酶與蛋白質(zhì)工程第4章基因表達(dá)與蛋白質(zhì)分離純化

1、第四講第四講 基因表達(dá)與蛋白質(zhì)分離純化基因表達(dá)與蛋白質(zhì)分離純化 蛋白質(zhì)異源表達(dá)的關(guān)鍵問題就是發(fā)展克隆基因蛋白質(zhì)異源表達(dá)的關(guān)鍵問題就是發(fā)展克隆基因的表達(dá)方法，即找到的表達(dá)方法，即找到理想的宿主表達(dá)系統(tǒng)理想的宿主表達(dá)系統(tǒng) 目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，這些表達(dá)系系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，這些表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系原核體系原核體系 大腸桿菌大腸桿菌 (Escherichia coli) 遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)

2、效率高； 基本不分泌，易形成包涵體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))，無加糖等修飾 枯草桿菌枯草桿菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，一般有天然立體結(jié)構(gòu)； 無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn) 定，尚無商品化的表達(dá)載體 其它其它 乳酸菌乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙門氏菌沙門氏菌 (Salmonella typhimurium) 蘇云金桿菌蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系真核體系真核體系 酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞 可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天然立體結(jié)構(gòu)，有加糖修飾功能；可進(jìn)行染色

3、體整合型基因表 達(dá);商品化表達(dá)體系：釀酒酵母、畢氏酵母、裂殖酵母 糖鏈與哺乳動(dòng)物加工的不一致，培養(yǎng)上清多糖濃度高 昆蟲細(xì)胞昆蟲細(xì)胞 可以病毒感染的形式在成蟲中生產(chǎn)，也可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白;適合分泌型和膜 蛋白的表達(dá)，有加糖修飾； 糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限 哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞/ /組織組織 可進(jìn)行分泌表達(dá)，有天然立體結(jié)構(gòu)，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致； 表達(dá)量不夠高，培養(yǎng)成本較高 植物細(xì)胞植物細(xì)胞/ /組織組織 植物可大面積種植，可以廉價(jià)大規(guī)模生產(chǎn)； 轉(zhuǎn)基因植物制作費(fèi)時(shí)，表達(dá)的組織特異性較難控制；表達(dá)量較難提高，分離純化不便基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系體系選擇體系選擇 研究基因功能研究基

4、因功能 大腸桿菌、裂殖酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 多肽藥物生產(chǎn)多肽藥物生產(chǎn) 大腸桿菌、畢氏酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織 疫苗疫苗 大腸桿菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞組織 單抗生產(chǎn)單抗生產(chǎn) 雜交瘤細(xì)胞 工業(yè)酶生產(chǎn)工業(yè)酶生產(chǎn) 各種微生物 Escherichia coliE.coli常與一些食源性疾病有關(guān)，但從人體腸道內(nèi)分離出來的兩種命常與一些食源性疾病有關(guān)，但從人體腸道內(nèi)分離出來的兩種命名為名為K-12和和B的良性大腸桿菌菌株卻是兩種重要實(shí)驗(yàn)用菌株。的良性大腸桿菌菌株卻是兩種重要實(shí)驗(yàn)用菌株。大腸桿大腸桿菌菌K-12的基因組的測(cè)序工作已于的基因組的測(cè)序工作已于1997年完成。年完成。大腸桿菌大腸桿菌B菌株自菌株

5、自1918年被分離出來后，在年被分離出來后，在1959年被分離為兩類實(shí)驗(yàn)用菌株：年被分離為兩類實(shí)驗(yàn)用菌株：REL606和和BL21(DE3)，后者在醫(yī)學(xué)和工業(yè)上用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，后者在醫(yī)學(xué)和工業(yè)上用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)由美國、韓國和法國的科學(xué)家組成的研究小組完成了對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)室常由美國、韓國和法國的科學(xué)家組成的研究小組完成了對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌用的大腸桿菌(E.coli)菌株基因組的測(cè)序工作，發(fā)表在菌株基因組的測(cè)序工作，發(fā)表在Journal of Molecular Biology (2009)基因組大小基因組大小4.6M bp基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)方法簡單、增殖快、生產(chǎn)成本低，細(xì)

6、菌表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)方法簡單、增殖快、生產(chǎn)成本低，是是目前廣目前廣泛應(yīng)用的外源基因表達(dá)體系泛應(yīng)用的外源基因表達(dá)體系。但缺乏真核細(xì)胞特有的但缺乏真核細(xì)胞特有的加工處理加工處理，外，外源蛋白大量表達(dá)源蛋白大量表達(dá)容易形成包涵體容易形成包涵體，而且在菌體中表達(dá)的外源蛋白，而且在菌體中表達(dá)的外源蛋白，在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，易被菌體蛋白酶破壞易被菌體蛋白酶破壞TrxtagHistagthrombinSTagenterokinase目標(biāo)蛋白目標(biāo)蛋白硫氧還蛋白標(biāo)簽硫氧還蛋白標(biāo)簽?zāi)改改c激酶腸激酶基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)載體分類載體分類

7、 克隆載體克隆載體：攜帶插入外源片段的質(zhì)?；蚴删w：攜帶插入外源片段的質(zhì)?；蚴删w 表達(dá)載體表達(dá)載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、終止子等），使目的基因能夠表達(dá)的元件（如啟動(dòng)子、終止子等），使目的基因能夠表達(dá)的載體載體基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系（）復(fù)制起始點(diǎn)（）復(fù)制起始點(diǎn)（）選擇性基因（一般為抗生素抗性基因）（）選擇性基因（一般為抗生素抗性基因）（）強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子（）強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子（）強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列（）強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列（）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（）合適的多克隆位點(diǎn)（）合適的多克隆位點(diǎn)表達(dá)載體包括的成分表達(dá)載

8、體包括的成分基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)載體分類大腸桿菌表達(dá)載體分類按蛋白質(zhì)類型分：按蛋白質(zhì)類型分：單純表達(dá): 如pJLA系列融合表達(dá): 融合各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表達(dá): pel/ompT分泌肽按啟動(dòng)子分：按啟動(dòng)子分：lac及衍生的tac, trc, pac, rac等啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo)lamda phage PL和PR 啟動(dòng)子 熱誘導(dǎo)T7 啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo)T5 啟動(dòng)子 IPTG誘導(dǎo)ara啟動(dòng)子 阿拉伯糖誘導(dǎo) 基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系常用表達(dá)載體常用表達(dá)載體pET系列系列 (T7 promoter, Novage

9、n公司公司)pQE系列系列 (T5 promoter, Qiagen公司公司)pMAL系列系列 (周質(zhì)表達(dá)周質(zhì)表達(dá), BioLabs公司公司)pGEX系列系列 (GST融合表達(dá)融合表達(dá), Pharmacia公司公司)pBAD系列系列 (Arabinose誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型)pTYB系列系列 (CBD融合融合, 可以自我切割可以自我切割, BioLabs) 基因的融合基因的融合采用采用DNA重組技術(shù)將不同基因或基因片段融合，經(jīng)合適的表達(dá)重組技術(shù)將不同基因或基因片段融合，經(jīng)合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，可獲得由系統(tǒng)表達(dá)后，可獲得由不同功能蛋白拼合不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型在一起而形成的新型多功能蛋白多功

10、能蛋白構(gòu)建融合蛋白的基本原則：構(gòu)建融合蛋白的基本原則：將第一個(gè)蛋白基因的終止密碼子刪將第一個(gè)蛋白基因的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白或多肽基因，即可實(shí)除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白或多肽基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的融合表達(dá)現(xiàn)兩個(gè)基因的融合表達(dá)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系為蛋白質(zhì)的為蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化表達(dá)和純化提供方便提供方便 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)和功能的研究的研究獲得蛋白質(zhì)的途徑（通過獲得蛋白質(zhì)的途徑（通過體外切割體外切割）與其它不同功能的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生與其它不同功能的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生新的多功能蛋白新的多功能蛋白與與報(bào)告分子報(bào)告分子共表達(dá)，研究蛋白定位及轉(zhuǎn)基因表達(dá)共表達(dá)

11、，研究蛋白定位及轉(zhuǎn)基因表達(dá)防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解降解 改變改變胞內(nèi)溶解性胞內(nèi)溶解性：硫：硫氧還蛋白，氧還蛋白，GST蛋白表達(dá)的蛋白表達(dá)的空間定位空間定位：信號(hào)肽：信號(hào)肽利用融合技術(shù)表達(dá)外源基因原因：利用融合技術(shù)表達(dá)外源基因原因：基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因融合的策略基因融合的策略 基因融合的方式基因融合的方式 信號(hào)肽信號(hào)肽+ +基因基因 信號(hào)肽信號(hào)肽+ +基因基因+ +插入序列插入序列基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系l 融合蛋白接頭設(shè)計(jì)和選擇融合蛋白接頭設(shè)計(jì)和選擇 將將2個(gè)或多個(gè)不同的模塊連接成為一個(gè)大分子，其中起連接個(gè)或多個(gè)不同的模塊連接成為一個(gè)大分子，其中

12、起連接作用的氨基酸鏈即為作用的氨基酸鏈即為linker，Linker的長度一般是在的長度一般是在10-15個(gè)個(gè)氨基酸之間氨基酸之間若使用若使用的的linker較長較長，由于在重組蛋白的生產(chǎn)過程中對(duì)，由于在重組蛋白的生產(chǎn)過程中對(duì)蛋白裂蛋白裂解比較敏感解比較敏感，可能會(huì)導(dǎo)致融合蛋白產(chǎn)量的降低；同時(shí)又涉及，可能會(huì)導(dǎo)致融合蛋白產(chǎn)量的降低；同時(shí)又涉及免免疫原性疫原性的問題，因接頭序列本身就是新的抗原的問題，因接頭序列本身就是新的抗原應(yīng)用應(yīng)用較短較短的的linker雖可雖可克服蛋白酶分解克服蛋白酶分解的問題，但的問題，但可能使兩個(gè)可能使兩個(gè)大分子相距最近，影響兩種蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊大分子相距最近，影響兩種

13、蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊，從而相互干，從而相互干擾，導(dǎo)致蛋白功能喪失，擾，導(dǎo)致蛋白功能喪失，linker序列的組成對(duì)融合蛋白的折疊序列的組成對(duì)融合蛋白的折疊有重大影響有重大影響另外，在設(shè)計(jì)另外，在設(shè)計(jì)linker序列時(shí)，序列時(shí)，盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，linker中常見的氨基酸是非極性的疏水氨基酸（中常見的氨基酸是非極性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）等）基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化方便融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化方便地進(jìn)行。一般來說，將目標(biāo)蛋白編碼基因與一段被稱為地進(jìn)行。一般來說，將目標(biāo)蛋白編碼基因與一段被稱為“親和尾親和

14、尾”（Affinity tail）的編碼序列相連接，這段）的編碼序列相連接，這段“親和尾親和尾”可以與親和層析柱上的配基特異地結(jié)合，可以與親和層析柱上的配基特異地結(jié)合，使使目標(biāo)蛋白可以用親和層析的方法快速而簡便地純化出來目標(biāo)蛋白可以用親和層析的方法快速而簡便地純化出來融合蛋白標(biāo)簽融合蛋白標(biāo)簽基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 蛋白蛋白純化純化 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的檢測(cè)檢測(cè)和和定向固定定向固定 提高重組蛋白質(zhì)的提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量產(chǎn)量 增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性及穩(wěn)定性可溶性及穩(wěn)定性 融合標(biāo)簽的功能融合標(biāo)簽的功能基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系Protein A GST（glutathione S-tra

15、nsferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *二硫鍵形成二硫鍵形成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫鍵的形成二硫鍵的形成SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ke

16、tosteroid isomerase) 基本上全部沉淀基本上全部沉淀各種融合蛋白表達(dá)載體各種融合蛋白表達(dá)載體幫助可溶化幫助分泌到周質(zhì)可用親和層析純化基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系各種用于抗體識(shí)別的標(biāo)記各種用于抗體識(shí)別的標(biāo)記His-tag (6-8 Histidine)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)融合蛋白報(bào)告分子融合蛋白

17、報(bào)告分子 將易于檢測(cè)的蛋白質(zhì)與目的分子融合表達(dá)，可顯示目標(biāo)分將易于檢測(cè)的蛋白質(zhì)與目的分子融合表達(dá)，可顯示目標(biāo)分子的存在和定位，廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及子的存在和定位，廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選其表達(dá)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系作為報(bào)告分子必須具備以下特點(diǎn)： 報(bào)告分子應(yīng)不存在于宿主中且易于和內(nèi)源性基因相區(qū)別； 應(yīng)該有一個(gè)簡單、快速、靈敏及經(jīng)濟(jì)的分析方法來檢測(cè)報(bào)告分子； 報(bào)告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形范圍，以便于分析啟動(dòng)子活性的幅度變化； 報(bào)告基因的表達(dá)必須不改變受體細(xì)胞或生物的生理活動(dòng)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系融合蛋白

18、的專一性切割融合蛋白的專一性切割DTT: Cys 溴化氰溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGP Genenase I TM: PGAAHYTEV protease: ENLYFQG 1. 1. 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟，因此要選擇轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟，因此要選擇強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子及相關(guān)的調(diào)控序列強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子及相關(guān)的調(diào)控序列外源基因有效表達(dá)影響因素外源基因有效表達(dá)

19、影響因素基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子： 1. 表達(dá)效率在表達(dá)效率在10-30%； 2. 由啟動(dòng)子控制的本底轉(zhuǎn)錄很低；由啟動(dòng)子控制的本底轉(zhuǎn)錄很低； 3. 啟動(dòng)子能夠由一些簡單及經(jīng)濟(jì)合算的方式誘導(dǎo)啟動(dòng)啟動(dòng)子能夠由一些簡單及經(jīng)濟(jì)合算的方式誘導(dǎo)啟動(dòng)如，如，T7啟動(dòng)子啟動(dòng)子 mRNA的穩(wěn)定性：細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性：細(xì)胞內(nèi)mRNA的濃度由的濃度由mRNA轉(zhuǎn)錄的速率轉(zhuǎn)錄的速率和和mRNA降解之差來決定；降解之差來決定； 翻譯的起始：無效的翻譯起始多半是蛋白質(zhì)低表達(dá)的最常見翻譯的起始：無效的翻譯起始多半是蛋白質(zhì)低表達(dá)的最常見問題；問題； 翻譯的延伸：遺傳密碼的簡并；翻譯的延伸：遺傳密碼的簡并； 氨基酸的

20、錯(cuò)誤攙入；氨基酸的錯(cuò)誤攙入； 翻譯的終止翻譯的終止2. 有效翻譯與基因的高效表達(dá)有效翻譯與基因的高效表達(dá)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系每種生物對(duì)簡并密碼子的使用頻率的差異；每種生物對(duì)簡并密碼子的使用頻率的差異；同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的tRNA含量相關(guān)；含量相關(guān)；某些密碼子對(duì)所有不同基因都是最常用的，如某些密碼子對(duì)所有不同基因都是最常用的，如CCG是脯氨是脯氨酸最常用密碼子；酸最常用密碼子；富含宿主不常用密碼子的外源基因有可能得不到有效表達(dá)富含宿主不常用密碼子的外源基因有可能得不到有效表達(dá)3. 密碼子偏好性密碼子偏好性基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系大腸桿菌細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使表達(dá)

21、的外源蛋白可能定位在大腸桿菌細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使表達(dá)的外源蛋白可能定位在胞胞內(nèi)、胞質(zhì)膜、胞周質(zhì)、外膜、胞外培養(yǎng)基內(nèi)、胞質(zhì)膜、胞周質(zhì)、外膜、胞外培養(yǎng)基（1）胞內(nèi)表達(dá)：）胞內(nèi)表達(dá)：小分子蛋白小分子蛋白易表達(dá)易表達(dá)、易水解易水解。大分子蛋白，。大分子蛋白，胞內(nèi)表達(dá)胞內(nèi)表達(dá)易形成包涵體易形成包涵體4. 外源蛋白的表達(dá)定位外源蛋白的表達(dá)定位 基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系（2）外周質(zhì)表達(dá)：）外周質(zhì)表達(dá)：外源基因與信號(hào)肽融合，外周質(zhì)的氧化環(huán)外源基因與信號(hào)肽融合，外周質(zhì)的氧化環(huán)境境有利于蛋白質(zhì)正確折疊有利于蛋白質(zhì)正確折疊， 外周質(zhì)中蛋白質(zhì)外周質(zhì)中蛋白質(zhì)降解少降解少，外周質(zhì)中，外周質(zhì)中總蛋白少總蛋白少（4%），目的蛋白

22、容易純化），目的蛋白容易純化（3）細(xì)胞外分泌：）細(xì)胞外分泌：利用已有的利用已有的“真正真正”的分泌蛋白所采用的的分泌蛋白所采用的途徑；利用途徑；利用信號(hào)肽信號(hào)肽序列、融合伴侶和具有穿透能力的因子。分序列、融合伴侶和具有穿透能力的因子。分泌至培養(yǎng)基的蛋白泌至培養(yǎng)基的蛋白容易純化容易純化，減少內(nèi)源蛋白酶降解減少內(nèi)源蛋白酶降解基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系（4）胞質(zhì)膜定位：）胞質(zhì)膜定位：常用于含有常用于含有跨膜區(qū)膜蛋白跨膜區(qū)膜蛋白的研究，如的研究，如G蛋蛋白偶聯(lián)受體，具有重要的生理和藥理學(xué)作用白偶聯(lián)受體，具有重要的生理和藥理學(xué)作用（5）菌體表面定位：）菌體表面定位：大腸桿菌表面蛋白與外源肽或蛋白融合，大腸

23、桿菌表面蛋白與外源肽或蛋白融合，表達(dá)外源肽或蛋白的菌株可用于構(gòu)建活菌苗、篩選文庫，研究表達(dá)外源肽或蛋白的菌株可用于構(gòu)建活菌苗、篩選文庫，研究蛋白與配體相互作用蛋白與配體相互作用、細(xì)胞間粘附等、細(xì)胞間粘附等 菌株內(nèi)蛋白酶太多會(huì)導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，選用菌株內(nèi)蛋白酶太多會(huì)導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，選用蛋白酶缺失的宿主菌蛋白酶缺失的宿主菌5. 宿主菌選擇對(duì)表達(dá)的影響宿主菌選擇對(duì)表達(dá)的影響基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 增加細(xì)胞培養(yǎng)密度，如分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)；增加細(xì)胞培養(yǎng)密度，如分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)； 改變培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件改變培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件6. 宿主菌培養(yǎng)條件控制對(duì)表達(dá)效率的影響宿主菌培

24、養(yǎng)條件控制對(duì)表達(dá)效率的影響真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控 真核基因特點(diǎn)：真核基因特點(diǎn)： 啟動(dòng)子不能被原核識(shí)別；啟動(dòng)子不能被原核識(shí)別； mRNA上沒有上沒有SD序列；序列； 基因內(nèi)部含內(nèi)含子；基因內(nèi)部含內(nèi)含子； 產(chǎn)物往往需要翻譯后加工；產(chǎn)物往往需要翻譯后加工； 易被原核酶系降解易被原核酶系降解因此，在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)應(yīng)注意三個(gè)問題：因此，在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)應(yīng)注意三個(gè)問題： 基因編碼區(qū)必須連續(xù)；基因編碼區(qū)必須連續(xù)； 必須置于原核啟動(dòng)子、終止子和必須置于原核啟動(dòng)子、終止子和SD序列的控制之下；序列的控制之下； 產(chǎn)生的產(chǎn)生的mRNA必須相對(duì)穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊

25、必須相對(duì)穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系Yeast芽殖芽殖是酵母最常見的無性繁殖方式，即從細(xì)胞壁上產(chǎn)生芽體，形成子是酵母最常見的無性繁殖方式，即從細(xì)胞壁上產(chǎn)生芽體，形成子細(xì)胞。細(xì)胞。釀酒酵母釀酒酵母于于1996年完成基因組測(cè)序年完成基因組測(cè)序芽殖酵母和裂殖酵母聽起來是近親，但實(shí)際上它們?cè)诩s億到億年芽殖酵母和裂殖酵母聽起來是近親，但實(shí)際上它們?cè)诩s億到億年前就分家了，走上不同進(jìn)化道路。前就分家了，走上不同進(jìn)化道路。2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者、英國帝國癌癥研究基金會(huì)的保羅者、英國帝國癌癥研究基金會(huì)的保羅納斯領(lǐng)導(dǎo)的小組完成納斯領(lǐng)導(dǎo)的小組完成裂

26、殖酵母裂殖酵母基因組測(cè)序工作，發(fā)表在基因組測(cè)序工作，發(fā)表在Nature雜志上雜志上 裂殖酵母的基因組含有裂殖酵母的基因組含有3條較大的染色體，約條較大的染色體，約1380萬個(gè)堿基對(duì)。分析萬個(gè)堿基對(duì)。分析表明，裂殖酵母只有表明，裂殖酵母只有4824個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因， 是真核生物中最少的，比芽殖酵母少是真核生物中最少的，比芽殖酵母少1000個(gè)左右，個(gè)左右， 甚至比一些細(xì)菌還少甚至比一些細(xì)菌還少基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 酵母表達(dá)系統(tǒng)既具酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核細(xì)胞的增殖快、有原核細(xì)胞的增殖快、操作簡單、成本低等優(yōu)操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，又可以象其他真核點(diǎn)，又可以象其他真核細(xì)胞一樣

27、完成對(duì)蛋白質(zhì)細(xì)胞一樣完成對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯后的修飾轉(zhuǎn)錄和翻譯后的修飾目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系5AOX1 啟動(dòng)子片段含有啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在甲醇誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)； -因子信號(hào)肽序列為約因子信號(hào)肽序列為約89個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；的純化； 多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；供位點(diǎn)； TT序列提供有效的轉(zhuǎn)

28、錄終止和序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號(hào)；修飾信號(hào)； HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志； 3 AOX1 基因片段能夠與基因組基因片段能夠與基因組AOX1基因同源重基因同源重組；組； 抗抗Amp 基因和基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在體在E.coli中篩選和復(fù)制中篩選和復(fù)制畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)pPIC9載體的信號(hào)肽序列和多克隆位點(diǎn)載體的信號(hào)肽序列和多克隆位點(diǎn)表達(dá)菌株表達(dá)菌株釀酒酵母釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae畢赤酵母畢赤酵母Pichia Pastori

29、sKoichi Ogata等人于1969年首次發(fā)現(xiàn)了某些酵母可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長，此后，用甲醇利用型酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白作為動(dòng)物飼料的潛力就引起了廣泛關(guān)注； 1987年，Cregg等人首次報(bào)道了用酵母表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HbsAg )，隨后Philip Petroleum公司與Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就開始了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的合作開發(fā)； 1993年，Philip Petroleum公司將畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的專利賣給Research Corporation Technologies公司，并委托In

30、vitrogen公司進(jìn)行有關(guān)產(chǎn)品銷售基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系1、畢赤酵母是、畢赤酵母是需氧酵母菌需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此，在有氧條件下能高密度生長，因此有利于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá)有利于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá)2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易不易丟失丟失；且外源基因能以；且外源基因能以高拷貝高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達(dá)菌株能夠篩選到高表達(dá)菌株3、畢赤酵母、畢赤酵母甲醇氧化酶甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)

31、基因的基因的強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá)特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá)畢赤酵母與其它表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)畢赤酵母與其它表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分泌性外源蛋白分泌性外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離5、畢赤酵母對(duì)外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)行、畢赤酵母對(duì)外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)行N一乙酰糖基化修飾一乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為高的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為甘露糖型，糖鏈平均為814個(gè)甘露糖基，更接近于高等生物，個(gè)甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含且聚糖末端不含 1，3連接甘露糖殘基連接甘露糖

32、殘基(有強(qiáng)的免疫原性有強(qiáng)的免疫原性)，因而，因而適用于臨床應(yīng)用適用于臨床應(yīng)用6、使用方便、簡單，而且成本較低、使用方便、簡單，而且成本較低基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 畢赤酵母畢赤酵母Pichia Pastoris常見菌株常見菌株 GS115 KM71 PMAD11 PMAD16基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系甲醇甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危險(xiǎn)性；易燃易爆有毒，存在一定的危險(xiǎn)性； 篩選高產(chǎn)菌株篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價(jià)格比較昂貴；需用的藥物價(jià)格比較昂貴； 培養(yǎng)基和培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不成熟培養(yǎng)條件不成熟； 因此，開始研制不以甲醇為唯一誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子：因此，開始研制不以甲醇為唯一誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子：GAP、FLD1

33、、DAS、AOX2等等畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是能優(yōu)點(diǎn)是能較高水平表達(dá)不同動(dòng)物來源基因較高水平表達(dá)不同動(dòng)物來源基因，能夠有效，能夠有效進(jìn)行進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后加工蛋白質(zhì)翻譯后加工 主要缺點(diǎn)是主要缺點(diǎn)是不能連續(xù)合成重組蛋白不能連續(xù)合成重組蛋白，因?yàn)橹亟M病毒感，因?yàn)橹亟M病毒感染昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲染昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲4-54-5天后，細(xì)胞就裂解，幼蟲即死亡天后，細(xì)胞就裂解，幼蟲即死亡基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系桿狀病毒桿狀病毒只來源于無脊椎動(dòng)物，雖然已發(fā)現(xiàn)只來源于無脊椎動(dòng)物，雖然已發(fā)現(xiàn)600多種桿狀病毒，多種桿狀病毒，但進(jìn)行分子生物學(xué)研

34、究的不到但進(jìn)行分子生物學(xué)研究的不到20種種桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為分子，大小為80160 kb，其基因組，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病核型多角體病毒毒?？扇菁{較大片段的外源?？扇菁{較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體的理想載體基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系昆蟲昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可為高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物形成提供良好的環(huán)境

35、，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白能進(jìn)行翻譯后加工修飾：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)蛋白質(zhì)完整的翻譯后加工能力昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系表達(dá)水平高：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50能容納大分子插入片段：桿狀病毒毒?？梢詳U(kuò)大，并能包裝大的基因片段，但目前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時(shí)感染細(xì)胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時(shí)克隆兩個(gè)外源基因，

36、表達(dá)產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無感染性，因此在表達(dá)癌基因或有潛在毒性的蛋白時(shí)可能優(yōu)于其它系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞 生產(chǎn)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)最好的場(chǎng)所哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)最好的場(chǎng)所，其表達(dá)真核基因比其他幾種，其表達(dá)真核基因比其他幾種表達(dá)系統(tǒng)更優(yōu)越，能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行各種類型的加工和修飾，還能表表達(dá)系統(tǒng)更優(yōu)越，能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行各種類型的加工和修飾，還能表達(dá)有功能的膜蛋白及分泌性蛋白達(dá)有功能的膜蛋白及分泌性蛋白 其缺點(diǎn)是組織細(xì)胞培養(yǎng)的其缺點(diǎn)是組織細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)要求高技術(shù)要求高，培養(yǎng)和篩選細(xì)胞株的周，培養(yǎng)和篩選細(xì)胞株的周期長，期長，成本較高成本較高基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系已有

37、許多重要蛋白及糖蛋白利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和大量制備、生產(chǎn) 如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素 根據(jù)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為根據(jù)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為病毒載病毒載體體與與質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，在幾天內(nèi)使外源基因膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中整合到病毒載體中表達(dá)載體的類型表達(dá)載體的類型基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系質(zhì)粒載體則是借助于物理

38、或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合整合型型和和附加體型附加體型載體兩類載體兩類整合型載體整合型載體無復(fù)制能力，需無復(fù)制能力，需整合于宿主細(xì)胞染色體整合于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定內(nèi)方能穩(wěn)定存在。而存在。而附加體型載體附加體型載體則是在細(xì)胞內(nèi)以則是在細(xì)胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制染色體外可自我復(fù)制的的附加體形式存在附加體形式存在整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，其外源基因的表達(dá)受插整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，其外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn)的影響，

39、同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長特性。相比入位點(diǎn)的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的問題，但載體之下，附加體型載體不存在這方面的問題，但載體DNA在復(fù)制在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排中容易發(fā)生突變或重排 基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 常用的表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株有中國倉鼠卵巢常用的表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株有中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)細(xì)胞、小倉鼠腎胞、小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞和小鼠胸腺瘤細(xì)胞和小鼠骨髓瘤骨髓瘤SP2/0細(xì)胞等細(xì)胞等 不同宿主細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和蛋白糖基化類不同宿主細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和蛋白糖基化類型不同，需根據(jù)

40、要表達(dá)的目的蛋白選擇最佳的宿主細(xì)胞型不同，需根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白選擇最佳的宿主細(xì)胞2、宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)瞬時(shí)、穩(wěn)定穩(wěn)定和和誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是指表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是指表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后不經(jīng)選擇培養(yǎng)不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載，載體體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫，具隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫，具有簡捷、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)有簡捷、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)3、表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系體外翻譯系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)體外

41、翻譯系統(tǒng)又稱體外翻譯系統(tǒng)又稱無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，是一種相對(duì)胞內(nèi)表，是一種相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)而言的開放表達(dá)體系。翻譯系統(tǒng)內(nèi)的達(dá)系統(tǒng)而言的開放表達(dá)體系。翻譯系統(tǒng)內(nèi)的組分組分和和翻譯條件翻譯條件可可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖円愿鶕?jù)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖凅w外翻譯系統(tǒng)中翻譯特定基因較胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)具有許多體外翻譯系統(tǒng)中翻譯特定基因較胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)，如內(nèi)源性如內(nèi)源性mRNA干擾很小，可以同時(shí)加入多種基因模板研究多干擾很小，可以同時(shí)加入多種基因模板研究多種蛋白質(zhì)的相互作用；體外翻譯系統(tǒng)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行特異種蛋白質(zhì)的相互作用；體外翻譯系統(tǒng)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行特異性標(biāo)記，便于在反應(yīng)混臺(tái)

42、物中檢測(cè)性標(biāo)記，便于在反應(yīng)混臺(tái)物中檢測(cè)目前，體外翻譯系統(tǒng)有目前，體外翻譯系統(tǒng)有兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)、麥胚提取物系統(tǒng)麥胚提取物系統(tǒng)、E.coli S30系統(tǒng)系統(tǒng)3種種基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng) 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞用新西蘭大白兔制備新西蘭大白兔制備，通過純化除去兔網(wǎng)織，通過純化除去兔網(wǎng)織紅細(xì)胞以外的污染細(xì)胞。紅細(xì)胞以外的污染細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解后，提取物用微球菌后，提取物用微球菌核酸酶核酸酶破壞內(nèi)源破壞內(nèi)源mRNA，最大限度降低翻譯背景。裂解物包含，最大限度降低翻譯背景。裂解物包含蛋白質(zhì)合成所必須的細(xì)胞內(nèi)組分蛋白質(zhì)合成所必須的細(xì)胞內(nèi)組

43、分(tRNA，核糖體，氨基酸，起，核糖體，氨基酸，起始、延伸、終止因子始、延伸、終止因子) 為了使系統(tǒng)更適于為了使系統(tǒng)更適于mRNA的翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中還添加的翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中還添加了了磷酸肌酸磷酸肌酸和和磷酸肌酸激酶磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)，以及的能量生成系統(tǒng)，以及氯化高鐵血氯化高鐵血紅素紅素防止翻譯起始的抑制，此外還添加了防止翻譯起始的抑制，此外還添加了tRNAs混合物用于擴(kuò)混合物用于擴(kuò)大大mRNA翻譯的范圍，以及乙酸鉀和乙酸鎂等翻譯的范圍，以及乙酸鉀和乙酸鎂等基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 麥胚提取物的制備麥胚提取物的制備 通過碾磨通過碾磨麥胚麥胚，離心去除細(xì)胞殘?jiān)锨?，離心去除細(xì)胞

44、殘?jiān)锨逡和ㄟ^層析將抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素等分離除去。提液通過層析將抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素等分離除去。提取物用微球菌核酸酶處理取物用微球菌核酸酶處理破壞內(nèi)源破壞內(nèi)源mRNA，最大限度降低翻譯背，最大限度降低翻譯背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)和增景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng)和增加鏈延伸效率的亞精胺，以及一定量的乙酸鎂加鏈延伸效率的亞精胺，以及一定量的乙酸鎂 麥胚提取物系統(tǒng)可穩(wěn)定表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯麥胚提取物系統(tǒng)可穩(wěn)定表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯受到抑制的受到抑制的DNA，對(duì)于，對(duì)于表達(dá)真核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)真核轉(zhuǎn)錄因子是

45、一個(gè)很好的選擇系統(tǒng)是一個(gè)很好的選擇系統(tǒng)麥胚提取物系統(tǒng)麥胚提取物系統(tǒng)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系 E.Coli S30提取物是由提取物是由OmpT內(nèi)切蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷蛋白酶缺陷的的E.Coli B菌株制備，所以在菌株制備，所以在S30系統(tǒng)中表達(dá)基因可以系統(tǒng)中表達(dá)基因可以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，尤其適，尤其適用于在體外表達(dá)時(shí)易被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)用于在體外表達(dá)時(shí)易被蛋白酶降解的蛋白質(zhì) S30體外翻譯系統(tǒng)也適合表達(dá)由于宿主編碼的抑制酶作用而體外翻譯系統(tǒng)也適合表達(dá)由于宿主編碼的抑制酶作用而表達(dá)水表達(dá)水平低平低的蛋白質(zhì)，使其能高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)，使其能高水平表達(dá) S30系統(tǒng)還可

46、用于系統(tǒng)還可用于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究。此外，的研究。此外，S30體外翻譯系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)還可還可用于合成少量用于合成少量標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)，作為示蹤物質(zhì)以及在蛋白質(zhì)中摻入非天，作為示蹤物質(zhì)以及在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能然氨基酸用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能原核體外翻譯系統(tǒng)原核體外翻譯系統(tǒng)基因表達(dá)體系基因表達(dá)體系轉(zhuǎn)基因微生物生物反應(yīng)器：由于微生物結(jié)構(gòu)簡單、繁殖迅速、容易培養(yǎng)而成為轉(zhuǎn)基因?qū)ο?，主要采用遺傳背景清楚的大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化獲得所需要的目的產(chǎn)物，生產(chǎn)的藥物屬于第一代基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生物反應(yīng)器：將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)

47、胞，表達(dá)制備相關(guān)產(chǎn)品。由于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)限制，目前利用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品有一定難度轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器：將外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞，表達(dá)制備相關(guān)產(chǎn)品。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白類藥物、疫苗、細(xì)胞因子等產(chǎn)品已經(jīng)成為生物制藥的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生物反應(yīng)器：將外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)植物個(gè)體，表達(dá)制備相關(guān)產(chǎn)品。轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)不僅限于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而且還涉及植物組織培養(yǎng)、動(dòng)物胚胎工程等技術(shù)，因此過程復(fù)雜生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器的特點(diǎn)比較生物反應(yīng)器的特點(diǎn)比較蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化 （1）材料來源）材料來源 來源方便、含量豐富、容易提取、來源方便、含量豐富

48、、容易提取、 防止變性防止變性 設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量（2）分離的一般原則）分離的一般原則 利用分子大小，如分子篩凝膠過濾；利用分子大小，如分子篩凝膠過濾； 利用電離性質(zhì)，如電泳；利用電離性質(zhì)，如電泳； 利用溶解性，如等電點(diǎn)；利用溶解性，如等電點(diǎn)； 利用生物學(xué)特性，如親和層析等利用生物學(xué)特性，如親和層析等蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化（3）純化鑒定）純化鑒定 氨基酸組成分析、末段分析、氨基酸組成分析、末段分析、 色譜分析、電泳分析、等電聚色譜分析、電泳分析、等電聚 焦分析、免疫化學(xué)分析焦分析、免疫化學(xué)分析

49、（4）序列測(cè)定）序列測(cè)定 確定肽鏈的氨基酸組成、末端和確定肽鏈的氨基酸組成、末端和S-S鍵數(shù)目鍵數(shù)目 專一地酶解大的多肽成為較小的片段專一地酶解大的多肽成為較小的片段 蛋白質(zhì)序列儀蛋白質(zhì)序列儀 應(yīng)用肽段序列重疊法確定氨基酸的排序應(yīng)用肽段序列重疊法確定氨基酸的排序 確定確定S-S鍵的位置鍵的位置一般程序：一般程序： 1、從組織細(xì)胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用低溫冰、從組織細(xì)胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用低溫冰 凍、化學(xué)試劑及溶菌酶破壁、破膜，再用溶劑提取凍、化學(xué)試劑及溶菌酶破壁、破膜，再用溶劑提取 2、分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)、分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì) a 透析與超濾

50、 b 等電點(diǎn)沉淀 c 鹽析和有機(jī)溶劑分級(jí)分離 d 離子交換層析 e 凝膠過濾層析 f 親和層析 3、結(jié)晶提純、結(jié)晶提純 a 多次結(jié)晶，除雜蛋白和變性蛋白 b 結(jié)晶的最佳條件：略過飽和溶液 各步驟要求各步驟要求條件溫和條件溫和，并加少量殺菌劑，并加少量殺菌劑 防止蛋白質(zhì)變性防止蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)酶蛋白質(zhì)酶作用及作用及微生物污染微生物污染蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化( (一一) ) 根據(jù)分子大小不同的分離方法根據(jù)分子大小不同的分離方法 1. 透析和超過濾透析和超過濾 透析：根據(jù)的是透析：根據(jù)的是蛋白質(zhì)不能通過半透膜蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，而水和無機(jī)的性質(zhì)，而水和無機(jī) 鹽等小分子自由通過，此

51、方法只能將蛋白質(zhì)和小分子鹽等小分子自由通過，此方法只能將蛋白質(zhì)和小分子 物質(zhì)分開，不能將不同蛋白質(zhì)分開物質(zhì)分開，不能將不同蛋白質(zhì)分開 超過濾：超過濾：是利用外加壓或離心使水和其他成是利用外加壓或離心使水和其他成分通過半透膜分通過半透膜， 蛋白質(zhì)留在膜上蛋白質(zhì)留在膜上，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化透析與超過濾簡易裝置透析與超過濾簡易裝置透析袋待分離混合物蒸餾水 2. 密度梯度離心密度梯度離心 a. 蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定 于它的大小也取決于它的于它的大小也取決于它的 密度密度 b. 顆粒沉降到顆粒沉降到與自身密度與自身密

52、度 相等相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即的介質(zhì)梯度時(shí)，即 停止不前停止不前 c. 在離心力的作用下，各種在離心力的作用下，各種 蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì)蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì) 中形成中形成獨(dú)立區(qū)帶獨(dú)立區(qū)帶蔗糖密度梯度離心蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化3. 凝膠過濾凝膠過濾 a. 又稱又稱分子篩分子篩層析，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效層析，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效 的方法之一的方法之一 b. 常用葡聚糖凝膠常用葡聚糖凝膠(商品名為商品名為Sephadex)和瓊脂糖凝膠和瓊脂糖凝膠(商品名商品名 為為Sepharose) c. 大分子先洗脫下來，小分子后洗下來大分子先洗脫下來，小分子后洗下來蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化凝膠過濾法凝膠過濾法( (二二) ) 利用溶解度差別的分離方法利用溶解度差別的分離方法 1. 等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 利用各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小這一性質(zhì)，可以利用各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小這一性質(zhì)，可以 通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值值 ，將不同的蛋白質(zhì)分開，將不同的蛋白質(zhì)分開蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化2. 鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析