免疫沉淀類實驗

1、免疫沉淀類實驗南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心 教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生 實驗課時：實驗課時：6 6學時學時 課程類型：專業(yè)實驗課課程類型：專業(yè)實驗課 課程要求：必修課程要求：必修 每組人數：每組人數：2 2人人實驗目的與要求掌握單向瓊脂擴散試驗、雙向瓊脂擴散試驗、對流免疫電泳的原理、結果分析及應用； 熟悉火箭免疫電泳、免疫電泳的原理及應用。 實驗內容實驗內容單向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗對流免疫電泳對流免疫電泳示教：示教：火箭免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫電泳一

2、、單向瓊脂擴散試驗 實驗原理實驗原理： 將適量的抗體均勻混入瓊脂內制成瓊脂板，打孔，在孔中加入一定量的待測抗原，抗原向四周呈輻射狀擴散，與抗體相遇，在比例合適時形成白色沉淀環(huán)沉淀環(huán)直徑的大小與抗原含量成正比，可從用不同濃度標準抗原制成的標準曲線上，查出待檢樣品中抗原的含量。 一、單向瓊脂擴散試驗一、單向瓊脂擴散試驗 試劑與器材試劑與器材 商品IgG、IgM、IgA單向瓊脂擴散板； 37恒溫箱、濕盒、可調微量加樣器等； 待檢血清。 方法方法 分別取商品IgG、IgM、IgA單向瓊脂擴散板1塊，按說明書操作。 用微量加樣器分別準確吸取不同稀釋度待測血清10mL加于孔內。 將瓊脂板放入濕盒中，置于3

3、7恒溫箱擴散24小時。一、單向瓊脂擴散試驗一、單向瓊脂擴散試驗 注意事項：注意事項：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結果不好觀察；實際檢測過程中，標準曲線必須與樣品測定同時制備。一、單向瓊脂擴散試驗一、單向瓊脂擴散試驗n 結果觀察結果觀察分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，從相應說明書提供的參考標準曲線，計算待檢血清中各種免疫球蛋白的含量。二、雙向瓊脂擴散試驗二、雙向瓊脂擴散試驗n 實驗原理實驗原理：在含有電解質的瓊脂中，抗原抗體分子互相彌漫擴散，當比例合適時可出現肉眼可見的白色沉淀線。沉淀線的形狀、位置，與抗原的濃度、擴散速度相關。 二、雙向瓊脂擴散試驗二、雙向瓊脂擴散試驗 試劑與器材 含

4、15g/L生理鹽水的瓊脂糖 待檢血清、抗人血清 載玻片、濕盒、吸管、打孔器、37恒溫箱、可調微量加樣器等n方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理鹽水的瓊脂糖，于一潔凈的載 玻片；打孔：打孔：待瓊脂板凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，每孔之間的距離約4 5mm，根據需要，可打成呈梅花狀、三角狀的孔；加樣：加樣：用可調微量加樣器根據需要在不同孔內加入待檢血清和抗人血清10mL；擴散：擴散：將瓊脂糖凝膠板放濕盒中，置37溫箱中24h后，取出觀察結果。二、雙向瓊脂擴散試驗二、雙向瓊脂擴散試驗 注意事項：注意事項：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結果不好觀察；制板時，玻片要清潔

5、，邊緣要整齊，加瓊脂糖時要避免產生氣泡；打孔時注意避免產生裂縫或將瓊脂與玻片脫離。二、雙向瓊脂擴散試驗二、雙向瓊脂擴散試驗結果觀察：結果觀察：沉淀線的位置、數目與形狀等。圖4 抗原特異性與沉淀線形狀的關系a、b：抗體 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳建立在雙向瓊脂擴散試驗的基礎上，通過電流，使建立在雙向瓊脂擴散試驗的基礎上，通過電流，使蛋白質抗原、抗體在電場中作定向加速度雙擴散，蛋白質抗原、抗體在電場中作定向加速度雙擴散，從而加速沉淀的形成。從而加速沉淀的形成。 n 實驗原理實驗原理：在一定的離子強度、pH8.4以上的緩沖液中，大多數抗原解離帶負電

6、，在電場中向陽極移動，而抗體大部分是IgG，其等電點與環(huán)境中的pH接近，很少解離。另外，由于分子量大，加上電滲作用緩慢向陰極移動，在短時間內，在兩孔之間或抗體另一側形成沉淀線。 三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳 試劑與器材試劑與器材1.5%巴比妥緩沖液瓊脂糖 待檢血清、抗人血清 0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液 載玻片、吸管、打孔器、可調微量加樣器、電泳儀、電泳槽等n方法方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理鹽水的瓊脂糖，于一潔凈 的載玻片；打孔：打孔：待瓊脂板凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，每孔之間的距離約 45mm，根據需要，可打成呈梅花狀、三角狀的孔；加樣：

7、加樣：在孔中相向加入10mL抗原和抗體 ；電泳：電泳：將抗原置于陰極側，抗體置于陰極側， 以4V/cm電壓電泳30min1h。 三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳結果觀察：結果觀察：關閉電源，打開電泳槽，觀察沉淀線的位置、數目與形狀等。注意事項：注意事項：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結果不好觀察；制板時，玻片要清潔，邊緣要整齊，加瓊脂糖時要避免產生氣泡；孔距約0.5cm左右，太遠看不到實驗現象。三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳示示 教教火箭免疫電泳火箭免疫電泳 將適量的抗體均勻混入瓊脂內制成瓊脂板，冷凝后，在瓊脂板的一端打一排小孔，分別加入一定量的待測樣品進行電泳?？乖陔娪具^程中，與抗體相遇，在比例合適時可形成錐形沉淀峰，其形狀如火箭，故名火箭電泳?；鸺宓母叨扰c抗原含量成正比，以峰高為縱坐標，已知的抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線圖，就可知待檢樣品中抗原的含量。示示 教教免疫電泳：免疫電泳： 免疫電泳技術是利用蛋白質分子