甲霜靈膠體金競爭法試紙

1、1甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制 2005.12.8 2一、前言 農(nóng)藥甲霜靈簡介 最高殘留限量標準 檢測方法的建立 分課題進展情況簡單匯報31.農(nóng)藥甲霜靈簡介 農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。 據(jù)中國農(nóng)藥毒性分級標準，屬低毒殺菌劑。 對卵菌引起的病害具有獨特的保護和治療作用。42.最大殘留限量標準 聯(lián)合國FAO/WHO食品法委員會（CCPR）關于食品和飼料中農(nóng)藥最高殘留限量的規(guī)定中規(guī)定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量

2、為0.0510-6 。 中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標準化管理委員會于2005年1月25日發(fā)布，自2005年10月1日起實施中華人民共和國國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量標準（GB 2763-2005），該標準中規(guī)定了農(nóng)藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。 5中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準標準種類 最高殘留限量（MRL），mg/kg 國家標準號 谷子0.05GB2763-2005 黃瓜0.5GB2763-2005 葡萄1GB2763-2005 63.檢測方法建立 甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測困難。Krause在原有檢測基

3、礎上進行改進，將高效液相色譜法（HPLC）應用于食物樣本檢測中，此方法普遍用于檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對樣品中的農(nóng)藥進行定性和定量分析，但此法要求精密復雜的儀器，而且需要專業(yè)人員操作，不適合于大批量樣品的檢測。 7 膠體金免疫層析診斷技術是在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術，具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員操作等特點，真正達到復雜原理與簡易操作的統(tǒng)一；同時具有保存方便，有效期長等特點。 與氣相色譜法補充使用，具有靈敏度高、操作簡便、檢測迅速等特點。8主要技術路線94.分課題情況簡單匯報 擬解

4、決的關鍵技術： 小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對單克隆抗體的制備及膠體金研究。 10 課題完成情況及效果課題完成情況及效果 ： 本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進行免疫獲得單克隆抗體N2B1 4E6C10,這一針對甲霜靈抗原決定簇配對的單克隆抗體，親和力好，效價達到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測試紙，應用競爭法膠體金檢測試紙最低檢出量可達0.3mg/kg，達到國標要求。通過比對試驗的驗證，相關系數(shù)r=0.99996，說明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農(nóng)藥、獸藥殘留限量快速檢測技術中，是最有效、最快速、最簡便的方法。其優(yōu)點在于靈敏度高、特異性強、操作簡便、快

5、速、常溫儲存等，是適合于現(xiàn)場檢測的一種快速檢測方法，是食品安全檢測的一種手段，互補現(xiàn)有檢測方法各自的優(yōu)缺點。 11二、試驗研究內(nèi)容 免疫原合成 抗體制備 膠體金研究 半成品研制及鑒定 成品研制121.免疫原合成 半抗原合成 免疫原合成 免疫原的鑒定 小結(jié)13（1）半抗原合成 將1.6g NaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50下攪拌6h，用TLC檢測，反應完全；用乙酸乙酯洗滌反應液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0左右，析出白色物質(zhì)；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾酯相，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到白色固體物質(zhì)；用正己烷和乙酸乙酯重結(jié)晶，抽濾后得

6、到半抗原N2（甲霜靈酸） 。14（2）免疫原合成 稱取0.265g甲霜靈酸，用8mL DMF溶解，加入0.258 g DCC和0.125g NHS；用TLC監(jiān)測反應完全程度，待反應完全后，抽濾反應液，用DMF洗滌兩遍；稱取2g BSA，用200mL 0.2mol/L pH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫攪拌過夜，得到甲霜靈免疫原N2B。 先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20下冷凍干燥，凍干后分裝保存。 同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測原（N2 A）。 15（

7、3）免疫原的鑒定 紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.209 ABS；BSA在278.0nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.083 ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上 。16 瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測原（N2A）均出現(xiàn)反應沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產(chǎn)生可見的沉淀線。這說明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應，雖然與甲霜靈發(fā)生交叉反應（理論上推測），但不形

8、成可見的沉淀線。DADT檢測結(jié)果表明，N2B合成成功，即N2與BSA間通過化學鍵結(jié)合 。17（4）小結(jié) 本試驗通過化學合成法進行甲霜靈免疫原的制備，利用甲霜靈酸結(jié)構(gòu)中的羧基，在適當?shù)呐悸?lián)劑作用下將其連接到載體蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通過紫外檢測法、動物免疫試驗對甲霜靈免疫原進行鑒定，證實免疫原合成成功。 182.抗體制備 單克隆抗體制備 多克隆抗體制備19（1）單克隆抗體制備 單克隆抗體制備流程 單克隆抗體特性鑒定 小結(jié)20單克隆抗體制備流程21 用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無菌條件下取免疫小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA間接法從產(chǎn)生的

9、267株陽性雜交瘤中，篩選出對甲霜靈抗原呈陽性反應的雜交瘤11株，注射小鼠185只，制備腹水419mL，純化得到275.8mg抗體。結(jié)果表明：我們成功獲得了能識別甲霜靈抗原決定簇的雜交瘤細胞株：N2B1 4E6C10。22單克隆抗體鑒定 抗體的純度鑒定 從圖中可以看出N2B1 4E6C10在電泳中呈現(xiàn)1條帶，純度大于95%，同時這株抗體分子量與97.4KD蛋白標準品相近。 23 間接ELISA法檢測抗體活性 從左圖可以看出，當 抗 原 濃 度 為0.32ng/mL時，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。24 間接ELISA法抗體特異性檢測 由左圖可以看出甲霜靈單抗只針對甲霜靈抗原

10、特異，與其它無關抗原不發(fā)生反應，具有較好的特異性。 25 抗體親和力的鑒定 親和力： N2B00.20.40.60.811.21.4-5-4-3-2-10Ag:1ug/mLAg:0.5ug/mLAg:0.25ug/mL26單抗測得三個Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值標準差變異系數(shù)（%）N2B1 4E6C107.41109（6.720.507）1097.50%6.201096.56109N2B1 4E6C10抗體親和力表 27 用甲霜靈抗原包被直接篩選，結(jié)果顯示：N2B1 4E6C10能識別甲霜靈抗原決定簇；經(jīng)Protein A柱直接純化，亞類為IgG1的這株抗體純度達到95%以上；

11、抗體親和力常數(shù)（6.720.507）109，可以滿足用于制備檢測試紙的檢測線。 小結(jié)28（2）多克隆抗體制備 基本制備過程 多克隆抗體活性鑒定 小結(jié)29過程：動物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定30500g1000g31.25ggg31.25g gggggg1000g500g62.5g125g250g62.5g125g250g0.5mg/mL1mg/mL從左圖可以看出，此羊抗屬IgG抗體稀釋濃度在31.25g/mL時清晰可見沉淀線，判定此抗體活性合格。 多克隆抗體活性鑒定31 羊抗鼠多克隆抗體，經(jīng)活性鑒定合格，可以滿足用于制備檢測試紙的控制線。小結(jié)323.膠體金研究 經(jīng)過電鏡結(jié)果分析（同甲萘威）

12、，我們可以得出：膠體金顆粒直徑在2030nm之間時，顆粒大小均勻、無聚合與沉淀現(xiàn)象，且靈敏度高，為最佳狀態(tài)。此時與抗體的結(jié)合量為612mg，氯金酸與檸檬酸三鈉溶液的配比為30mL/1820mL。334.半成品研制及鑒定 原理 膠體金檢測試紙條的制作工藝流程 半成品調(diào)試 半成品鑒定 小結(jié)34 在硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)包被甲霜靈合成免疫原，對照區(qū)包被羊抗鼠多克隆抗體。當待測物中有被測的抗原物質(zhì)（即甲霜靈）時，待測物中的抗原物質(zhì)就會與標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體形成Ag-Ab-Au復合物，復合物不與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，僅會在控制線處出現(xiàn)一條色帶（C線），結(jié)果為陽性，說明被檢測

13、的樣品中農(nóng)藥甲霜靈超標。當待測物質(zhì)中沒有被測的抗原物質(zhì)時，標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體就會與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結(jié)合，形成Ag-Ab-Au復合物，此時檢測線處可看到一條明顯色帶（T線），因此當檢測試紙上可看到兩條線（C線和T線）時，結(jié)果為陰性，說明被檢測的樣品中農(nóng)藥甲霜靈未超標。原理35膠體金檢測試紙條制作工藝流程36調(diào)試日期數(shù)量測試結(jié)果結(jié)果分析解決方法備注水標準品05.4.108條陰性無梯度，檢測1mg/mL和檢測水的顏色一樣。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.118條陰性檢測限100g/mL，敏感度低。1.膠體

14、金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.128條陰性檢測限1g/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.138條無反應線1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣15個05.4.148條反應線淺檢測限10ng/mL1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣10個05.4.178條陰性檢測限500ng/mL，敏感度低膠體金濃度高降低膠體金的濃度檢測不同濃度的小樣4個05.4.198條陰性檢測

15、限300ng/mL。結(jié)果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產(chǎn)試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性檢測陽性參考品達300ng/mL結(jié)果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產(chǎn)試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性與其它農(nóng)藥均無交叉結(jié)果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產(chǎn)試紙條進行半成品的鑒定甲霜靈競爭法試紙條半成品靈敏度調(diào)試甲霜靈競爭法試紙條半成品靈敏度調(diào)試 37 敏感性鑒定 取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng

16、/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區(qū)和控制區(qū)均可見一條色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽性。 半成品鑒定38圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300 ng/mL、500ng/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品的檢測結(jié)果。結(jié)果分析： 甲霜靈競爭法試紙條敏感度可達到300ng/mL；檢測標準品有梯度變化，靈敏度高，批間

17、差小，性能穩(wěn)定。 39 陽性參考品符合率鑒定 取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1g/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性 。40圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1g/mL甲霜靈標準品的檢測結(jié)果。 結(jié)果分析：甲霜靈競爭法試紙條性能穩(wěn)定，特異性好。 41 特異性鑒定 取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津樣品中，

18、5分鐘內(nèi)各試紙條在檢測區(qū)和控制區(qū)均可見一條色帶，為陰性 。42圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津的檢測結(jié)果。 結(jié)果分析甲霜靈競爭法試紙條與濃度均為100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津常用農(nóng)藥均無交叉反應，特異性好。 43 精密度鑒定 取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入300ng/mL的甲霜靈標準品中，同批次、不同批次各平行檢測10條，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見一條紅色的控制線，為

19、陽性 。44每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標準品的檢測結(jié)果。 結(jié)果分析：甲霜靈競爭法試紙性能穩(wěn)定；可重復性好。 45 穩(wěn)定性鑒定 膠體金檢測試紙條37放置20天穩(wěn)定性試驗 膠體金檢測試紙條430放置6個月穩(wěn)定性試驗 46膠體金檢測試紙條37放置20天穩(wěn)定性試驗 取甲霜靈競爭法試紙條保存在37放置20天，對產(chǎn)品每隔3天進行敏感性、陽性參考品符合率、特異性檢測。 敏感性：取保存在37的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50 ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品中進行敏感性試驗，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見一條

20、紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區(qū)和控制區(qū)均可見色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽性。 4737條件下甲霜靈競爭法試紙條敏感度檢測條件下甲霜靈競爭法試紙條敏感度檢測 日期（天） 批號0504240504280505100505170505250505283300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL6300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/

21、mL9300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL12300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL15300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL18300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL21300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL48 陽性參考品符合率：取保存在37的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在濃度為300 ng/mL、500n

22、g/mL、800ng/mL 、1g/mL甲霜靈標準品中，進行陽性參考品符合率試驗；5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。 49日期（天） 批號05042405042805051005051705052505052836912151821 37條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測 50 特異性：取保存在37的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進行特異性試驗，5分鐘內(nèi)各批次試紙條在控制區(qū)和檢測區(qū)均可見一條色帶，為陰

23、性。 51日期（天） 批號05042405042805051005051705052505052836912151821 37 37條件下甲霜靈競爭法試紙條特異性檢測條件下甲霜靈競爭法試紙條特異性檢測52 結(jié)果分析 甲霜靈競爭法試紙條在37放置20天后，其敏感度仍可達到300ng/mL；批間差小，性能穩(wěn)定；與100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農(nóng)藥樣品均無交叉反應，特異性好。53膠體金檢測試紙條430放置6個月穩(wěn)定性試驗 將甲霜靈競爭法膠體金試紙條保存在430放置6個月，對產(chǎn)品每隔3個月進行敏感性

24、、陽性參考品符合率、特異性檢測。 取保存在430的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1g/mL、2g/mL甲霜靈標準品中進行敏感性試驗，5分鐘內(nèi)各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區(qū)和控制區(qū)均可見色帶，為陰性；而甲霜靈標準品300ng/mL、500 ng/mL、1g/mL、2g/mL僅在控制區(qū)出現(xiàn)一條色帶，為陽性。 54 取保存在430的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為300 ng/mL、500ng/mL、800ng/

25、mL、1g/mL甲霜靈標準品中進行陽性參考品符合率試驗，5分鐘內(nèi)各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。 取保存在430的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100g/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進行特異性試驗，5分鐘內(nèi)各批次試紙條在控制區(qū)和檢測區(qū)均可見一條色帶，為陰性。 55批號 項目敏感性陽性參考品特異性050510300ng/mL，300ng/mL050514300ng/mL，300ng/mL050518300ng/mL，300ng/mL4 43030條件下放置條件下放置3 3個月競爭法試紙條檢測個月競