抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則規(guī)范

1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則一、基本原則1.抗腫瘤藥物分類(1)細(xì)胞毒類藥物(cytotoxicagent):包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等；(2)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier)；(3)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑(resistancereersalagent);(4)腫瘤治療增敏劑(oncotherapysensitizer);(5)腫瘤血管生成抑制劑(tumorangiogenesisinhibitor);分化誘導(dǎo)齊U(differentiationinducingagent);(7)生長因子抑制劑(growthfactorinhib

2、itor);反義寡核甘酸(antisenseoligonucleotide)。2.抗腫瘤藥物藥效學(xué)需研究內(nèi)容2.1 包括體外抗腫瘤試驗(yàn)，體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。2.2 評價(jià)藥物的抗癌活性時(shí)，以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主，同時(shí)參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。2.3 I類抗腫瘤新藥應(yīng)進(jìn)行藥物作用機(jī)制初步研究。二、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)1 .試驗(yàn)?zāi)康?.1 對候選化合物進(jìn)行初步篩選；1.2 了解候選化合物的抗瘤譜；1.3 為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等。2 .試驗(yàn)方法選用10-15株人癌細(xì)胞株，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)；推薦使用四氮唾鹽MTT還

3、原法、XTT還原法、磺酰羅丹明B(SR染色法、或51Cr釋放試驗(yàn)、集落形成法等測定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間一般為48-72小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。3 .評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以同一樣品不同濃度對腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng)曲線，然后采用Logit法計(jì)算半數(shù)有效濃度(IC50值或EC50值)。體外試驗(yàn)至少重復(fù)一次。附注：評價(jià)藥物抗癌活性的方法：1 .MTT還原法1.1 基本原理：是一種能接受氫MTT轉(zhuǎn)化成不溶(DMSO)溶密|甲四氮口坐MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)

4、-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的性的藍(lán)紫色的甲月替(formazan),而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷月替后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。1.2 操作步驟：1.2.1 選用對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成5000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種2001,37C,5%CO2培養(yǎng)24h。1.2.2 實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)35平行孔，37C,

5、5%CO2培養(yǎng)45d。1.2.3 棄去上清液，每孔加入200科新鮮配制的含0.2mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基.37C繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200科1DMSO,用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為570nm,參比波長為450nm測定光密度值。1.3 結(jié)果評定：按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率%=（1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對照）100%以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC5010科m1或植物粗提物的IC50125%時(shí)。視為有效，反之則無效。4.2 裸鼠移植瘤模型推薦

6、使用測量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周2-3次，每次測量同時(shí)還需稱鼠重。腫瘤體積(tumorolume,T)的計(jì)算公式為：=1/2淚xb2或兀/6xaxbxc其中a、b、c分別表示長寬高。兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一公式。根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算出相對腫瘤體積(relatietumorolume,RT),RT=t/0。其中0為分籠給藥時(shí)(即d0)測量所得腫瘤體積，t為每一次測量時(shí)的腫瘤體積?？鼓[瘤活性評價(jià)指標(biāo)為相對腫瘤增殖率T/C(%)TRTT/C%=X0%0CRTTRT:治療組RT;CRT:陰性對照組RT。療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：T/C%60%

7、為無效；T/C%60%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P0.05為有效。4.3 小鼠腫瘤模型生長較慢小鼠腫瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價(jià)方法。生長較快小鼠腫瘤可采用稱瘤重的方法評價(jià)。試驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重小于1克，或20%腫瘤重量小于400毫克，表示腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。療效評價(jià)公式：給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重腫瘤生長抑制率=X100%陰性對照組平均瘤重評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤生長抑制率40%為無效；腫瘤生長抑制率40%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P50%(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：可在光學(xué)顯微鏡與電鏡下觀察候選化合物作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，對照組的早幼粒細(xì)胞應(yīng)90%-

8、95%，候選化合物組細(xì)胞分化，成熟粒細(xì)胞占比例越高，說明該化合物的分化效果越好。5.1.2 實(shí)體瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)常用細(xì)胞株：人肝癌HepG2、SMMC7721試驗(yàn)方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：主要測定細(xì)胞的甲胎蛋白（AFP）、白蛋白含量，r谷氨酸轉(zhuǎn)移酶（tGT）、酪氨酸車t氨酶（TAT）活性及觀察細(xì)胞形態(tài)。分化細(xì)胞AFP含量、TAT和GT活性明顯降低，白蛋白含量增加，細(xì)胞胞質(zhì)增加、核縮小。5.2 體內(nèi)試驗(yàn)常用人癌細(xì)胞小鼠腎囊膜下移植試驗(yàn)、小鼠髓單核細(xì)胞白血病試驗(yàn)和人癌細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型等。可選兩種模型，根據(jù)腫瘤鼠生存時(shí)間、腫瘤的體積及形態(tài)變化，觀察分化誘導(dǎo)效果。重復(fù)試驗(yàn)一次。6 .腫瘤治療增敏劑增敏劑主要是指放射治療增敏劑，能增加臨床上惡性腫瘤放射治療或其它治療的療效及降低治療后的復(fù)發(fā)率。6.1 體外試驗(yàn)分別選擇對放射、化療藥物具有中、低度敏感的人腫瘤細(xì)胞株，采用MTT、SRB或細(xì)胞集落形成方法進(jìn)行化合物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以IC50值作為評價(jià)指標(biāo)。