為應(yīng)用抗體滴度。的抗體滴度為應(yīng)用抗體滴度。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑濃縮抗體125I-AbBSA緩沖液免疫分離劑T4AbT4Ag*實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1從第2管起每管加100ul緩沖液21號(hào)管家100ul抗體，2號(hào)管加入100ul抗體混勻3從2號(hào)管中取出100ul加入3號(hào)管，混勻后再取出100ul加到4號(hào)管，依此類推。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4每管加入100ul的Ag*混勻5在離心之前，取一管測(cè)總T637度水浴1小時(shí)，向各管中加入1000ul分離劑，3000轉(zhuǎn)/分鐘，分離15-20

3、分鐘 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟7測(cè)各管的cpm值實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果總T1:11:21:41:8cpm302541671814890115988208B/T(%)55.2649.2238.3427.131:161:321:641:128583840022436159819.3013.238.055.28 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖如圖所示如圖所示：B/T在在30%50%的相應(yīng)抗體稀釋度為的相應(yīng)抗體稀釋度為1：21：4 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、加量要準(zhǔn)確。、加量要準(zhǔn)確。2、用過的吸頭不要互相污染、用過的吸頭不要互相污染。3、離心時(shí)間要充足，離心前要加分離劑、離心時(shí)間要充足，離心前要加分離劑4、接觸標(biāo)

4、記物的器皿要單獨(dú)處理，防止放射性污染。、接觸標(biāo)記物的器皿要單獨(dú)處理，防止放射性污染。二、碘化標(biāo)記物游離碘鑒定方法二、碘化標(biāo)記物游離碘鑒定方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康母鶕?jù)評(píng)價(jià)標(biāo)記抗原質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)鑒根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)記抗原質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)鑒定標(biāo)記抗原方法的實(shí)驗(yàn)定標(biāo)記抗原方法的實(shí)驗(yàn)1通過本次實(shí)驗(yàn)了解為實(shí)現(xiàn)某一目的而通過本次實(shí)驗(yàn)了解為實(shí)現(xiàn)某一目的而設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法的思路及全過程設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法的思路及全過程 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 濃縮抗血清用適當(dāng)緩沖液稀釋后，與定量的標(biāo)記抗原反應(yīng)至平衡，分離結(jié)合部分，測(cè)不同稀釋度抗體與標(biāo)記抗原結(jié)合率。B/T=30-50%的抗體滴度為應(yīng)用抗體滴度。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)

5、步驟1取測(cè)量試管一只加入100ul125I標(biāo)記物，加入緩沖液0.5ml，測(cè)量其總放射性。2向上述溶液加入10%三氯乙酸10ml，混合后，在300r/min條件下，離心10min.3從2號(hào)管中取出100ul加入3號(hào)管，混勻后再取出100ul加到4號(hào)管，依此類推。實(shí)驗(yàn)結(jié)果并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果并計(jì)算總放射性總放射性 總放射性 沉淀物濃度 cpm 14910 11832計(jì)算公式：游離碘=1-沉淀物放射性cpm總放射性cpm100% =1-1183214910100% 20%15%碘化標(biāo)記物游離碘15%為合格此結(jié)果為不合格。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 不合格的原因可能是由于 樣品已過期; 時(shí)間過長(zhǎng)出現(xiàn)放射雜質(zhì)：

6、 脫落的放射性核素，因輻射損傷產(chǎn)生變性的標(biāo)記抗原），游離碘的放射性升高。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、加量要準(zhǔn)確。2、離心時(shí)間要足夠。3、將廢棄液的上清液倒入回收瓶中，不可隨意丟棄。三、三、125I碘化標(biāo)記物放化純度碘化標(biāo)記物放化純度 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理用紙層析法分離碘化標(biāo)記物的雜質(zhì)，用紙層析法分離碘化標(biāo)記物的雜質(zhì)，從而可以計(jì)算碘化蛋白部分所占比例，從而可以計(jì)算碘化蛋白部分所占比例，即為該標(biāo)記物的放化純度。即為該標(biāo)記物的放化純度。 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 將濾紙條浸于將濾紙條浸于1%KI溶液中過夜，次日取出晾干。溶液中過夜，次日取出晾干。 從無孔端用鉛筆以從無孔端用鉛筆以1cm等距離畫等距離畫

7、1012條線。條線。 在第一線出點(diǎn)樣在第一線出點(diǎn)樣510ul125I標(biāo)記物晾干。標(biāo)記物晾干。 將此濾紙條放入層析槽中，使末端浸于展開劑中約將此濾紙條放入層析槽中，使末端浸于展開劑中約5mm 2小時(shí)候取出紙條晾干，然后沿線剪開，分別放入相應(yīng)試小時(shí)候取出紙條晾干，然后沿線剪開，分別放入相應(yīng)試管中編號(hào)標(biāo)記。管中編號(hào)標(biāo)記。每管內(nèi)加入每管內(nèi)加入0.5mlH2O,并記錄數(shù)據(jù)及作圖。并記錄數(shù)據(jù)及作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果管號(hào)管號(hào)123456789101112總總ALBcpm3364921324860484890724272361476EPOcpm17462211723951485469305448514473下面將以管

8、號(hào)為橫坐標(biāo)，每管的cpm為縱坐標(biāo)作圖。ALBEPO實(shí)驗(yàn)計(jì)算及分析實(shí)驗(yàn)計(jì)算及分析如圖所示：ALB的放化純度=cpm1+cpm2+cpm3cpm總100% 65%EPO的放化純度=cpm1+cpm2+cpm3cpm總100% 90%分析： ALB放化純度90%可能原因?yàn)椋簩游鰰r(shí)間不足，未充分分離樣品過期，有雜值出現(xiàn)。 EPO放化純度=90%，結(jié)果較理想。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、點(diǎn)樣時(shí)要輕快，點(diǎn)樣面積要盡量小點(diǎn)樣時(shí)要輕快，點(diǎn)樣面積要盡量小2、各層析紙應(yīng)標(biāo)明點(diǎn)樣名稱及有效期、各層析紙應(yīng)標(biāo)明點(diǎn)樣名稱及有效期3、層析時(shí)間要充分，需、層析時(shí)間要充分，需1.5小時(shí)或以上小時(shí)或以上4、展開時(shí)，標(biāo)記物切勿侵入展開劑中

9、、展開時(shí)，標(biāo)記物切勿侵入展開劑中凝膠過濾法凝膠過濾法l葡聚糖凝膠過濾法l瓊脂糖凝膠過濾法l聚丙烯酰胺過濾法分類示意圖 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：l根據(jù)抗原分子量選擇凝膠和層析柱根據(jù)抗原分子量選擇凝膠和層析柱l層析柱要新鮮制備層析柱要新鮮制備l選擇合適的洗脫液，洗脫速度不超過選擇合適的洗脫液，洗脫速度不超過0.5ml/分分l多數(shù)標(biāo)記抗原在分離純化前先用蛋白（多數(shù)標(biāo)記抗原在分離純化前先用蛋白（BSA或或RSA）保護(hù)）保護(hù)l洗脫液用部分收集器收集，所用的試管應(yīng)先用蛋白處理洗脫液用部分收集器收集，所用的試管應(yīng)先用蛋白處理l有時(shí)須經(jīng)兩次純化，得到高質(zhì)量的碘化標(biāo)記物有時(shí)須經(jīng)兩次純化，得到高質(zhì)量的碘化標(biāo)記物125I

10、-標(biāo)記物柱層析分離純化示意圖 .損傷和聚合標(biāo)記物 .125I標(biāo)記物標(biāo)記物 .游離125I- 離子交換層析法離子交換層析法離子交換層析利用蛋白質(zhì)帶電部分離子交換層析利用蛋白質(zhì)帶電部分, ,與具有相反電荷的離子交換吸附與具有相反電荷的離子交換吸附以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法 。在碘標(biāo)記物的純化中在碘標(biāo)記物的純化中以蛋白質(zhì)為例，利用蛋白質(zhì)帶電部分，與具有相反電荷的離子交換吸附，進(jìn)行分離。陰離子交換劑可與蛋白質(zhì)的-COO 交換吸附。陽(yáng)離子交換劑可與蛋白質(zhì)-NH3+ 交換。本法多適用于純化短肽類標(biāo)記本法多適用于純

11、化短肽類標(biāo)記物。物。薄層層析法薄層層析法用硅膠G或氧化鋁鋪板，然后活化。將碘化反應(yīng)液在薄板上點(diǎn)樣，并用適當(dāng)?shù)恼归_劑展開。最后分段取下，分別用適當(dāng)?shù)木彌_液溶解，收集碘化蛋白峰即為純化的碘標(biāo)記物。本法多適用于半抗原碘標(biāo)記物的純化，本法多適用于半抗原碘標(biāo)記物的純化，如甾體碘標(biāo)記物和地高辛碘標(biāo)記物。電泳法電泳法根據(jù)化合物分子所帶電荷及半徑不同，其在電場(chǎng)中分子的遷移率也不同的原理，用電泳的方法可以進(jìn)行純化分離。這種方法主要用于對(duì)碘化物純度的鑒定，這種方法主要用于對(duì)碘化物純度的鑒定，很少用于碘標(biāo)記物的制備。很少用于碘標(biāo)記物的制備。高壓液相法（高壓液相法（HPLCHPLC）與凝膠過濾法的原理基本相同分離效率

12、高、速度快、適用范圍廣、可獲得較純的碘標(biāo)記物但 需 要 一 定 的 設(shè) 備 條 件 ， 未 能 廣 泛 應(yīng) 用關(guān)鍵:選取合適的流動(dòng)相與固定相放化純度的鑒定放化純度的鑒定1.層析法層析法:有薄層層析法和紙層析法，紙層析法最為常用有薄層層析法和紙層析法，紙層析法最為常用（1）將濾紙浸于）將濾紙浸于1%KI溶液中過夜備用溶液中過夜備用（2）使用前要將濾紙吹干）使用前要將濾紙吹干 ，并按每，并按每1cm距離用鉛筆標(biāo)出距離用鉛筆標(biāo)出（3）將待鑒定的標(biāo)記物）將待鑒定的標(biāo)記物5l-10l點(diǎn)樣于距端點(diǎn)點(diǎn)樣于距端點(diǎn)1cm處，晾干處，晾干（4）將已點(diǎn)樣的濾紙條放入層析缸內(nèi)，然后加展開劑）將已點(diǎn)樣的濾紙條放入層析缸

13、內(nèi)，然后加展開劑 正丁醇正丁醇:乙醇乙醇:氨水氨水:水水=20:1:0.5:1（5）展開后將濾紙取出并吹干，然后按每）展開后將濾紙取出并吹干，然后按每1cm距離剪開，并分段進(jìn)行距離剪開，并分段進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)。 以每段的以每段的cpm為縱坐標(biāo)，分段紙條的序號(hào)為橫坐標(biāo)作圖。近原點(diǎn)為縱坐標(biāo)，分段紙條的序號(hào)為橫坐標(biāo)作圖。近原點(diǎn)的第一峰為的第一峰為 標(biāo)記蛋白峰。標(biāo)記蛋白峰。 （6）計(jì)算放化純度）計(jì)算放化純度放化純度（放化純度（%）=蛋白峰放射強(qiáng)度蛋白峰放射強(qiáng)度/總放射強(qiáng)度總放射強(qiáng)度100%2.電泳法：常用的是紙電泳法操作與紙層析法相同，點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳而不是層析。3.游離碘的測(cè)定：蛋白類碘化標(biāo)記物可用三氯乙酸沉淀法。取1000020000cpm的標(biāo)記物，并計(jì)數(shù)。然后加20%三氯乙酸1ml及2%BSA溶液0.5ml，混勻后3000rpm離心10分鐘，棄上清并計(jì)數(shù)沉淀的放射活性。游離碘率（%）=1-沉淀cpm數(shù)/總cpm數(shù)100%純化過的碘標(biāo)記物的游離碘率不應(yīng)該超過5%10%4.抗體結(jié)合鑒定法：將標(biāo)記抗原與過量的抗體反應(yīng)，其NSB/T應(yīng)5%，B0/T應(yīng)80%。非特異性結(jié)合（NSB）增加，而最大結(jié)合力（B0/T）下降，則說明標(biāo)記物的純度差。免疫活性的測(cè)定免疫活性的測(cè)定1.過量抗體法 Ag* + Ab（過量） NSB/T80% 如果NSB增加，最大結(jié)合力降低，表